緑藻クラミドモナス・ラインハルトティの同期培養物の詳細分析のためのマルチオミクス抽出法

システム全体の研究は、生物学的機能の詳細な理解のために重要です。ただし、異なるオミクス プラットフォームに複数の独立したサンプルが必要であり、データに大きくばらつきが生まれます。この方法は、クロロフィル、脂質、代謝産物、タンパク質、およびデンプンをモデルの緑色藻類、クラミドモナス・reinhardtiiの単一サンプルから同時に抽出するための堅牢で高スループットの戦略を提供します。

クロロフィル、脂質、代謝産物抽出のために、採取したクラミドモナス細胞ペレットのチューブを液体窒素に配置する。20度抽出バッファー1の1ミリリットルで各チューブ内のペレットを再懸濁します。低粘度抽出バッファーの蒸発を避けるために、細胞が抽出混合物内で均質化されるまでチューブを素早くボルテックスし、溶液を 2 つのミリリットルマイクロ遠心分離管にアリコートします。

氷冷水の超音波浴で培養物を10分間超音波処理してから、1分あたり1,000回転の軌道シェーカーで摂氏4度で60分間培養します。インキュベーションの終わりに、抽出バッファー2の650マイクロリットルを加え、遠心分離の前にサンプルを短時間渦に入れる。分画をアリコートするには、上のMTBE脂質相の500マイクロリットルを標識された1.5ミリリットルチューブに移す。

200マイクロリットルピペットを使用して脂質相を除去し、低極性および半極代謝物相の650マイクロリットルを新しい標識チューブに移します。余分な体積を吸引し、残りの低相を除去し、固体ペレットを液体窒素中に凍結して80度保存する。極性代謝物の定量のために、カルボニル基のメトキシマイメーション用メトキシアミン塩酸塩ピリジン溶液中の極相の乾燥ペレットを再懸濁し、30°Cで試料を摂氏30度で90分間加熱する。

インキュベーションの終了時に、標準プロトコルに従って37°Cで30分間、n-メチル-n-トリフルオレアセトアミドでサンプルを誘導体化します。一次代謝産物を分析するために、飛行時間の質量分析に結合されたガスクロマトグラフィーを使用してください。非極性代謝物の決定のために、非極相の乾燥ペレットを、アセトニトリルをイソプロパノールに容積し、遠心分離によってペレットを沈沈させる7〜3体積の混合物で再懸濁する。

次に、超高性能液体クロマトグラフィーシステム上の逆相C8カラム上のサンプルを分離します。クロロフィル含量の測定のために、MTBE相の100マイクロリットルを900マイクロリットルの900マイクロリットルのメタノールと混合し、実験サンプルと同様にブランクの方法を作ります。次に、分光光度計の吸光度を655および652ナノメートルの波長で測定してクロロフィルaとクロロフィルbを区別し、クロロフィルaおよびb含有量と総クロロフィル含有量を計算します。

タンパク質抽出のために、200マイクロリットルのタンパク質バッファーに低相ペレットを溶解し、室温で30分間サンプルをインキュベートします。インキュベーションの終わりに、サンプルを遠心分離し、タンパク質含有上清を新しいチューブに移す。ブラッドフォードアッセイを用いてタンパク質濃度を測定する。

タンパク質を消化するには、5ミリモルジチオトライトール中のサンプル15マイクログラムを30分間減らし、続いてアルキル化を10ミリモルヨードアセトアミドを室温で30分間、光から保護する。アルキル化の終わりに、トリプシン/Lys-C溶液をプロテアーゼ比に対して25~1タンパク質で混合し、37°Cで3時間インキュベートします。サンプルを50ミリモルトリスHclで6倍に希釈し、摂氏37度で一晩インキュベーションします。

翌朝、トリフルオロ酢酸で消化を0.5~1%の最終濃度に終了し、サンプルを乾燥に近い状態に濃縮し、加熱せずに真空濃縮器に2~5マイクロリットルの溶液を残します。読み込みバッファでサンプルを再中断します。ナノ超高圧液体クロマトグラフィーシステムに接続された高解像度質量分析計を用いて、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法によりペプチド混合物を分析します。

ペプチドを分離するには、4マイクロリットルのサンプルを20センチメートルの逆相荷電面ハイブリッドカラムに積み込み、内径は75マイクロメートル、粒子サイズは1.7マイクロメートルです。部分的ループオフライン設定を使用して、ループが列のオンライン位置にシフトされる前に14分間保持されるバッファBの3%に設定された部分ループオフライン設定を使用し、その後、20%バッファBに達するまで50分間線形に勾配が増加します。細胞体積の変化は、細胞が光相を通して大きくなるにつれて観察され、その後、10時間から光相の終わりから始まる娘細胞の放出が続く。

すべての娘細胞が放出されると、新たに放出された娘細胞が次のサイクルを開始するために処分されるため、細胞体積の変化が観察される。極性分率のガスクロマトグラフィー質量分析に基づいて、本代表的実験において、65の代謝産物にアノメーションを行った。液体クロマトグラフィーの質量分析分析は、脂質含有中性相の分析により、様々な脂質クラスをカバーする204種の異なる脂質種の同定につながった。

主成分分析は、メタボロミクスとリピドミコデータの両方に対して観察された半周期相と同様に、光と暗い相の分離を用いて、細胞周期全体の代謝産物および脂質のグローバルシフトを可視化するために使用することができる。ここで、2,463個の機能性富化の概要を示す富化タンパク質が示されている。タンパク質抽出後の残りのペレットは、様々な複製物の中で低い標準偏差によって示されるように、デンプンの再現性定量に使用することができる。

これは、溶媒中のクロロフィルのレベルに影響を与え、サンプルの正規化係数に影響を与える可能性がありますので、上部クロロフィル有機相の乾燥を避けるために重要です。抽出した分子種の生化学的特徴付けのために、様々な分析手順を実施することができる。