Name: 顎下および耳下腺唾液腺からの Organotypic 培養の放射線治療は生体内特性をモデル化する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 学ぶ唾液腺のオルガノタイプ培養法を用いた放射線治療応答の評価方法。細胞間相互作用の可視化と治療薬スクリーニングにより、放射線損傷メカニズムの解明と動物実験の削減に貢献します。

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この作業は、アリゾナ大学の研究と発見と国立衛生研究所 (R01 DE023534) のキルスティン・ Limesand によって提供されるパイロット資金によって部分的にサポートされていました。癌生物学トレーニング助成金、T32CA009213 は、ウェン・ユウ・ウォンのための俸給支援を提供しました。著者は、彼の貴重な技術貢献のために m. ライスに感謝したいと思います。

1. ビブラトームの準備
<ol><li>緩衝トレー、ブレードアタッチメント、アガロースブロックモールド、および 70% エタノールの実験室フィルムを含むビブラトームの取り外し可能なコンポーネントをスプレーし、その後、UV 殺菌を少なくとも30分間行います。</li>
	<li>氷が落下するのを防ぐために、バッファトレイの上に追加シートフィルムを置き、固定します。</li>
	<li>氷の部屋を砕いた氷で満たし、実験室のフィルムを緩衝トレーから取り出し、100 mL の氷冷1x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 溶液を 1% のペニシリン-ストレプトマイシン-アンピシリン (PSA) で補足して緩衝トレーに充填する。</li>
	<li>ブレードホルダーにステンレススチールかみそりの刃を置きます。ドライバを使用して、ブレードの角度を締め付け/緩め、変更します。</li>
</ol>2. アガロースブロック内の組織サンプルの調製およびビブラトームを使用した断面化
<ol><li>鉗子、はさみおよびペイントブラシを含むすべての必要な解剖および区分用具をオートクレーブに収めなさい。</li>
	<li>アガロースが溶液に溶解するまで、滅菌 1x PBS およびマイクロ波に 3% の低融点アガロースを準備します。溶液が沸騰していないことを確認し、混合するために定期的にボトルを旋回。 注: 低融点アガロースを温水浴に保つことによって固化しないようにしてください。低メルトアガロースは37° c で、25° c に設定されています。しかし、生理的温度でアガロースを組織の周りに注ぐためには、水浴を40° c 以下にする必要があります。</li>
	<li>唾液腺を分離し、切開した組織を 2 mL の氷冷 1x PBS に、無菌の30mm 培養皿に 1% の PSA を補充した。</li>
	<li>オートクレーブ鉗子を使用して、1x PBS + 1% PSA 溶液から唾液腺を除去し、埋め込み型の底部に位置します。液体 3% の低融点アガロースで鋳型を充填し、組織をカバーします。</li>
	<li>鉗子を使用して、ブロックの中央に組織を調整し、適切な面に唾液腺を配置します。顎下と耳下腺にとって最良の断面は垂直面である。</li>
	<li>アガロースブロックを氷上に設置し、10分間硬化させる。</li>
	<li>アガロースの外縁の周りを慎重にかみそりの刃を動かし、ステップ1.1 から UV 滅菌実験室フィルムにブロックをスライドさせて緩めます。</li>
	<li>かみそりの刃を使用して、唾液腺を含むアガロースボックスを切り出します。セクションの平面が、ブロックの反対側 (接着されるサーフェス) と平行になっていることを確認します。アガロースは組織に侵入しないので、組織の周りにあまりにも多くのアガロースをトリミングしないようにして、組織が十分にサポートされるようにします。</li>
	<li>切断面にブロックを取り付けるには、superglue を使用します。</li>
	<li>50μ m または90μ m の厚さのセクションでは、0.075 mm/s の速度と 100 Hz の周波数でビブラトームします。 注: 最高周波数でビブラトームを設定し、最も低いブレード速度は最適なスライスを提供します。</li>
	<li>〜 1 mL の氷冷 PBS を含む24ウェル組織培養皿の切片を、オートクレーブされた天然の毛ブラシを使用して、70% エタノールにスライスコレクション間に入れ、無菌性を維持する。</li>
</ol>3. 培養セクション
