Name: 組合せ miRNA 細胞周期の調節、血管新生治療の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: 学ぶ miR-143およびmiR-506の組み合わせ治療による肺がん細胞の細胞周期停止と血管新生制御メカニズム。RT-qPCR、フローサイトメトリー、マイクロアレイを用いた包括的解析手法を解説します。

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<ol><li>Schafer, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+cycle%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Veternary+Pathology%22%5BJournal%5D)">The cell cycle: a review.</a> Veternary Pathology. 35 (6), 461-478 (1998).</li>
<li>Barnum, K. J., O'Connell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+regulation+by+checkpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell cycle regulation by checkpoints.</a> Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).</li>
<li>Malumbres, M., Barbacid, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle%2C+CDKs+and+cancer%3A+a+changing+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cell cycle, CDKs and cancer: a changing paradigm.</a> Nature Reviews Cancer. 9 (3), 153-166 (2009).</li>
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<li>Brown, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDK1+structures+reveal+conserved+and+unique+features+of+the+essential+cell+cycle+CDK%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">CDK1 structures reveal conserved and unique features of the essential cell cycle CDK.</a> Nature Communications. 6, 6769(2015).</li>
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<li>Shah, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDA+Approval%3A+Ribociclib+for+the+Treatment+of+Postmenopausal+Women+with+Hormone+Receptor-Positive%2C+HER2-Negative+Advanced+or+Metastatic+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">FDA Approval: Ribociclib for the Treatment of Postmenopausal Women with Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Advanced or Metastatic Breast Cancer.</a> Clinical Cancer Research. , (2018).</li>
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<li>Walker, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDA+Approval+of+Palbociclib+in+Combination+with+Fulvestrant+for+the+Treatment+of+Hormone+Receptor-Positive%2C+HER2-Negative+Metastatic+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">FDA Approval of Palbociclib in Combination with Fulvestrant for the Treatment of Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Metastatic Breast Cancer.</a> Clinical Cancer Research. 22 (20), 4968-4972 (2016).</li>
<li>Hossian, A., Sajib, M. S., Tullar, P. E., Mikelis, C. M., Mattheolabakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipronged+activity+of+combinatorial+miR-143+and+miR-506+inhibits+Lung+Cancer+cell+cycle+progression+and+angiogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Repository%22%5BJournal%5D)">Multipronged activity of combinatorial miR-143 and miR-506 inhibits Lung Cancer cell cycle progression and angiogenesis in vitro.</a> Science Repository. 8 (1), 10495(2018).</li>
<li>Inamura, K., Ishikawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+In+Lung+Cancer%3A+Novel+Biomarkers+and+Potential+Tools+for+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">MicroRNA In Lung Cancer: Novel Biomarkers and Potential Tools for Treatment.</a> Journal of Clinical Medicine. 5 (3), (2016).</li>
<li>Mizuno, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+expression+signature+of+small+cell+lung+cancer%3A+tumor+suppressors+of+miR-27a-5p+and+miR-34b-3p+and+their+targeted+oncogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">The microRNA expression signature of small cell lung cancer: tumor suppressors of miR-27a-5p and miR-34b-3p and their targeted oncogenes.</a> Journal of Human Genetics. 62 (7), 671-678 (2017).</li>
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<li>Robinson, M. D., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scaling+normalization+method+for+differential+expression+analysis+of+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data.</a> Genome Biology. 11 (3), R25(2010).</li>
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<li>Kong, D. H., Kim, M. R., Jang, J. H., Na, H. J., Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+of+Anti-Angiogenic+Targets+for+Monoclonal+Antibody+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">A Review of Anti-Angiogenic Targets for Monoclonal Antibody Cancer Therapy.</a> International Journal of Molecular Science. 18 (8), (2017).</li>
<li>Wong, P. P., Bodrug, N., Hodivala-Dilke, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+Novel+Methods+for+Modulating+Tumor+Blood+Vessels+in+Cancer+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Exploring Novel Methods for Modulating Tumor Blood Vessels in Cancer Treatment.</a> Current Biology. 26 (21), R1161-R1166 (2016).</li>
<li>Evan, G. I., Brown, L., Whyte, M., Harrington, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+and+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis and the cell cycle.</a> Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 825-834 (1995).</li>
<li>Haab, B. B., Dunham, M. J., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+microarrays+for+highly+parallel+detection+and+quantitation+of+specific+proteins+and+antibodies+in+complex+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solutions.</a> Genome Biology. 2 (2), RESEARCH0004(2001).</li>
<li>Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Currrent+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Overview of protein microarrays.</a> Currrent Protocols in Protein Science. 27, Chapter 27, Unit 27 21(2013).</li>
<li>St-Pierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+sequencing+of+neonatal+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Repository%22%5BJournal%5D)">Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells.</a> Science Repository. 3, 1860(2013).</li>
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著者らは RNA シーケンス データとテキサス大学南西医療センター、マクダーモット センター次世代シーケンシング コアのためのパスウェイ解析に彼の援助のためのルイジアナ州立大学ジョン Caskey を認識したいです。RNA シーケンスとデータ分析を実行します。この研究は、薬学の大学、ルイジアナ大学モンロー立ち上げ資金のため、国立機関の健康 (NIH) 国立研究所の一般的な医療科学助成金 5 P20 GM103424-15、3 P20 GM103424 15S1 をによって支えられました。

