Name: 11C SNAP-7941の自動合成とリアルタイム運動評価の技術的側面 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: 学ぶ [11C]SNAP-7941の自動放射化学合成とリアルタイムPETイメージングによる結合動態評価法。P-糖タンパク質発現細胞を用いたin vitroアッセイで、受容体発現レベルの定量的解析と放射性医薬品の薬物動態理解に貢献します。

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この研究は、オーストリア科学基金(FWF P26502-B24、M.ミッターハウザー)によって支援されました。T.ゼンツとA.クルカルの技術サポートに感謝しています。さらに、我々は、前駆体を配布するためのAgOTfとH.スプレイツァーの準備のためにK.Pallitchに感謝します。

<ol><li>Saito, Y., Maruyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+melanin-concentrating+hormone+receptor+and+its+impact+on+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Identification of melanin-concentrating hormone receptor and its impact on drug discovery.</a> Journal of Experimental Zoology. 305, 761-768 (2006).</li>
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<li>Larsen, P., Ulin, J., Dahlstrøm, K., Jensen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+%5B11C%5Diodomethane+by+iodination+of+%5B11C%5Dmethane%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Radiation+and+Isotopes%22%5BJournal%5D)">Synthesis of [11C]iodomethane by iodination of [11C]methane.</a> Applied Radiation and Isotopes. 48, 153-157 (1997).</li>
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</ol>

何も開示することはない

[11C]SNAP-7941の無線合成は、市販の合成モジュール上に確立された。準備手順を完全に自動化する可能性があるため、放射線合成は信頼性が高く、オペレータの放射線保護に関する改善が実現しました。シンセサイザーの調製は、特にモル活性の面で、放射線トレーサーの品質に大きな影響を与えます。したがって、常に不活性条件下(例えば、ヘリウム雰囲気)下で作業し、反応容器の前に位置するすべてのラインをフラッシュすることが不可欠である(標的線、[11C]CH3 I I生産サイクルおよび反応器)。また、合成開始前にそれぞれのトラップやオーブンを加熱して水分や大気中の炭素を除去すると、モル活性が有利に増加する。特にAgOTfカラムは、黒鉛炭素を含浸させ、湿度に非常に敏感です。水分の任意の任意の量であっても[11 C]CH3Iから[11 C]CH3OTfへの変換を妨げる。合成を開始する前に、[11 C]CO2トラップと[11 C]CH3Iトラップは、その後のトラップを可能にするために再び室温まで冷却する必要があります。 さらに、合成を開始する直前に前駆体を溶解し、前駆体溶液に直接塩基を加えるのが推奨される。
カーボン11放射レーサーの品質管理は、連続的かつ高速なワークフローのために合理的に設計する必要があります。しかし、細胞培養研究の最も重要なパラメータは、有効な結果を得るために放射化学的純度とモル活性です。モル活性の正しい評価は、堅牢な分析HPLC法を必要とし、較正曲線は最終製品の濃度範囲をカバーする必要があります。放射線トレーサーにとって難しいのは、放射線合成時に生成される少量の定量(LOQ)の限界を超える濃度を達成することです。したがって、当技術技術は、受容体飽和を回避するための高いモル活性と非放射性信号を定量することができる十分な濃度との間のバランスを見出す。
[11C ]SNAP-7941は、急速な流出による未処理または車両処理MDCKII-hMDR1細胞に蓄積が認められなかったため、ヒトP-gpトランスポーターの強力な基板であることが確認された。対照的に、両方の実験セットアップ(MDCKII-WTまたは前ブロックMDCKII-hMDR1細胞)は、同様の結果([11C]SNAP-7941の蓄積)を提供し、このインビトロアッセイの汎用性を支持した。MDCKII-hMDR1細胞は、回転細胞培養皿によって引き起こされるせん断ストレスに対する安定したトランスフェクション、急速な成長および持続性のためにリガンドトレーサー実験に非常に適しています。したがって、ラットおよびマウス脳における[11 C]SNAP-7941の取り込みの欠如は、P-gpトランスポーターを介した流出によって引き起こされる可能性がある。ヒト多剤耐性タンパク質1(hMDR-1、P-gp)を有するイヌ腎細胞のトランスフェクションにより、ヒトにおける流出トランスポーター結合に対するこの方法の予測値は高く、将来の臨床応用の観点から有利である。しかし、これまでのところ、他の流出トランスポーターに対する選択性は検証されなかった。したがって、他の細胞株を使用することができ、乳癌耐性タンパク質(BCRP)または多重耐性タンパク質-1(MRP-1)として異なる顕著な流出トランスポーターを発現し、これらのトランスポーターに対する相互作用を研究する。この方法は、古典的な蓄積または輸送アッセイと比較して非常に簡単であり、即座に定性的な結果を与える。また、この技術は、間接定量(主に変位)を用いた従来の実験とは対照的に、PETトレーサーとターゲットとの直接的な相互作用をリアルタイムで評価できるという最大の利点があります。さらに、リアルタイムの放射性アッセイソフトウェアは、実験的な柔軟性(例えば、核化崩壊補正、測定時間と位置など)を提供し、したがって、ユーザーのための高い自由度を提供します。一方、この方法の制限には、一度に1つのセル皿しか測定できないため、サンプルスループットが低い。さらに、いくつかの他の技術的および運用上の問題を考慮する必要があります:記載された技術は、バックグラウンド放射線に非常に敏感です。したがって、放射線源は距離を保ち、実験の前に背景測定に重点を置くべきである。室温よりも高い温度での実験に関するもう一つの問題は、傾斜支持体の加熱である:細胞培養培地の蒸発が検出器に影響を与える可能性がある。加熱の代わりに、装置全体がインキュベーターに入れられるのが好ましい。また、この方法は付着細胞株に限定される。細胞培養皿の回転を通じて、せん断ストレス感受性細胞が皿から剥離し、無効な結果を引き起こす可能性があります。
それにもかかわらず、実験者がこれらのマイナーな欠点に注意を払う場合、この方法は前臨床PET-トレーサーの運動挙動の分析のための迅速かつ信頼性の高い結果を提供する。