<ol><li>マイクロスパチュラおよび鉗子をオートクレーブする。</li>
	<li>ウシ胎児血清 (FBS) の有無にかかわらずストックビブラトーム培養培地を作る: DMEM/F12 培地は、1% PSA、5μ g/mL トランスフェリン、1.1 μ m ヒドロコルチゾン、0.1 μ m レチノイン酸、5μ g/mL インスリン、80 ng/mL 上皮成長因子、5 mM L-グルタミン、50μ g/mL硫酸ゲンタマイシン及び10μ l/mL 微量元素混合物である。適切な量の FBS を追加して、0%、2.5%、5.0%、または 10% のソリューションを作成します。</li>
	<li>断面化する前に、予温められた培地の300μ l を加えて、12 mm 直径、0.4 μ m の細孔サイズの膜インサートを24ウェル組織培養プレートの各ウェルに入れる。メディアは、培養用の液体空気界面を作成するために、膜底に到達する必要があります。</li>
	<li>加湿 5% CO2 と 95% 空気雰囲気インキュベーター内の37° c で、マイクロスパチュラと培養を使用して 、膜インサートの上に唾液切片を優しく寝かせます。<ol>
<li>ウェルに約300μ l の一次培養培地を加え、膜インサート (約40μ l) を1日おきに数滴または必要に応じて滴下します。適切な培養は、細胞が生存することができ、最大30日間のインビボで維持することができることを示した。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 唾液腺切片の照射
<ol><li>60 (またはそれに相当する) 照射装置を使用して、1回の放射線量 (5 Gy) で切片を処理します。<ol>
<li>温度の変動を避けるために、覆われた発泡スチロール容器を使用して照射装置施設への輸送セクション。さらに、培地が培養蓋に飛び散ることがなく、汚染を誘発しないようにするために、ラボインキュベーターへの輸送中には注意が必要です。</li>
		<li>放射線源から 80 cm の唾液腺切片を含む24ウェルプレートを、放射線場の 32 "x 32" の中心に置きます。照射装置の放射線量計算と対応する時間は、計器とコバルト-60 崩壊によって異なります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>セクション3で説明されているように、これらのセクションの監視と培養を続けます。</li>
</ol>5. 生存性染色
<ol><li>古いメディアを吸引し、無菌の、事前に温められた 1x PBS でスライスを2回洗浄します。</li>
	<li>トリパンブルー染料で汚れのセクション。<ol>
<li>スライスを培養からガラススライドに移動するには、マイクロスパチュラを使用します。</li>
		<li>ティッシュ (10-20 μ l) をカバーする十分な容積が付いているビブラトームのスライスに 0.4% トリパンの青の解決を加えなさい。</li>
		<li>色素が組織に浸透するために、トリパンブルーの室温 (RT) でスライスを 1 ~ 2 分間インキュベートします。中絶細胞は青色に染色され、生存細胞は未染色されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>カルセインを用いて切片を染色し、生細胞染料である。<ol>
<li>24の井戸版 (200-300 のμ l) の1つの井戸のセクションをカバーするのに十分な量の汚れを加えなさい。</li>
		<li>RT でスライスを15分間インキュベートし、染料の浸透を可能にします。</li>
		<li>慎重に井戸からセクションを削除し、ガラスのスライド上に配置します。1滴のマウントメディアでスライスをマウントします。</li>
		<li>488 nm および 515 nm の励起/放出波長の蛍光顕微鏡のイメージのセクション。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 抗体染色ビブラトームセクション
注: 以下は、Ki-67 に特異的な一般抗体染色プロトコルを提供します。しかし、このプロトコルは、任意の抗体と共に使用することができる。特に断りのない限り、すべての洗浄は RT で行われる。
<ol><li>多井戸組織培養皿では、培地をオフに吸引し、滅菌 1x PBS で少なくとも2x を洗浄する。</li>
	<li>4° c で一晩 4% パラホルムアルデヒド (PFA) を使用してセクションを固定します。</li>