Mirna の発現レベルの破綻を認識し、がん治療の標的治療として動作正常組織対病気にかかった。この研究の目的は潜在的に複数の段階の細胞周期の進行を止める Mirna を決定します。ミール 143 とミール 506 がこの組合せ miRNA 治療の活動を理解することを目的と示されたプロトコルや、がん細胞の細胞周期を停止が確認されました。
説明の方法論は、Mirna の機能の包括的な理解を提供します。Mirna を研究の課題は、複数の遺伝子をターゲットし、したがって複数の経路に影響を与える能力に関連付けられています。具体的な目標は、治療前に指定されている場合、説明 qPCR 分析は興味の特定の遺伝子の表現の識別を許します。たとえば、ここでの主な焦点 CDK1 と CDK4/6 と細胞周期の表現であった。
したがって、propidium ヨウ化と流れ cytometry のプロトコルを用いた細胞周期解析は細胞周期の段階に従って細胞数の変化を検出するための信頼性の高い方法です。このメソッドは pi で細胞周期の段階に対応する DNA ...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/video/59460/analysis-combinatorial-mirna-treatments-to-regulate-cell-cycle">Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis</a>.&#160; An author name was updated.
One of the authors&#39; names was corrected from:
George Matthaiolampakis
to:
George Mattheolabakis

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Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis

