強化された神経化学的検出のための金ナノ粒子修飾炭素繊維マイクロ電極
2019年5月13日
本研究では、炭素繊維マイクロ電極を金ナノ粒子で改変し、神経伝達物質検出の感度を高める。
この方法は、神経化学的検出のインビボ法を潜在的に強化することができる高い空間および時間的分解能で神経化学的検出を可能にするため、有意である。この技術の主な利点は、それは、神経伝達物質検出の感度と時間的解像度を高めるために迅速で簡単かつ再現可能な方法です。この手順のデモンストレーションは、サヌジャ・モハナラジとポーリーン・ウィネンバーグ(私の研究室の大学院生)です。
まず、炭素繊維材料を個々のストランドに分離し、単一の7マイクロメートル直径の炭素繊維をストランドから引き出します。真空ラインをホウケイ酸ガラスキャピラリーに接続し、炭素繊維をキャピラリーに吸引します。その後、10センチメートルを25センチメートルの段ボールで切断し、電極ホルダーとして機能します。
サポートとして段ボールの周りにペーパータオルをテープで貼り付け、キャピラリーを電極ホルダーに挿入し、垂直キャピラリープーラーで慎重に固定します。ガラスのキャピラリーを電極材料用の細かいテーパーに引っ張って起動するようにキャピラリープーラーを構成します。引っ張りが終了し、加熱コイルが冷却されたら、チューブプル電極を接続する炭素繊維を切断します。
細管の引き手から微小電極を慎重に取り外します。ステレオスコープまたは顕微鏡によって導かれ、鋭い刃または外科用はさみを使用して、各電極の突出した炭素繊維を約100〜150マイクロメートルの長さにトリミングする。次に、25ミリリットルのバイアルで、綿棒を使用して10グラムのエポキシと0.2ミリリットルの硬化剤を混合する。
アセトンで別のバイアルを充填します。各電極について、炭素繊維チップをエポキシに15秒間浸し、アセトンに3秒間浸して余分なエポキシを取り除きます。エポキシ化後、エポキシ電極を125°Cで3時間オーブンで硬化させる。
次に、マイクロマニピュレーターを使用して、0.1モルの塩化カリウム中のクロロアウリン酸の0.5ミリモル溶液に銀銀塩化物参照電極に炭素繊維微電極を配置します。電極を、働く電極として炭素繊維マイクロ電極を使用してポテンショスタットに接続します。電極堆積を行うために、10サイクル/秒あたり50ミリボルトで0.2ボルトからマイナス1ボルトまで電極をスキャンします。
金のコーティングを堆積するためのパラメータを最適化することが重要です。コーティングが多すぎるとノイズや信号の過負荷が発生し、コーティングが少なすぎると神経化学的検出が強化されません。試験の前に、過塩素酸中のドーパミンの10ミリモルストック溶液と脱イオン水中のpH 7.4 PBSベースの緩衝液の約1リットルを調製する。
1マイクロモルドーパミン溶液を作るために10ミリリットルのバッファーにドーパミンストック溶液のピペット1マイクロリットル。次に、炭素繊維マイクロ電極と塩化銀銀参照電極をポテンショスタットに接続します。フローセル装置のヘッドステージで炭素繊維電極と参照電極を固定し、マイクロマニピュレータを使用してフローセルに下げます。
60ミリリットルのPBSバッファーを注射器に引き込みます。フローセルにバッファを充填し、シリンジポンプにシリンジを取り付けます。毎分1ミリリットルの速度でフローセルを通してバッファを流し始めます。
次に、ポテンショスタットを10ヘルツでマイナス0.4ボルトから1.3ボルト、毎秒400ボルトでスキャンするように設定します。マイクロ電極に波形を短時間適用し、オシロスコープを観察し、過負荷を防ぐためにゲインを調整します。マイクロ電極を緩衝液中で10分間平衡させます。
次に、希釈したドーパミン溶液をシリンジに引き込み、フローセルの注入口に接続します。ポテンショスタットの合計実行時間を 30 秒に設定します。測定の記録を開始し、10秒待ってから、0.2ミリリットルのドーパミン溶液をフローセルに注入します。
実行が終了したら、高精細サイクリック・ボルタンメトリー解析ソフトウェアを使用してデータを処理します。マイクロ電極を10分間再平衡化してから、別の試験を行います。テストが終了したら、3ミリリットルの水と3ミリリットルの空気をバッファーと注入ポートに3回注入してフローセルを洗浄します。