	<li>4% PFA をオフ吸引し、PBT で3倍洗浄します [1x PBS, 1% ウシ血清アルブミン (BSA), 0.1% トリトン X-100]. 注: セクションは4° c で 1x PBS に保存され、後で染色することができます。この原稿で試験した最大貯蔵時間は3週間であった。必要な場合は、個々のユーザーがより長いストレージ時間を最適化する必要があります。</li>
	<li>透過処理は 0.3% トリトン X-100 を 1x PBS で30分間使用しました。 注: このステップは、特定の抗体染色および透過処理に対して修正および最適化することができます。</li>
	<li>Pipet 透過処理ソリューションをオフにします。</li>
	<li>1x PBS、1% BSA、0.1% トリトン X-100 (PBT) で5分間3倍にしてください。</li>
	<li>1 h の 1% 正常なヤギの血清が付いているブロックのエージェントが付いているスライスをブロックしなさい。</li>
	<li>PBT で5分間3倍のスライスを洗います。</li>
	<li>1x PBS で 1% BSA で希釈した500μ l 抗 Ki67 ウサギモノクローナル抗体を使用して、4° c で一晩インキュベートします。 注: ファロイジン染色の場合、ステップ6.9 をスキップし、使用された特定のファロイジンのプロトコルを使用して続行します。DNA 対比染色については、ステップ6.15 にスキップしてください。</li>
	<li>抗 Ki67 ウサギモノクローナル抗体を吸引する。</li>
	<li>1x PBS で5分間スライス6x を洗ってください。</li>
	<li>光から覆われた 1.5 h のために RT で 1x PBS で 1% BSA で希釈した Ki67 抗体と互換性のある蛍光共役二次抗体の500μ l 中のスライスをインキュベートします。 注: 使用される二次抗体に基づいて、二次抗体とのインキュベーション時間は、個々のユーザによってさらに最適化され得る。また、二次抗体は光感受性である。以降のすべての洗浄は、暗所で実行する必要があります。</li>
	<li>二次抗体を吸引する。</li>
	<li>1x PBS で5分間、3倍のスライスを洗ってください。</li>
	<li>脱イオン水で5分間、スライスを洗います。</li>
	<li>RT の 20 min に DAPI (1 μ g/mL) の対比染色スライス。</li>
	<li>脱イオン水でスライス (1 回) を5分間洗浄します。</li>
	<li>マウントメディアの1滴 (~ 40 μ l) でスライスを取り付けます。余分な泡を避けるために、45°の角度から始めて、スライド上のマウントメディア上にゆっくりとカバースリップを置きます。<ol>
<li>厚い部分をカバースリップで押しつぶさないようにするには、各スライスをスペーサで取り付けます。スペーサはティッシュセクションのまわりで正方形に真空のグリースの縁を置くことによって作成することができる。</li>
		<li>カバースリップを敷設するとき、カバースリップの端は真空グリースで密封することができます。親指でカバースリップの端を押し下げて、スライド上にしっかりと密着させます。あるいは、クリアマニキュアを使用して顕微鏡スライドにカバースリップを密封します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. イメージングビブラトームセクション
<ol><li>染色してから5日以内に染色されたスライドを撮影する。</li>
	<li>共焦点顕微鏡を用いて染色されたビブラトームスライスの光学切片を得る。共焦点顕微鏡では、定義されたステップサイズで z スタックを得るか、またはユーザの実験計画に応じて個々の画像を取る。画像は、共焦点収集後の任意のコンピュータ画面上で調べることができる。 注: ビブラトームスライスの厚さのため、共焦点顕微鏡または z スタック機能を持つ範囲を使用して、サンプル内の詳細を視覚化することをお勧めします。この原稿で使用されている画像については、63x オイルの目的が使用されました。ただし、これは個々のユーザおよび使用される特定のスコープによって調整され、さらに変更することができます。最小の光学的に解決可能な構造体の X と Y の2.5 ピクセルの想定されたナイキストサンプリングを使用して、各目的とズームファクターの推奨ピクセル解像度。ただし、一部のコメンテーターは2.3 ピクセルを提案し、その他は2.8 ピクセルを提案します。これらの計算を行う方法の詳細については、生物共焦点顕微鏡第22巻のハンドブックを参照してください。</li>
</ol>