細胞周期は DNA ・細胞増殖分裂プロセス1の重複を許可する複数の規制イベントの組み合わせです。サイクリン依存性キナーゼ (Cdk) を調節する細胞周期2を推進しています。その中で、分裂 CDK (CDK1) と中間期 Cdk (CDK2、CDK4, CDK6) 細胞周期進行3で極めて重要な役割があります。網膜芽細胞腫タンパク質 (Rb) は、CDK4/CDK6 複雑な細胞周期進行4を許可するによりリン酸化され、CDK1 活性化5正常な細胞分裂に不可欠です。多数の CDK 阻害剤を開発し、がん治療における Cdk をターゲットの可能性を示す最後の数十年間、臨床試験で評価。乳癌の治療のため 3 CDK 阻害剤が承認されている実際には、最近6,7,8、の9,10。したがって、Cdk、とくに CDK1 と CDK4/6 は癌細胞の進行を調節するのには大きな関心と。
Mirna (miRs)、小さい、非コーディングの Rna とすべてのヒトの遺伝子11の約 30% を調節する遺伝子発現の転写後レギュレータ。彼らの活動は、翻訳抑制またはメッセンジャー Rna (Mrna)12の分解に基づいています。以上 5,000 Mirna が同定されているその生物学的意義の説明と単一の miRNA の分子は複数遺伝子11,13を調整できます。もっと重大に、miRNA の表現は様々 な疾患やがん13を含む病気の状態に関連付けられています。実際には、miRNAs 発癌性として特徴づけられているまたは腫瘍抑制、腫瘍の開発そして進行の14,のための15を抑制または促進することができます。罹病組織における Mirna の相対式は、病気の進行を調節することがしたがって、miRNAs の外因性の配信には、治療の可能性があります。
肺癌は、癌関連死の主要な原因よりすべての肺悪性腫瘍の 60% が非小細胞肺がん16,1720% 未満の 5 年生存率は18。ミール-143-3 p とミール-506-3 p の使用は肺がん細胞11で細胞周期をターゲットに最近行った。ミール 143 とミール 506 CDK1 と CDK4/CDK6、相補性は、シーケンス、A549 細胞に対するこれら 2 つ miRs の影響を分析しました。実験の詳細を提示し、本稿で説明。遺伝子発現、細胞周期の進行、およびアポトーシスは、さまざまな実験的デザインと縦長の次のトランスフェクションを用いて評価しました。我々 は特定の遺伝子発現を測定するマイクロ アレイ解析と共にリアルタイム定量 PCR (RT qPCR) を使用し、次世代 RNA シーケンスは遺伝子調節不全11を決定に使用されました。後者の方法は、たくさんの遺伝子は 1 つの実験的解析から解明できる、高い感度と再現性、各遺伝子の転写の相対的な豊かさを識別します。また、miRNA によるアポトーシス分析を行った、ここに記載されています。バイオインフォマティクスは、パスウェイ解析を補った。ここに示すプロトコル、組合せミール 143 の潜在的なミール 506 治療上の分析のために使用されます。
このプロトコルの主な目的は、細胞周期にフォーカスを持つセルの miRNAs の影響を特定します。さまざまなテクニックは紹介前訳語 (qPCR) 詳しく説明して新規の遺伝子発現解析からスパン マイクロ アレイ解析など、タンパク質レベルで遺伝子分析技術。このレポートは、miRNAs と働くことに興味を持って研究に役立つことが期待されます。さらに、細胞周期のフローサイトメトリー解析と細胞のアポトーシスの方法論を提示します。