被覆炭素繊維を走査型電子顕微鏡で画像化した。金ナノ粒子コーティングの厚さおよび粒子サイズは、電極堆積時間によって制御することができる。20分間の電極堆積は鋭い隆起を伴う厚い金のコーティングを生み出し、5分は薄い均一な金のコーティングを生み出した。
炭素繊維マイクロ電極を被覆した金ナノ粒子は、未改変電極よりもピーク酸化電流が著しく高く、電子移動速度が速い。この金ナノ粒子コーティングは、ドーパミンの溶液中でここで示されるように、電極応答の安定性に有意な影響を及ぼさなかった。裸と金のナノ粒子コーティングされた電極の両方が、金被覆電極の変化の大きさがはるかに大きいスキャン速度の変化に直線的に反応した。
これは、ドーパミン吸収がスキャン速度を介して制御できることを示した.裸と金のナノ粒子コーティング電極の両方が100ナノモルから10マイクロモルのドーパミン濃度の間で直線的に反応した。より高い濃度で漸近曲線が観察された、ドーパミンが電極表面で過飽和であることを示す。
より速い時間スケールで、より高い感受性で神経化学的変化を検出する能力は、神経科学の複雑な質問に答えるのに役立ちます。この方法は、分析化学、メタボロミクス、および環境科学にも使用されています。学ぶことは簡単ですが、微小電極の作成、修正、テストを行う上で、視覚的な実証は重要です。
この方法の今後の方向性は、特定の神経伝達物質の検出を最適化するために厚さ、サイズ、形状、および形態を考慮して金および他のコーティングの堆積を調整することを含む。研究者は、この技術を試す前に顕微鏡の下で小さな繊維を扱う練習をする必要があります。また, 神経伝達物質のストック溶液は、彼らが使用するので、ヒュームフードで準備する必要があります 1 モル過塩素酸.
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概要
本研究では、金ナノ粒子を用いてカーボンファイバーマイクロ電極を修飾することにより、神経伝達物質検出の感度を高める方法を提示します。この手法により、高い空間的および時間的分解能での神経化学的検出が可能となり、in vivoでの検出方法を向上させる可能性があります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 電気生理学
- 神経化学
背景
- 炭素繊維マイクロ電極は、神経伝達物質の検出に広く利用されています。
- 正確な神経化学的測定を行うには、感度の向上が不可欠です。
- 金ナノ粒子を用いることで、これらの電極の性能を向上させることができます。
- in vivo研究においては、高い空間分解能と時間分解能が極めて重要です。
研究目的
- カーボンファイバーマイクロ電極を修飾するための再現性のある手法を開発すること。
- 神経伝達物質検出の感度および時間分解能を向上させること。
- 研究室の大学院生を用いて、その手順を実証すること。
使用した手法
- カーボンファイバー素材を個々のストランドに分離する。
- ストランドから直径7 µmの単一のカーボンファイバーを抽出する。
- ホウケイ酸ガラスキャピラリーに真空ラインを接続し、カーボンファイバーを吸引する。
- セットアップの電極ホルダーとしてカードボード片を使用する。
主な結果
- 修飾電極により、神経伝達物質の検出感度が向上した。
- この手法は迅速かつ簡便で、再現性があった。
- 神経化学的検出において、高い空間分解能および時間分解能が達成された。
- 大学院生によって、この手順が正常に実演された。
結論
- 金ナノ粒子によるカーボンファイバーマイクロ電極の修飾は有効である。
- この手法により、神経化学物質の検出能を大幅に向上させることができる。
- 今後の応用として、in vivoでの神経化学的測定の改善が期待される。
よくある質問
業界における実用的意義
