^[11C]SNAP-7941の自動合成とリアルタイム運動評価の技術的側面

カーボン-11の放射標識は、分子を変更することなく、陽電子放出断層撮影またはPETに使用される小さな化合物を可能にします。これは、受容体の発現レベルを調査するために不可欠です.カーボン11放射標識の利点は、PETを使用して、メラニン濃縮ホルモン受容体に対するSNAPの結合運動をリアルタイムで直接評価できることです。

メラニン濃縮ホルモン受容体拮抗薬としてのSNAPは、この受容体の理解と肥満や糖尿病などの代謝条件との関連に貢献します。.血液脳関門で発現した流出トランスポーターは、中央受容体発現イメージングのための放射性医薬品の使用を著しく妨げる可能性がある。したがって、インビトロでトレースを評価することが重要です。

SNAPの自動放射合成は、容易に評価可能なメチル基を有する放射標識低分子量化合物に広く適用可能である。いったん確立されると、この手順は、他の化合物に適合させることができる。デモンストレーションを支援する上級博士課程の学生サラ・プファフとテレサ・バルバーです。

カーボン11 SNAP合成を開始するために、適切な試薬と材料を用いたクリーンカーボン11自動合成モジュールを設置しました。システムチェックとコンディショニングから始まるモジュールコンピュータ上でSNAP合成プロセスを開始します。モジュールがC-11の配達の準備が整う約30〜40分前に、サイクロトロン上のC-11二酸化炭素ターゲットを選択し、65マイクロアンパーでビームを開始します。

モジュールが配達の準備ができたら、内側の窓と外側のドアを閉じます。CO2トラップが最低40度まで冷却され、メタントラップが冷却を開始したことを確認します。サイクロトロンが約120ギガベクレルのC-11 CO2を生産したら、モジュールソフトウェアでOKをクリックして、CO2トラップを通してターゲットからのパスを開きます。

サイクロトロンコンピュータでC-11 CO2をモジュールに供給し始めます。モジュールコンピュータでの活動転送を監視し、3分後にメタンへのCO2削減に進みます。得られたメタンがメタントラップに流され、ヨウ素オーブンを通して循環することによってヨウ化メチルに変換される過程を監視する。

副産物がヨウ化メチルトラップから排気に流され、反応器が活動を受ける準備ができていることを確認するために、変換シーケンスの最後に[OK]をクリックして待機します。ヨウ化メチルがトラップから放出され、メチルトリレートオーブンを通って洗い流され、反応器に閉じ込められたようにシステムを監視します。原子炉台地における活動が完了したことを確認する。反応混合物が摂氏75度で3分間反応する間待ちます。

その後、反応混合物が摂氏35度以下に冷却され、1.5ミリリットルの水で消光されるようにシステムを監視します。反応混合物がHPLC注入ループにロードされ、半準備HPLCカラムに注入されるようにシステムを監視します。クロマトグラフィーが進むにつれて、UVおよびガンマ検出器のトレースを確認してください。

製品のピークが手動で現れ始めると、モジュール内の丸底コレクションフラスコで製品の収集を開始します。ガンマ信号が毎秒約400カウントを下回ったときに、手動で収集を終了します。製品がヘリウム圧下の固相抽出カートリッジに積み込まれると、丸底フラスコの流体レベルを確認してください。

フラスコが空になり、液体が SPE カートリッジを通過したら、[OK] をクリックしてカートリッジに閉じ込められた製品の洗浄を開始します。次に、製品がカートリッジからバイアルに溶出し、その後0.9%の生理液で希釈されるので、製品コレクションバイアルの活性を監視します。製品溶液がヘリウム圧下で滅菌フィルターを介して製品バイアルに移されるのを見てください。

転送が完了したら、製品出力バルブを閉じます。放射性トレーサーが製品バイアルに到着すると、絶対放射性収量を測定する。次に、リードシールドシリンジを使用して、トレーサーの100マイクロリットルを小さなバイアルに移して品質管理を行います。