<table><tbody><tr><td>-80度;C フリーザー</td><td>VWR</td><td>VWR40086A</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>セルトリート サイエンティフィック&nbsp;</td><td>50-607-511</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルマイクロウェルプレート&nbsp;&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-556-008</td><td></td></tr><tr><td>A549 非小細胞肺がん細胞</td><td>ATCC</td><td>ATCC&nbsp;CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>VWR</td><td>0710-25G</td><td></td></tr><tr><td>アジレント 2100 バイオアナライザー</td><td>アジレント テクノロジー</td><td>ズ G2938c</td><td></td></tr><tr><td>アンビオン サイレンサー ネガティブ コントロール No. 1 siRNA</td><td>アンビオン</td><td>AM4611</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌剤溶液 (100x)</td><td>Gibco</td><td>15240-062&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>抗体アレイアッセイキット 2反応</td><td>Full Moon Bio</td><td>KAS02</td><td></td></tr><tr><td>明視野顕微鏡&nbsp;&nbsp;</td><td>マイクロスコプティクス&nbsp;</td><td>IV-900</td><td></td></tr><tr><td>明視野顕微鏡&nbsp;&nbsp;</td><td>New Star Environment LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Cycle Antibody Array, 2 Slides</td><td>Full Moon Bio</td><td>ACC058</td><td></td></tr><tr><td>Cell Logic+ Biosafety Cabinate</td><td>Labconco</td><td>342391100</td><td></td></tr><tr><td>Cellquest Pro</td><td>BD bioscience</td><td>Steps 5.14; 6.13: 細胞周期の段階および分析のための集団分布の計算に使用アポトーシス&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 リアルタイムシステム</td><td>BioRad</td><td>CFX96 光学モジュール</td><td></td></tr><tr><td>Chemidoc タッチイメージングシステム</td><td>BioRad</td><td>Chemidoc タッチイメージングシステム</td><td></td></tr><tr><td>CO2 インキュベーター</td><td>Thermo Scientific</td><td>HERAcell 150i</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td><td>Trevigen</td><td>3433-010-01</td><td></td></tr><tr><td>デジタルカメラ</td><td>AmScope&nbsp;</td><td>FMA050</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 4.5 g/L グルコース、ピルビン酸ナトリウムなし、L-グルタミン</td><td>VWR</td><td>VWRL0100-0500</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Zymo Research</td><td>E1010</td><td></td></tr><tr><td>内皮細胞増殖サプリメント (ECGS)</td><td>BD Biosciences</td><td>356006</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Pipette Pick-A-Pack Sets</td><td>Eppendrof</td><td>05-403-152</td><td></td></tr><tr><td>エタノール、絶対 (200 プルーフ)、分子生物学グレード、&nbsp;</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Alfa acar</td><td>L07462</td><td></td></tr><tr><td>F-12K Nutrient Mixture (Kaighn's Mod.) with L-glutamine, Corning</td><td>Corning</td><td>45000-354</td><td></td></tr><tr><td>FACS Calibur Flowcytometer</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum - Premium</td><td>Antlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Fetalウシ血清 (FBS)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>10438026</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド Basix マイクロ遠心チューブ 標準スナップキャップ付き</td><td>フィッシャーブランド Basix</td><td>02-682-002</td><td></td></tr><tr><td>Forma シリーズ II ウォータージャケット CO2 インキュベーター</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン溶液 (5000 U/mL)</td><td>Hospira</td><td>NDC#63739-920-11</td><td></td></tr><tr><td>Horixontal 電気泳動システム</td><td>ベンチトップラボシステム</td><td>BT102</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-143-3p miRNA Mimic</td><td>ABM</td><td>MCH01315</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-506-3p miRNA Mimic</td><td>ABM</td><td>MCH02824</td><td></td></tr><tr><td>Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)</td><td>Thermo Scientific</td><td>PHC9394&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)</td><td>個々のドナー</td><td>IRB# A15-3891</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30256FS</td><td></td></tr><tr><td>Ingenuity Pathway Analysis</td><td>Qiagen</td><td>Results: Used for bioinformatics pathway analysis</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td><td>Invitrogen</td><td>10-977-015</td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン 2000年&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11-668-027</td><td></td></tr><tr><td>ローディング染料 10X</td><td>ward's science+</td><td>470024-814</td><td></td></tr><tr><td>Medium M199 (with Earle&prime;塩、L-グルタミン、重曹)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4530</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡デジタルカメラ</td><td>AmScope&nbsp;</td><td>MU130</td><td></td></tr><tr><td>Modfit LT</td><td>Verity ソフトウェア</td><td>ステップ 5.15: 細胞周期の集団分布</td><td></td>を解析するための代替ソフトウェア</tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop one C</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco by life technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン 10/10</td><td>Antlanta Biologicals</td><td>B21210</td><td></td></tr><tr><td>Power UPsybrの緑のマスターミックス</td><td>応用バイオシステムズ</td><td>A25780</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>MP バイオケミカルズLLC</td><td>IC19545825</td><td></td></tr><tr><td>Proscanarray HTマイクロアレイスキャナー</td><td>パーキンエルマー</td><td>ASCNPHRG.励起レーザー波長は543nmで使用しました。</td><td></td></tr><tr><td>q PCR 光学接着カバー</td><td>Applied Biosystems</td><td>4360954</td><td></td></tr><tr><td>Quick-RNA Kits</td><td>Zymo Research</td><td>R1055</td><td></td></tr><tr><td>リボヌクレアーゼA ウシ膵臓由来</td><td>Sigma</td><td>R6513-50MG</td><td></td></tr><tr><td>ScanArray Express</td><td>PerkinElmer</td><td>ステップ 7.33: マイクロアレイ解析ソフトウェア</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>2314</td><td></td></tr><tr><td>SimpliAmp サーマルサイクラー</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpectraTube 遠心分離管 15ml</td><td>VWR</td><td>470224-998</td><td></td></tr><tr><td>SpectraTube 遠心分離管 50ml</td><td>VWR</td><td>470225-004</td><td></td></tr><tr><td>TBS バッファー、20x 液体</td><td>VWR</td><td>10791-796</td><td></td></tr><tr><td>温度制御&nbsp; 遠心分離</td>機 <td>Thermo Scientific</td><td>ST16R</td><td></td></tr><tr><td>温度制御されたマイクロ遠心分離機</td><td>Eppendrof</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific BioLite 細胞培養処理フラスコ</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-556-009</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI23225</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI89900</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Thermo-Fast 96 ウェルフルスカートプレート</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0800WL</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Verso cDNA 合成キット(100 回分)</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB1453B</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Low Range DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>10597012</td><td></td></tr><tr><td>VWR 標準固体ドアラボ用冷蔵庫</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