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<li>Kwon, H. R., Nelson, D. A., DeSantis, K. A., Morrissey, J. M., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+regulation+of+salivary+gland+epithelial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell regulation of salivary gland epithelial patterning.</a> Development. 144 (2), 211-220 (2017).</li>
<li>Mellas, R. E., Leigh, N. J., Nelson, J. W., McCall, A. D., Baker, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zonula+occludens-1%2C+occludin+and+E-cadherin+expression+and+organization+in+salivary+glands+with+Sjogren%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Jounral+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Zonula occludens-1, occludin and E-cadherin expression and organization in salivary glands with Sjogren's syndrome.</a> Jounral of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (1), 45-56 (2015).</li>
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作者は何も開示することはありません。

唾液腺研究では、不死化2次元培養、主な2次元培養、3次元 salisphere 培養、および胚外植片からの三次元器官培養を含む多くの培養モデルを利用して、基礎となる生物学と生理学に関する疑問を確認しました。これらの培養モデルは、多様な研究課題にわたって洞察に富んだ情報をもたらし、唾液中の研究においても重要なツールであり続けます。これらの培養モデルの限界には、不死化中の p53 活性の変調、一次培養の一過性生存率、培養中の分化および分泌タンパク質の喪失、および細胞細胞、細胞-ECM および極性の評価不能などが含まれる。成人組織における相互作用.唾液腺の最初の3次元 organotypic スライス培養 (ビブラトーム切片培養) 法が 200818において公表された。しかし、この手法は、他の分野で頻繁に使用されているにもかかわらず、この分野ではほとんど利用できませんでした。48 h のための耳下腺培養作業では、放射線治療後の慢性影響についてこれらの切片を研究する能力、または特定の遺伝子を用いた表現型のトランスフェクションまたは形質導入プロトコルを利用することが制限されています。ここで説明した方...

適切な唾液腺機能は、口腔の健康に不可欠であり、放射線治療1による頭頸部癌処置の後に変化する。2017年、米国では、約5万の新しい頭頸部癌症例が報告された。唾液腺のような周囲の正常組織に対する放射線療法の組織損傷およびしばしば不可逆的効果のために、患者はしばしば重篤な副作用を残し、生活の質を低下させる2、3、 4.放射線障害によって引き起こされる一般的な合併症は、口内乾燥症 (口内乾燥の主観的感覚)、齲蝕、咀嚼・嚥下能力の障害、発話障害、経口フローラ2などの症状に現れる3,4.これらの症状を総称して、罹患した個体5における栄養不良および生存障害を引き起こす可能性がある。この集団における唾液腺機能障害は十分に立証されているが、腺房細胞への損傷の根底にあるメカニズムは論争されており、異なる動物モデル6、7間の統合はほとんどない。
唾液腺機能と放射線による損傷を研究する現在の方法は、in vivo モデルの使用、不死化細胞株、二次元 (2-d) 一次細胞培養、および三次元 (3-d) salisphere の培養8、 9、10、11、12。伝統的に、不死化細胞株と二次元培養物からの細胞培養モデルは、平らな表面で培養された単層細胞を含み、迅速で、簡単で、費用対効果の高い実験に有用である。しかしながら、人工細胞培養条件は、様々な条件に曝露した細胞の分化状態および生理的応答を変化させることができ、そしてその結果は、生物モデル14,15全体に翻訳することがしばしば失敗する。さらに、不死化細胞培養には p53 活性の変調が必要であり、これは DNA 損傷16,17に対する唾液腺応答にとって重要である。
培養中の初期時点での幹細胞および前駆細胞の salisphere 培養が濃縮されており、この唾液腺細胞のこのサブセットの放射線感受性を理解するのに有用である9、18。これらすべての培養モデルの決定的な限界は、細胞外マトリックス (ECM) および細胞細胞相互作用を含む唾液腺の三次元構造を、唾液の調節に極めて重要である様々な層にわたって可視化する上では効果がないことである。分泌15.組織全体の行動を包含する方法の必要性しかし、治療の効果を研究するために実験室条件下で操作することも可能であり、放射線誘発性唾液腺の根底にあるメカニズムをさらに発見する必要がある機能 不全。
生きたティッシュの区分および文化は前に19,20文書化され、多くの場合、脳組織相互作用21を研究するために使用される。これまでの研究では、マウス由来の耳下腺唾液腺組織を約50μ m に切片化し、最大 48 h の培養を行い、その後19個の生存率、細胞死、機能の解析を行った。Su et al.(2016) 顎下腺 (SMGs) を35μ m または50μ m で切片にして20日間培養することにより、この方法論を拡充した。本手法は、50μ m および90μ m で切片となった耳下腺および顎下唾液腺の両方を含み、30日間培養の評価を行うという進歩である。組織の厚さの範囲をカットする能力は、尖 basolateral 極性および分泌の神経支配を含む細胞プロセスに関連する細胞細胞および細胞-ECM 相互作用を評価する上で重要である。さらに、この培養モデルの実現可能性を判断するために培養中に唾液腺切片を照射し、放射線による唾液腺損傷を研究した。
この唾液腺 organotypic 培養プロトコールの目的は、培養生存率の最大時間を評価し、ex vivo 放射線治療後の細胞変化を特徴付けることである。後郭清可能な最大時間切片を決定するために、トリパンブルー染色、生細胞染色、および細胞死に対する免疫組織化染色が実施された。共焦点顕微鏡と immunofluorescent 染色は、特定の細胞集団、形態学的構造、および増殖のレベルを評価するために利用された。組織セクション培養物はまた、この3-d モデルにおける様々なマーカーに対する放射線の影響を決定するために電離放射線に暴露された。細胞死の誘導、骨格破壊、分化マーカーの欠損、および照射された ex インビボ培養物における代償性増殖を、インビボモデルの以前の研究と比較した。この方法論は、放射線損傷後の細胞間相互作用の役割を調査するための手段を提供し、治療的介入の有効性を効率的に評価するための実験的モデルを提供する (遺伝子操作または薬理学的薬剤) は、in vivo モデルにはあまり適していない可能性があります。