品質管理サンプルをシールドされた品質管理作業領域に持ち込みます。40マイクロリットルのQCサンプルをガス密着シリンジに引き上げ、分析カラムを装備した準備されたHPLC機器に積み込み、製品を注入します。HPLCの実行中に他の品質管理測定を行います。

HPLCの実行が終了したら、放射能検出器からクロマトグラムのすべてのピークを統合し、SNAP無線化学純度が95%以上であるかどうかを判断し、UVクロマトグラムのピークを統合して製品の化学的純度を決定します。UV 積のピークの下の領域を使用して、特定のアクティビティを計算します。使用要件を満たすように製品が確認されたら、無線トレーサーをリアルタイムの運動実験ラボにリリースします。

実験の少なくとも30分前に、調製した野生型またはトランスフェクション細胞をDPBSで洗浄し、2ミリリットルの無血清増殖培地を添加する。トランスフェクトされた細胞をブロックするには、ジメチルスルホキシドのラセミベラパミル塩酸塩の20.4ミリモル溶液の0.98マイクロリットルを追加します。斜め平面上の細胞を30分間インキュベートします。

次に、リアルタイムアッセイ装置と関連するコンピュータの電源を入れます。コントロールソフトウェアを開き、ターゲットを1つ選択します。位置数を2に、検出時間を3秒に、検出遅延時間を2秒に、第1フェーズの名前をベースラインに設定します。

下側のセルポールを使用して、デバイスの傾斜支持に細胞培養皿を挿入します。細胞極が細胞培養培地で覆われていることを確認します。10 分間のバックグラウンド測定を開始し、ファイル名とパスを設定します。

時間スケールを分に、核種コレクションをカーボン-11に設定します。背景、ターゲット、および背景から減算されたターゲットデータを表示するようにグラフを設定します。無線トレーサーが配達され、使用のために承認されたら、アッセイのための小さいサンプルを取る。

無線トレーサー溶液の必要な容積を計算し、ピペットを準備する。計測器ソフトウェアでは、実行を一時停止し、皿の回転が停止するのを待ちます。デバイスの蓋を開き、サポートを左に90度回し、準備されたピペットで無線トレーサーを追加し、デバイスを初期位置に戻します。

装置の蓋を閉じて、すぐに実験を再開します。実験を終了する前に20分間実行します。データを処理して分析し、細胞内のSNAP取り込み値を評価します。

DMSO処理したコントロール細胞培養皿および野生型細胞株に対して手順を繰り返すことができる。リアルタイム運動アッセイは、野生型細胞を発現する非PGP、ベラパミルをPGP阻害剤としてプレブロックしたPGP発現細胞、およびブロック解除されたPGP細胞で行った。非処理細胞と車両処理細胞との間に有意差は認められなかった。

炭素-11SNAPは、PGP発現細胞では蓄積が認められなかった一方で、野生型細胞に急速に蓄積した。ベラパミルを用いたPGP流出トランスポーターを事前遮断すると、野生型細胞に匹敵するPGP細胞におけるSNAP蓄積が生じる。リアルタイムの運動測定と組み合わせて、このセットアップは、低分子量化合物の薬物動態の広い理解を可能にし、したがって、放射線医薬品の前臨床開発のために非常に重要です。

タイミングと組織は、カーボン-11の半減期はわずか20分であるため、その後のリアルタイム運動実験で成功したカーボン-11放射合成の主な成分です。炭素-11の短い半減期のために、この手順の多くの部分が同時に行われる。関係者全員が役割の範囲とタイミングを理解することが重要です。

製品の安全性と放射線防護は、いずれも放射性医薬品の製造の鍵となります。すべての実験は、オペレータの放射線被ばくを制限するために、合理的に達成可能な低いか、ALARA原則に従わなければなりません。