組合せ mirna 細胞周期の調節、血管新生治療の解析

Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis

肺がん (LC) は、世界中の癌関連死亡の主要な原因です。他の癌細胞と同様に、液晶セルの基本的な特徴は、無秩序な増殖と細胞分裂です。細胞周期の進行の停止によって増殖抑制は、LC を含むがん治療の有望なアプローチをする示されています。
miRNA 治療重要な転写後遺伝子調節因子として浮上しているし、ますますがん治療で使用するために検討されています。近作では、ミール 143 とミール-506、細胞周期の進行を調節する 2 つの Mirna を利用しました。A549 非小細胞肺癌 (NSCLC) 細胞をトランスフェクションした、遺伝子発現を解析していた、治療によるアポトーシスの活動を最後に行った。サイクリン依存性キナーゼ (Cdk) のダウンレギュレーションが検出された (すなわち、CDK1、CDK4、CDK6) 細胞周期を G1 ・ S ・ G2/M 相転移で停止し、。経路分析では、潜在的な抗血管新生治療のアプローチを多面的な活動に寄与する活動を示した。ここでは、血管新生の阻害によって細胞周期抑制、アポトーシスの誘導、治療の血管内皮細胞に対する影響についての miRNA の活動を識別するために使用する方法論が説明されます。ここに提示されたメソッドが miRNA 治療と対応するアクティビティに関する今後の研究をサポートすることと、代表的なデータが解析中に他の研究者を導くことが望まれます。

RT qPCR とゲル電気泳動による遺伝子発現解析
Rt-qpcr を用いた差動遺伝子発現解析は、CDK1、CDK4, CDK6 ターゲット遺伝子の重要な低下を示した。CDK1 と CDK4/6 それぞれ G2 と G1/S 遷移のため尽力することが示されました。実行の分析は、個々 miRs と組合せミール活動間の直接比較を許可しました。スクランブル siRNA のプロシージャからの干渉の評価を許可 transfecting エージェントでの使用は、最小限だった遺伝子のダウンレギュレーションを検出しました。データを統計的に 2 尾スチューデントのtを使用して行った-テスト、およびp &lt; 0.05 は、統計的に有意な (図 1) と考えられていた。QPCR、前にプライマー シーケンスが評価されたプライマー ブラストを使用...

miRNA の治療には、癌の進行を調節する重要な可能性があります。ここに示す解析的アプローチ、組合せ miRNA 治療細胞周期と血管新生を阻止の活動を識別するために使用されます。

組合せ miRNA 細胞周期の調節、血管新生治療の解析

Lung cancer (LC) is the leading cause of cancer-related deaths worldwide. Similar to other cancer cells, a fundamental characteristic of LC cells is ...