<table><tbody><tr><td>ビブラトーム VT1000S</td><td>ライカバイオシステムズ</td><td>N/A</td><td>セクショニング用ビブラトーム</td></tr><tr><td>ダブルエッジ ステンレススチール カミソリ刃</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP165-25</td><td>低融</td></tr><tr><td>点パラフィルム</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>P6543</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン・ストレプトマイシン・アムホテリシン B</td><td>ロンザ</td><td>17-745H</td><td>PSA</td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>CellTreat</td><td>229124</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'S リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Loctite UltraGel Control Superglue</td><td>Loctite</td><td>N/A</td><td>金物店で購入</td></tr><tr><td>ナチュラル レッド セーブル ラウンド ペイントブラシ</td><td>プリンストン アート &ブラシ株式会社</td><td>7400R-2</td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン硫酸</td><td>フィッシャー科学</td><td>ICN1676045</td><td></td></tr><tr><td>トランスフェリン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>T-8158-100mg</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタトミン</td><td>ギブコ</td><td>25030-081</td><td></td></tr>微<tr><td>量元素</td><td>MPバイオメディカルICN1676549</td><td></td><td></td></tr><tr><td>インスリン</td><td>フィッシャー科学12585014</td><td></td><td></td></tr><tr><td>上皮成長因子</td><td>コーニング</td><td>354001</td><td></td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>レチノイン酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>R2625-50MG</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ギブコ</td><td>A3160602</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 培地</td><td>コーニング</td><td>150-90-CV</td><td></td></tr><tr><td>ミリセル細胞培養インサート</td><td>ミリポアシグマ</td><td>PICM01250</td><td>12 mm、0.4 um 孔径 24 ウェルプレート用</td></tr><tr><td>0.4% トリパンブルー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>R37601</td><td>Only used LIVE dye component</td></tr><tr><td>Anti-Ki-67 Antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9129S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-E-cadherin Antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3195S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9661L</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SMA Antibody</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6198</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Amylase Antibody</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8273</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31 Antibody</td><td></td><td>Abcam ab28364</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TUBB3 Antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>5568S</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 抗体ラベリングキット</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A20185</td><td></td></tr><tr><td>アレクサフルオア 594 ファロイジン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1600</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>21568-2500</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド プリルス</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>5027632</td><td></td></tr><tr><td>ニューイングランド核ブロッキング剤</td><td>Perkin Elmer</td><td>2346249</td><td>販売終了</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4083S</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade Mounting Media</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Leica SPSII Spectral Confocal</td><td>Leica Biosystems</td><td>N/A</td><td>共焦点イメージング用</td></tr><tr><td>Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope</td><td>Leica Biosystems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cobalt-60 Teletherapy Instrument</td><td>Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>AMACボックス、クリア</td><td>コンテナストア</td><td>60140</td><td>アガロースブロックモールド</td></tr></tbody></table>

顎下および耳下腺唾液腺からの organotypic 培養の放射線治療は生体内特性をモデル化する

Radiation Treatment of Organotypic Cultures from Submandibular and Parotid Salivary Glands Models Key In Vivo Characteristics