[11C ]SNAP-7941は、メラニン濃縮ホルモン受容体1(MCHR1)を標的とする最初の陽電子放射断層撮影(PET)トレーサーとして進化した- 主に食欲と食物摂取1の中心調節に関与する受容体。よく特徴付けられたMCHR1アンタゴニストであるSNAP-7941のカーボン-11ラベリングは、本物のPETトレーサー2、3、4、5を生み出した。しかし、完全に自動化された放射線合成は、20分6の半減期を提供する短命放射性核種炭素-11との時間の有効性および再現性の点で非常に挑戦的である。全体的な合成時間は最小限に抑えるべきであり、経験則として、2-3の半減期(すなわち、炭素-11の約40-60分)7を超えてはなりません。特に、発現密度の低い受容体系を標的とする放射線トレーサーの合成手順は、十分な収率を得るために広範囲に最適化されなければならず、その結果、高いモル活性8を得る必要がある。合成戦略は、多くの場合、サイクロトロン内の放射性核種の生産に続き、[11 C]CO2をシンセサイザーに放出する。そこで、[11C]CO2は、まず[11C]CH4に還元され、その後ヨウ素と反応して[11C]CH3Iをガス相法9、10を介して収量する。さらに、銀のトリフレトリレートでの処理は、直接オンラインで[11 C]CH3OTfを得る。その後、この反応性炭素-11標識中間体は、前駆体分子を含む溶液に導入される。自動化された放射線合成は、さらに前臨床および臨床研究に適した製品のその後の製剤を含む半準備RP-HPLCによる精製プロセスを含む。
放射性核種の半減期と放射線合成の時間の労力にかかわらず、放射性医薬品の薬物動態はPETトレーサー開発中に評価されるべき最も重要な部分である。神経イメージングの面では、PETトレーサーの脳のエントリが主な前提条件です。しかし、脳の「セキュリティ境界」である血液脳関門(BBB)は、低分子(PETトレーサーなど)をアンロードし、その適用性を効率的に妨げる流出トランスポーターを高く発現します。
前臨床評価中の大きな欠点は、インビトロ実験でしばしば認識されず、[11 C]SNAP-7941で観察されるように、生体内のPETトレーサーの障害につながるこれらの流出トランスポーターに対する予期しない相互作用です。ラットにおけるμPETイメージングは、低脳蓄積を実証し、これはP-gp阻害剤タリキダー11の投与後に劇的に増加した。これらのデータは[11C]SNAP-7941が中央MCHR1へのリガンド結合を妨げるこの流出トランスポーターシステムの基板であることを示唆した。残念ながら、トレーサー開発の初期段階でBBB浸透の予測を可能にする十分なインビトロモデルがまだ不足しています。
ここでは、炭素11メチル化のためのシンセサイザーを用いて[11 C]SNAP-7941の自動合成について説明する。本研究の重点は、自動合成、品質管理、および非常に短命な核種炭素11を用いた連続したインビトロ評価を含む連続的な実験的アプローチを整理する方法の概要を提供することです。
まず、最小限の時間の支出と最大収率で放射線合成を成功させるための重要なステップについて説明する。次に、信頼性の高い品質管理手順が設定され、放射線トレーサーを潜在的な臨床研究に利用できるようにし、欧州薬局方12の基準を満たす。それぞれのモル活性のモル濃度および計算の定量化は、連続する運動測定に不可欠な要件である。
最後に、流出トランスポーターP-gp(hMDR1)に対する[11C]SNAP-7941の相互作用を評価する新しい簡単なインビトロ法が提示される。提案された運動モデルは、即時のデータ解釈を可能にし、最小限の細胞培養努力を必要とする扱いやすいデバイスを使用しています 13.