この方法は、インビトロの肺癌細胞における2つのマイクロRNAの活性を同定するために必要なラボ技術を理解し、実行するのに役立ちます。肺癌は、世界中の癌関連死の主な原因です。ここでは、基本的なラボ手法から、遺伝子発現解析や抗体タンパク質マイクロRNAなどのより複雑なプロトコルに至るまでの手法を紹介し、マイクロRNAの作用の効果を特定するために特に使用します。以下の方法は、2つのマイクロRNA143およびmicroRNA 506が肺癌細胞の細胞周期を調節する際の影響に関する重要な質問に答える助けとなるでしょう。細胞トランスフェクション、RNA抽出、定量的リアルタイムPCR、マイクロRNA解析など、さまざまなラボ手法を紹介します。私たちのプレゼンテーションがこれらの分析を正常に完了することに貢献することを願っています。まず、培養細胞をRNAおよびタンパク質抽出に十分な適切なフラスコに座り、qPCRまたはマイクロアレイ解析を用いて遺伝子発現を行う。その後、10%FBSと1%ペニシリンストレプトマイシンを補ったメディアで一晩インキュベートします。翌日、マイクロRNA143とマイクロRNA506をそれぞれ100ナノモルの濃度で培地中に希釈してトランスフェクション用のマイクロRNAサンプルを調製する。インキュベーターからフラスコを取り出し、培地を取り出します。1倍のPBSで洗います。未処理のコントロールには、不完全なメディアのみがセルに含まれます。細胞をインキュベーターで6時間トランスフェクション培地でインキュベートします。6時間後、メディアを取り出し、新鮮で完全な培地を4ミリリットルに交換します。トリプシン法により24時間後、48時間後に細胞を収穫する。次に、各チューブに1x PBSで2回洗浄し、上清を除去します。後でRNA抽出を行うために、マイナス80度で細胞を凍結します。RNA抽出は、メーカーの指示に従って、RNAキットを使用して行った。まず、マイナス80度からチューブを取り外し、解凍することができます。細胞膜を壊すために300マイクロリットルのリシスバッファーとピペットを上下に加えます。100%超純エタノールの等しい量を加えます。その後、よく混ぜ、区切られた列に配置します。遠心分離機を使用し、フロースルーを取り除く。400マイクロリットルの洗浄とバッファーと遠心分離機を加え、バッファーを取り除きます。各サンプルに75マイクロリットルのVNA消化バッファーを含むDNAse 1を5マイクロリットル加え、15分間インキュベートします。その後、400マイクロリットルのRNA調製バッファーでサンプルを洗浄します。次に、RNA洗浄バッファーで2回洗浄します。次に、ヌクレアーゼを含まない水をカラム、遠心分離機に加え、RNAを回収します。RNA濃度を測定します。この段階では、RNAシーケンシング用に2マイクログラムのRNAサンプルを送ることができます。サーモサイクラーを使用して、テキストセクションに記載されているプロトコルに従ってcDNAを準備します。DNAse RNAseフリー水を用いて、10マイクロモルの濃度に前進および逆プライマー溶液を調製します。サンプル数に応じて検出される各遺伝子のマスターミックスを準備します。各cDNAサンプルについて、反応量は、テキストに記載された表に従って行います。各サンプルをそれぞれのウェルに配置します。qPCR の場合、サンプルを追跡するために、96 ウェルプレートレイアウトを持つ Excel ドキュメントを準備することをお勧めします。各サンプルおよび分析された遺伝子について、三重化または少なくとも重複でそれらの反応を行う。