Hyposalivation と口内乾燥症は、放射線治療を受けている頭頸部癌患者の生活の質を低下させる慢性口腔合併症を作り出す。唾液腺機能障害と回復のメカニズムを理解するための実験的アプローチは、生体内モデルに着目しており、治療候補のスクリーニングを体系的に行うことができず、トランスフェクションの効率が低下している特定の遺伝子を操作する能力。この唾液腺 organotypic 培養プロトコールの目的は、培養生存率の最大時間を評価し、ex vivo 放射線治療後の細胞変化を特徴付けることである。Immunofluorescent 染色と共焦点顕微鏡検査を利用して、30日間の培養期間中に特定の細胞集団とマーカーがいつ存在するかを判断しました。さらに、生体内放射線モデルで以前に報告された細胞マーカーは、ex 生体内に照射された培養液中で評価される。前進して、この方法は、唾液機能を改善する治療薬に対するマウスおよびヒトの唾液腺組織応答の迅速な ex インビボ評価のための魅力的なプラットホームである。

初代2次元培養物は、ウシ胎児血清 (FBS) 補充培地で増殖させ、一方、一次3− D salisphere 培養は、通常、無血清状態で培養される10、11。さらに、唾液腺からのビブラトーム培養を利用した2つの以前の研究では、0% または 10% の FBS を補充した培地19,20でその切片を培養した。マウス顎下スライスを、ビブラトームを用いて50μ m の厚さで切片化し、最適な培養条件を、一連の FBS 濃度 (0%、2.5%、5.0%、および 10%) を用いて決定した。生存特性を測定するために、培養日1、4、7、14、および30の後断面で明視野顕微鏡画像を撮影した (図 1)。さらに、0.4% トリパンブルー染料で腺切片を染色し、示された時点で明視野顕微鏡で40倍に画像化した...

3次元 organotypic 培養を用いて唾液腺の形態や機能マーカーを可視化することで、放射線後の組織損傷のメカニズムについて、新たな知見を得ることができます。ここで説明されているのは、電離放射線への曝露の前に、培養、照射、染色、50 ~ 90 μ m の厚い唾液腺切片を断面化するためのプロトコルである。

顎下および耳下腺唾液腺からの Organotypic 培養の放射線治療は生体内特性をモデル化する

Hyposalivation and xerostomia create chronic oral complications that decrease the quality of life in head and neck cancer patients who are treated with ...

このプロトコルは、組織内の多様な細胞タイプ間の細胞間相互作用、および生体内での実現可能性が低いex vivo分子および薬理学的操作の細胞間の評価を可能にする。この技術の主な利点は、これらの組織切片を培養中に長期間維持し、後の時点での評価を可能にすることである。この技術は、唾液腺損傷を矯正するために治療化合物のより迅速なスクリーニングを可能にし、これらの研究に使用されるマウスの数を減らす可能性が高い。この技術を用いて、中間時点での放射線療法に対する唾液腺応答を理解し、特定の間隔で遺伝子のオン/オフを切り出す計画です。この手順の最も困難な側面は、組織の切片と培養中の組織切片の損失を防止し、染色ステップです。手順を開始する前に70%エタノールで取り外し可能なビブラートーム成分を消毒し、その後、少なくとも30分間UV殺菌を行う。バッファートレイの上に追加の実験室用フィルムシートを確保して氷が入るのを防ぎ、氷室を砕いた氷で満たします。実験室用フィルムをバッファートレイから取り出し、1%ペニシリンストレプトマイシンアンピシリンまたはPSAを補った氷冷PBSの100ミリリットルでバッファートレイを充填します。次に、ステンレススチール製のカミソリの刃をブレードホルダーに配置し、ドライバーを使用してブレードの角度の調整を容易にします。唾液腺を単離した後、収穫した組織を1%PSAを補った2ミリリットルの氷冷PBSを含む滅菌30ミリメートル培養皿に入れる。オートクレーブ鉗子を使用して、埋め込み型の底に腺を移し、液体3%低融点アガロースで組織を覆う。鉗子を使用して、適切な平面のブロックの中央に組織を調整し、10分間氷の上にアガロースブロックを置きます。アガロースが硬化したら、鋳型の外側の端の周りにカミソリの刃を慎重に実行し、ブロックをUV滅菌した実験室フィルムにスライドさせます。かみそりの刃を使用して唾液腺を含むアガロースボックスを切り取り、セクションの平面がブロックの反対側にまっすぐで平行であることを注意してください。スーパーグルーを使用してブロックを切断面に取り付け、100ヘルツ周波数で0.075ミリメートル/秒の速度でビブラートメの厚さ50または90マイクロメートルのセクションを得ます。次に、オートクレーブ化された天然毛髪の絵筆を使用して、1ミリリットルの氷冷PBSを含む24のウェル組織培養皿の個々の井戸にセクションを移し、得られる。すべての切片が獲得されたら、使用し、個々の0.4マイクロセンチュラを使用して、300マイクロリットルのビブラードーム培養培地を含む24ウェル組織培養プレートの各ウェルに各ウェルに膜挿入物を注ぐようにする。その後、プレートを湿度付きの摂氏37度と5%の二酸化炭素インキュベーターに入れ、各ウェルの底部で媒体をリフレッシュし、必要に応じて1日おきに40