<table><tbody><tr><td>表1:[11C]SNAP-7941</td><td></td><td></td><td></td>Ni触媒の完全自動放射性合成の材料と機器のリスト</tr> <tr><td></td><td>島津町、京都、日本</td><td></td><td>シマリルテNi還元、80/100メッシュ</td></tr><tr><td>ヨウ素</td><td>メルク、ダルムシュタット、ドイツ</td><td></td><td>1.04761.0100</td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>メルク、ダルムシュタット、ドイツ</td><td></td><td>DNA合成用、<10 ppm H2O</td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,</td><td></td> USA <td>HPLC グレード</td></tr><tr><td>酢酸アンモニウム</td><td>メルク, ダルムシュタット, ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>メルク, ダルムシュタット, ドイツ</td><td></td><td>氷河</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>メルク, ダルムシュタット, ドイツ</td><td></td><td>96%</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>B. Braun, メルズンゲン, ドイツ</td><td></td><td>0.9%</td></tr><tr><td>水酸化テトラブチルアンモニウム</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td></td><td>HPLC grade</td></tr><tr><td>SPE cartridge</td><td>Waters, Milford, MA, USA</td><td></td><td>SepPak C18plus</td></tr><tr><td>Semi-preparative RP-HPLC column</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td></td><td>Chromolith SemiPrep RP-18e, 100-10 mm</td></tr><tr><td>Precolumn</td><td>メルク、ダルムシュタット、ドイツ</td><td></td><td>クロモリスガードRP-18e、5-4.6 mm</td></tr><tr><td>前駆体</td><td>ウィーン大学、オーストリア</td><td></td><td>SNAP酸</td></tr><tr><td>参照化合物</td><td>ウィーン大学、オーストリア</td><td></td><td>SNAP-7941</td></tr><tr><td>銀トリフルオロメタンスルホン酸</td><td>Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graphpa GC</td><td>Alltech、ディアフィールド、イリノイ州、米国</td><td></td><td>80/100メッシュ</td></tr><tr><td>PET trace 860 cyclotron</td><td>GE Healthcare, Uppsala, Sweden</td><td></td><td></td></tr><tr><td>[11C]CO2 高圧ターゲット</td><td>Air Liquide, Vienna, Austria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRACERlabFX2 C</td><td>GE Healthcare, Uppsala, Sweden</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2 + 1% O2</td><td>Air Liquide, オーストリア、ウィーン</td><td>対象ガス</td>名会社カタログ番号コメント表2:[11C]SNAP-7941.Merck日立LaChromの品質管理の材料と機器のリスト、<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-7100</td><td>Hitachi Vantara Austria GmbH (オーストリア、ウィーン)</td><td></td><td>HPLC pump</td></tr><tr><td>Merck Hitachi, L7400</td><td>Hitachi Vantara Austria GmbH (Tokyo, Japan)</td><td></td><td>UV検出器</td></tr><tr><td>NaI-radiodetector</td><td>Raytest (Straubenhardt, Germany)</td><td></td><td>NaI-radiodetector</td></tr><tr><td>Chromolith Performance RP-18e, 100-4.6 mm</td><td>Merck (Darmstadt, Germany)</td><td></td><td>HPLCカラム</td></tr><tr><td>430-GC</td><td>Bruker (ブレーメン、ドイツ)</td><td></td><td>ガスクロマトグラフ</td></tr><tr><td>キャピラリーカラム ID-BP20; 12 mx0.22 mmx0.25 mm</td><td>SGE Ananlytical Science Pty. Ltd. (ビクトリア、オーストラリア)</td><td></td><td>ガスキャピラリー</td></tr><tr><td>Wesco, osmometer Vapro 5600</td><td>Sanoya Medical Systems (ウィーン、オーストリア)</td><td></td><td>Osmometer</td></tr><tr><td>g-spectrometer</td><td></td><td></td><td>g-spectrometer</td></tr><tr><td>ガスクロマトグラフィー制御ソフトウェア</td><td>VARIAN (米国カリフォルニア州パロアルト市)Galaxie</td><td></td> <td>Version 