神経化学的検出の感度と時間分解能を向上させることは、神経伝達物質のダイナミクスをより信頼性高く測定することを可能にし、CNS（中枢神経系）創薬における初期段階のターゲットバリデーションを支援します。カーボンファイバーマイクロ電極への金ナノ粒子修飾は、SN比と電子伝達速度を改善し、神経疾患の前臨床モデルにおける予測の信頼性を向上させます。この進歩は、脳卒中、虚血、うつ病などの疾患モデルにおけるドーパミンシグナル伝達経路に関連する治療仮説のリスク低減に寄与します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期発見とターゲット検証
- 科学的価値： 高速な神経化学的変動の検出能を向上させることで、ドパミン仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値： 再現性のある電極調製法を提供し、一貫したin vitroおよびex vivoの神経伝達物質モニタリングを実現する。
- 予測的価値： 低存在量の神経伝達物質の変化に対するアッセイ感度を向上させ、ターゲットエンゲージメント解析を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 神経伝達物質濃度と相関する定量的な酸化電流の読み取り値を生成します。
- 運用上の価値： 4時間にわたって安定した電極応答が得られ、長時間のスクリーニングセッションが可能です。
- アッセイの有用性： 低い検出下限と高速な電子伝達キネティクスを実現し、ハイスループットな神経化学スクリーニングを可能にします。
翻訳・前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性：本研究で引用されている、脳卒中、虚血、および薬物乱用のげっ歯類モデルにおける神経化学的測定をサポートします。
- メカニズム面でのリスク低減：疾患モデルにおいて、電気化学的信号と行動学的アウトカムとの相関分析を可能にします。
- 前臨床モデルへの適合性：中枢神経系（CNS）活性化合物の評価に用いられるシステムにおいて、検出精度を向上させます。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、信頼性の高い神経化学的な読み出しメカニズムを提供することで、ターゲットの検証からリード最適化に至る創薬ワークフローに適合します。
- 発見生物学：時間分解能の向上により、神経伝達物質の放出および再取り込みメカニズムに関する仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：一貫した金ナノ粒子堆積プロトコルを通じて、アッセイの標準化を可能にします。
- 分析：化合物の効果を評価するための定量的エンドポイントとして、ピーク酸化電流およびピーク分離（ΔEP）を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：疾患関連モデルにおける神経化学的トラッキングを可能にすることで、前臨床段階への連続性を確保します。
- エンタープライズでの再利用：複数の神経伝達物質や実験パラダイムに適応可能なプラットフォーム技術を確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：感度の向上と電子伝達速度の高速化により、急速な神経化学的イベントの検出能が向上します。
- 運用上の価値：再現性のある作製法と4時間の安定性により、一貫したラボのスループットが維持されます。
- 戦略的価値：ターゲットバリデーションにおける生物学的な偽陰性を減らし、Go/No-go判断の精度を向上させます。
- ポートフォリオへの影響：堅牢な神経化学的フェノタイピングに基づき、リスク調整されたCNSターゲットの優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- 高速走査サイクリックボルタメトリーなどの、微細加工および電気化学的手法の専門知識が必要です。
- 金ナノ粒子の塗布には、ポテンショスタット、マイクロマニピュレーター、および電析装置が必要です。
- コーティング厚を制御し、信号ノイズを避けるために、電析時間の標準化が必要です。
- 過塩素酸などの有害試薬を取り扱うため、ドラフトチャンバーの使用と安全トレーニングが必須です。
- カーボンファイバーが脆弱であるため、破損を防ぐために顕微鏡下での慎重な操作が求められます。