radiation-treatment-organotypic-cultures-from-submandibular-parotid

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

マウス唾液腺由来の幹細胞の単離のため最適化されたプロトコルが記述されています。方法は、酵素と機械的な消化を採用しており、幹細胞の特性を持つ細胞を含むsalispheresの分離を可能にします。...

マウス唾液腺幹細胞の単離

遺伝的に全体の内の上皮細胞を操作する技術...

唾液腺器官培養の遺伝子改変と再結合

唾液腺の機能低下は、頭頸部放射線治療の大きな副作用であり、患者の生活の質を低下させます。動物モデルにおける新しい治療法の有効性の実証は、臨床移行前の前提条件です。このプロトコルは、ラット顎下腺のレトロダクト投与と局所照射について説明しています。...

唾液機能低下のラットモデルにおけるRetroductal顎下腺点滴とローカライズされた分割照射

手術を公開し、直立した生体顕微鏡を用いた生体イメージングのマウス顎下腺唾液腺を安定させるためのプロトコルについて述べる。このプロトコルは、頭部および頸部マウスの他の小さい齧歯動物の他の外分泌腺に容易に適応です。...

マウス顎下腺唾液腺の直立した生体顕微鏡検査のための準備

顎下腺への薬剤の局所投与は、唾液腺の生物学を理解に、新規治療法の開発に興味のです。配信精度と実験の再現性を向上させるため、更新と詳細な retroductal...

マウス顎下腺への Retroductal ナノ粒子注入

ピロカルピン刺激次を介してマウス唾液機能的アセスメント分別放射線

マウス乳腺から開発されたオルガノイドを照射し、上皮形質および免疫細胞との相互作用を評価することを特徴とした。照射されたオルガノイドは、照射正常組織における腫瘍細胞動員につながる可能性のある細胞間相互作用をよりよく評価するために使用することができる。...

乳腺からの照射オルガノイドの成長とキャラクタリゼーション

一次ヒト唾液腺由来上皮細胞を分離・培養する方法を提示する.これらの細胞は唾液上皮起源の遺伝子発現パターンを示し、エンゲルブレス・ホルム・スウォーム腫瘍細胞に由来する基塩膜マトリックス上の唾液圏として、または処理された培養皿上の単層として増殖することができる。...

唾液圏または単層としての体外増殖のためのヒト唾液腺からの唾液上皮細胞の単離

免疫蛍光イメージングは、複雑で時間依存の生物学的プロセスを1つのスナップショットで観察する能力に制約があります。この研究は、精密にカットされたマウスの顎下腺スライスで実施されたライブイメージングアプローチの概要を説明します。このアプローチにより、ホメオスタシス中の細胞間相互作用や再生・修復の過程をリアルタイムで観察することができます。...

唾液腺における細胞間相互作用の Ex Vivo Live Cell Imaging(英語)

ワルトン管を介してマウス顎下唾液腺のカニュレーションのためのプロトコルが記述されています。この実験では、トリパンブルー溶液は、この手法が効果的に標的腺に注入を提供する方法を示すこと、および唾液腺の再生のための潜在的な臨床薬/細胞療法としてのこの新しいアプローチの信頼性を示唆するダイアーとして使用されます。...

ワルトン管を経由してマウス顎下唾液腺のカニュレーション

学ぶ唾液腺のオルガノタイプ培養法を用いた放射線治療応答の評価方法。細胞間相互作用の可視化と治療薬スクリーニングにより、放射線損傷メカニズムの解明と動物実験の削減に貢献します。

顎下および耳下腺唾液腺からの Organotypic 培養の放射線治療は生体内特性をモデル化する

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