1.9.302.952</td></tr><tr><td>ガンマ分光計制御ソフトウェア</td><td>ORTEC (米国テネシー州オークリッジ)</td><td></td><td>Maestro for windows バージョン 6.06</td></tr><tr><td>ガンマスペクトル リコール ソフトウェア</td><td>ORTEC (米国テネシー州オークリッジ)</td><td></td><td>Winplotsバージョン3.21</td></tr><tr><td>HPLC制御ソフトウェア</td><td>Raytest(シュトラウベンハルト、ドイツ)</td><td></td><td>Gina Starバージョン5.9</td></tr><tr><td>inolab 740</td><td>WTW(ヴァイルハイム、ドイツ)</td><td></td><td>pHメーター</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>strongカタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>表3:[11C]SNAP-7941.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-hMDR1)</td><td>Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands)</td><td></td><td>の</td></tr><tr><td></td><td>リアルタイム動態挙動を評価するための材料および装置のリストNetherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands)</td><td></td><td>Wildtype (WT)</td></tr><tr><td>DMEM GlutaMAX</td><td>VWR International GmbH, Vienna, Austria</td><td></td><td>Gibco 61965-026</td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum (FCS)</td><td>VWR International GmbH, Vienna, Austria</td><td></td><td>Gibco 10270-106</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>VWR International GmbH, Vienna, Austria</td><td></td><td>Gibco 15140</td></tr><tr><td>細胞培養皿</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td><td></td><td>Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160</td></tr><tr><td>In vitro experiments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM GlutaMAX</td><td>VWR International GmbH, Vienna, Austria</td><td></td><td>Gibco 61965-026</td></tr><tr><td>(&plusmn;)-ベラパミル塩酸塩</td><td>Sigma Aldrich (米国ミズーリ州セントルイス)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich (米国ミズーリ州セントルイス)</td><td></td><td>276855-100 mL</td></tr><tr><td>細胞培養皿</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td><td></td><td>Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160</td></tr><tr><td>滅菌済み使い捨てプラスチックピペット</td><td>VWR International GmbH, Vienna, Austria</td><td></td><td>Sterilin, 5 mL &ndash; 25mL</td></tr>滅菌<tr><td>ピペットチップ</td><td>VWR International GmbH, ウィーン, オーストリア</td><td></td><td>Eppendorf epT.I.P.S.バイオプール20 & マイクロ;L &ndash;200 &micro;L</td></tr><tr><td>細胞培養フラスコ</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td><td></td><td>Cellstar 250 mL, 75 cm2 red フィルタースクリューキャップ, Mfr.No.658175</td></tr><tr><td>LigandTracer control Version 2.2.2</td><td>Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LigandTracer Yellow</td><td>Ridgeview Instruments AB、ウプサラ、スウェーデン。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LigandTracer White</td><td>Ridgeview Instruments AB、ウプサラ、スウェーデン。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 6.0</td><td>GraphPadソフトウェア株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ハンドヘルド自動セルカウンター</td><td>ミリポアコーポレーションビレリカMA01821</td><td></td><td>セプター(Cat.No.PHC00000)</td></tr><tr><td>セルカウンターセンサー</td><td>ミリポアコーポレーション ビレリカMA01821</td><td></td><td>セプターセンサー60 & マイクロ;m(Cat.No。PHCC60050)</td></tr></tbody></table>