透明で光学的に透明なプラスチックシーラーでプラスチックプレートを密封します。これは偽の信号を生成することができますので、指で薄い、プラスチック層に触れないようにしてください。素早くプレートを回転させ、すべての試薬をウェルの底に混ぜます。次に、定量的なリアルタイム PCR マシンを使用してサンプルプレートを実行します。qPCRマシンによって生成されたCT値を取得し、相対遺伝子発現について分析します。このビデオの前のセクションで説明したように、セルをトランスフェクトします。トリプシン化用の各サンプルから細胞を15ミリリットルの無菌チューブで収穫する。次に、細胞を1xPBSで2回洗浄し、751Gで5分間遠心分離し、次いで上清を取り除いた。ピペットを通して200マイクロリットルの氷冷1x PBSを加えることによってパレットを再中断して壊します。70%の氷冷エタノールの2ミリリットルを加え、チューブに落とし、チューブを穏やかに渦して細胞を固定します。チューブを室温で30分間インキュベートし、摂氏4度に1時間入れます。4°Cと遠心分離機からチューブを取り外します。2mlの氷冷PBSと渦を加え、遠心分離によって上清を取り除きます。ヨウ化プロピジウムとリボヌクレアーゼAを含む1x PBSの500マイクロリットルを、それぞれ1ミリリットル当たり50と200マイクログラムの濃度で加え、各サンプルに、室温で30分間インキュベートする。サンプルを適切なチューブに移し、光から保護し、フローサイトメーターで実行します。本実験は、マイクロRNA処理によって変化したタンパク質の発現の全ての細胞周期経路を同定するものである。トランスフェクションセクションに記載されている手順に従ってタンパク質サンプルを収集し、BCAアッセイで定量します。実験の1時間前にマイナス4度からスライドを取り除き、室温に持ち込み、水分を取り除きます。70マイクログラムのタンパク質サンプルを採取し、メーカーの指示に従ってサンプルスライドを準備します。ここでは、超純粋な脱イオン水でスライドの適切な洗浄は、これはスライドの背景を減らすのに役立つため、別の重要なステップです。さらに、この実験では、最終段階までサンプルスライドを乾燥しないことが非常に重要です。最後に、マイクロアレイマシンを使用してスライドをスキャンし、データを分析します。マイクロRNA処理サンプルのqPCR分析は、CDK1、CDK4およびCDK6の遺伝子発現を決定するために行われた。これらの遺伝子は、正常細胞および癌細胞の細胞周期を調節し、腫瘍進行を阻害する手段として標的とされてきた。このデータは、microRNA 143および506による治療によるこれらの遺伝子のダウンレギュレータ効果を実証した。フローサイトメトリーからの細胞周期分布データは、G0およびG1相における集団増加を示し、マイクロRNA143および506の組合せ処理の効果によるS相の集団減少を示した。細胞周期特異的マイクロアレイ解析では、約60遺伝子のタンパク質発現変化を検出した。表されたヒートマップは、CDK2、ヘレン1および3、RE2F1などの細胞周期および増殖の進行に必要な複数の遺伝子のタンパク質レベルでのダウンレギュレーションを示した。対照的に、増殖した阻害効果によって一般的に認識されるタンパク質は、アップレギュレートされた。結果は半定量的でさらなる分析が必要ですが、マイクロアレイ解析では経路の活性の概要が簡単に得られます。このビデオを見た後、細胞内のマイクロRNA活性の同定に役立つ基本的な、複雑なラボ実験を行うことができると信じています。