[11c]snap-7941の自動合成とリアルタイム運動評価の技術的側面

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

陽電子放射断層撮影(PET)は、経路に関する洞察を提供し、生体内調査のために特定の標的放射性リガンドを使用する重要な分子イメージング技術です。このプロトコルの中で、メラニン濃縮ホルモン受容体1に対するアンタゴニストである[11 C]SNAP-7941の堅牢で信頼性の高い遠隔制御放射合成が記載されている。放射合成は、[11 C]CO2を産生したサイクロトロンから始まり、その後[11 C]CH3OTfへのガス相転移を介してさらに反応する。そして、この反応性中間体は、前駆体溶液に導入され、それぞれの放射トレータを形成する。化学的および放射性化学的純度はRP-HPLCによって決定され、放射性医薬品の品質管理プロセスで日常的に実施される。さらに、モル活性は、次のリアルタイム運動的調査の必要性として計算されます。さらに、[11 C]SNAP-7941は、細胞蓄積に対するP-糖タンパク質(P-gp)発現の影響を評価するためにMDCKII-WTおよびMDCKII-hMDR1細胞に適用される。このため、P-gp発現細胞株(MDCKII-hMDR1)は、P-gp基板(±)-ベラパミルを用いて実験前に遮断することなく使用され、その結果は野生型細胞に対して観察されたものと比較される。全体的な実験アプローチは、カーボン-11(半減期:20分)のような短命の核種で標識されたPETトレーサーを使用して、すべての前臨床および臨床研究に不可欠な正確な時間管理の重要性を示しています。

[11 C]SNAP-7941の完全に自動化された無線合成は、配合された製品の5.7 ±2.5 GBq(EOBで4.6±2.0%、14.9±5.9%、配合された製品のn=10)を得た。全体的な合成は約40分続き、ガス相法による[11 C]CH3OTfの調製に15分が必要であり、前駆体の放射線標識にはさらに5分が必要であり、続いて半準備の10分が続いた。Rp-HPLC精製およびC18カートリッジの固相抽出および製剤のための10分。その後、品質管理の責任者に小さなアリコート(約100~200μL)を納入し、すぐに使用可能なトレーサーを含む元の製品バイアルをリアルタイムキネティック解析の実験者に渡しました。
合成終了後10分以内に品質管理が完了した。モル活性は72±41 GBq/μmol(n= 10)の範囲にあり、放射化学的純度は常に&gt; 95%であった。他のすべてのパラメータ(pH、浸透性、残留溶媒)は、放出基準を満たした。リアルタイム運動アッセイでは、(A)処理および非処理(車両)MDCKII-WT細胞、(B)非処理または処理された車両MDCKII-hMDR1細胞および(C)リアルタイム前にブロッキングを伴う後者の細胞株の3つの異なる実験セットアップが選択された。(±)-ベラパミルを用いたトランスポーターの運動アッセイ。ワイルドタイプ細胞株MDCKII-WT(P-gp非発現)とMDCKII-hMDR1(P-gp発現)に適用すると、野生型細胞株への蓄積が速いのに対し、蓄積は認められなかったため、異なる運動挙動を示す。MDCKII-hMDR1 セル用。しかし、MDCKII-hMDR1細胞のP-gp流出トランスポーターを(±)-ベラパミルで遮断すると、野生型細胞株に対して既に見られるのと同等のリアルタイム運動性が生み出された(図5)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59557/59557fig1.jpg"> 図 1: 作業フローの概要。[11C]SNAP-7941のリアルタイム運動測定の放射線合成、品質管理、および性能の作業フロー。黒い矢印は、放射能の輸送方法を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59557/59557fig1large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59557/59557fig2.jpg"> 図2:自動シンセサイザーの放射合成スキーム。自動シンセサイザーのスイッチング回路は、[11 C]CH3 I/[11C]CH3OTf産生のための循環ユニットから始まり、前駆体溶液およびSPE精製に活性を導入するための反応器(SPE=固体位相抽出;PCV = 製品コレクションバイアル)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59557/59557fig2large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59557/59557fig3.jpg"> 図3:[11C]SNAP-7841の完全自動放射合成の代表的なクロマトグラム。半準備RP-HPLCクロマトグラムは、下部に精製した後の上部と分析用に示されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59557/59557fig3large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59557/59557fig4.jpg"> 図4:リアルタイム実験のための細胞培養皿調製ステップ1は、細胞タイプおよびその増殖速度に応じて2.5 x 105から1 x 106の播種を含む。続いて、培養皿は斜め平面(約30〜45°)に配置される。従って、供給された金属装置または細胞培養皿の蓋は、皿の傾斜位置を安定させるためにインキュベーターに使用することができる。翌日(24時間)に皿を水平に調整し、細胞表面を完全に覆う新鮮な細胞培養培地を添加する。実験当日、細胞生存率と合流性を調べる。実験プロトコルによれば、細胞をDPBSで洗浄し、培地を無血清培地(2mL)に置き換え、培養皿を実験開始まで斜め位置に再配置する。今後、細胞は阻害剤または車両で処理することができる。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59557/59557fig4large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59557/59557fig5.jpg"> 図5:[11 C]SNAP-7941のリアルタイム運動測定。[11C]SNAP-7941の代表的なリアルタイム運動学は、MDCKII-WT細胞を使用して3つの異なるセットアップで示されています。MDCKII-hMDR1細胞は、閉塞のないP-gp阻害剤およびMDCKII-hMDR1細胞として(±)-ベラパミルを前止しした。Y軸は、未処理または車両処理MDCKII-MDR1細胞の結果と比較して、前ブロックされたMDCKII-hMDR1およびWT細胞の増加率を示す(取り込みなし、0%)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59557/59557fig5large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、[11 C]SNAP-7941の完全に自動化された放射線標識と、P-gp発現および非発現細胞に対するこのPETトレーサーのリアルタイム運動学の分析のためのプロトコルを表す。