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Research

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Cancer Research

がん研究

ターゲットIDのライブラリは、miRNAのターゲットを識別するために使用されるクローニングされたcDNAのプラスミドベースのゲノムワイドなコレクションです。ここでは、その使用してアプリケーションを示しています。...

ミッションターゲットIDのライブラリを使用してmiRNAのターゲットのゲノムワイドスクリーン

このビデオでは、miRNAトランスフェクション肺がん細胞からのRNA抽出プロトコルについて説明しています。このアプローチは、細胞周期と血管新生を停止させる組み合わせmiRNA治療活性を特定するために使用できます。...

RNA抽出アッセイ:miRNAトランスフェクト肺がん細胞からRNAを抽出する方法

miRNAまたはmicroRNAは、細胞周期の進行の主要な調節因子です。このビデオでは、miRNA が細胞周期調節に及ぼす影響を研究するために、miRNA...

細胞周期解析:miRNAトランスフェクション肺がん細胞の細胞周期調節を研究するためのアプローチ

この動画では、抗体マイクロアレイを用いて特定の遺伝子発現を測定することにより、miRNAトランスフェクト肺がん細胞におけるタンパク質発現を研究する技術について説明しています。注目のプロトコルでは、細胞周期の停止と血管新生におけるコンビナトリアルmiRNA処理の活性を同定するための抗体マイクロアレイを行います。...

抗体マイクロアレイ:miRNA処理肺がん細胞のタンパク質発現を研究する技術

このビデオは、同所性マウスモデルにおける腫瘍増殖に対する治療薬としてのmiRNA阻害剤のin...

miRNA阻害剤による腫瘍内治療のモデリング:マウスモデルにおけるmiRNA阻害剤の腫瘍増殖への影響を分析する方法

体外誘導 EndMT に関与する細胞のシグナル伝達経路を調査するために有用である内皮間葉転換 (EndMT) のためのプロトコルを説明します。この実験モデルでは、EndMT は MS 1 血管内皮細胞における TGF-β...

成長因子 β シグナルを変換することによって誘導される血管内皮間葉移行の分子解析

このレポートでは、高速かつ信頼性の高い携帯電話の miRNAs の mRNA ターゲットの検証方法について説明します。合成ビオチン化核酸 LNA のロックを用いた miRNA を模倣をキャプチャする使用していた方法は、mRNA をターゲットします。プルダウンにストレプトアビジン コートした磁気ビーズを採用するその後、ターゲット mRNA qPCR...

ビオチン ベース プルダウン法検証 mRNA をターゲットの携帯電話の miRNAs

このプロトコルは、プローブベースのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、スルフォルホダミンB(SRB)アッセイ、3'未翻訳領域(3'UTR)クローニング、および目的のmiRNAの標的遺伝子を検証し、miRNAの機能を理解するためにルシフェラーゼアッセイを使用します。...

腫瘍細胞におけるマイクロRNAレベル、機能、および関連する標的遺伝子を評価するためのインビトロプロトコル

ここで説明する、生物学的に相乗的なmiRNAとその組み立てモジュールを短いトランス遺伝子に特徴付けるプロトコルであり、遺伝子治療用途に対する同時過剰発現を可能にする。...

神経膠芽腫における機能的関連miRNAの特徴付けと遺伝子治療のための人工クラスターへの工学

このプロトコルは、マイクロRNAクラスターネットワーク解析のための、規則的に間隔をあけた短い回文反復(CRISPR)遺伝子編集ワークフローをクラスター化したハイスループットのクラスター化を記述しており、1回の実験で35...

マイクロRNAクラスターネットワーク解析のためのCRISPR遺伝子編集ツール

このプロトコルは、マイクロRNAおよびマルチプレックスタンパク質を同時に検出および定量するためのホルマリン固定パラフィン包埋組織を用いたタンデム免疫蛍光ハイブリダイゼーションアッセイを記述している。...

新しい検出および定量法としてのロック核酸 in situ ハイブリダイゼーションによるマイクロRNA増幅と認識

学ぶ miR-143およびmiR-506の組み合わせ治療による肺がん細胞の細胞周期停止と血管新生制御メカニズム。RT-qPCR、フローサイトメトリー、マイクロアレイを用いた包括的解析手法を解説します。

組合せ miRNA 細胞周期の調節、血管新生治療の解析

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