[11C]SNAP-7941の自動合成とリアルタイム運動評価の技術的側面

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands ...

カーボン-11の放射標識は、分子を変更することなく、陽電子放出断層撮影またはPETに使用される小さな化合物を可能にします。これは、受容体の発現レベルを調査するために不可欠です.カーボン11放射標識の利点は、PETを使用して、メラニン濃縮ホルモン受容体に対するSNAPの結合運動をリアルタイムで直接評価できることです。メラニン濃縮ホルモン受容体拮抗薬としてのSNAPは、この受容体の理解と肥満や糖尿病などの代謝条件との関連に貢献します。.血液脳関門で発現した流出トランスポーターは、中央受容体発現イメージングのための放射性医薬品の使用を著しく妨げる可能性がある。したがって、インビトロでトレースを評価することが重要です。SNAPの自動放射合成は、容易に評価可能なメチル基を有する放射標識低分子量化合物に広く適用可能である。いったん確立されると、この手順は、他の化合物に適合させることができる。デモンストレーションを支援する上級博士課程の学生サラ・プファフとテレサ・バルバーです。カーボン11 SNAP合成を開始するために、適切な試薬と材料を用いたクリーンカーボン11自動合成モジュールを設置しました。システムチェックとコンディショニングから始まるモジュールコンピュータ上でSNAP合成プロセスを開始します。モジュールがC-11の配達の準備が整う約30〜40分前に、サイクロトロン上のC-11二酸化炭素ターゲットを選択し、65マイクロアンパーでビームを開始します。モジュールが配達の準備ができたら、内側の窓と外側のドアを閉じます。CO2トラップが最低40度まで冷却され、メタントラップが冷却を開始したことを確認します。サイクロトロンが約120ギガベクレルのC-11 CO2を生産したら、モジュールソフトウェアでOKをクリックして、CO2トラップを通してターゲットからのパスを開きます。サイクロトロンコンピュータでC-11 CO2をモジュールに供給し始めます。モジュールコンピュータでの活動転送を監視し、3分後にメタンへのCO2削減に進みます。得られたメタンがメタントラップに流され、ヨウ素オーブンを通して循環することによってヨウ化メチルに変換される過程を監視する。副産物がヨウ化メチルトラップから排気に流され、反応器が活動を受ける準備ができていることを確認するために、変換シーケンスの最後に[OK]をクリックして待機します。ヨウ化メチルがトラップから放出され、メチルトリレートオーブンを通って洗い流され、反応器に閉じ込められたようにシステムを監視します。原子炉台地における活動が完了したことを確認する。反応混合物が摂氏75度で3分間反応する間待ちます。その後、反応混合物が摂氏35度以下に冷却され、1.5ミリリットルの水で消光されるようにシステムを監視します。反応混合物がHPLC注入ループにロードされ、半準備HPLCカラムに注入されるようにシステムを監視します。クロマトグラフィーが進むにつれて、UVおよびガンマ検出器のトレースを確認してください。製品のピークが手動で現れ始めると、モジュール内の丸底コレクションフラスコで製品の収集を開始します。ガンマ信号が毎秒約400カウントを下回ったときに、手動で収集を終了します。製品がヘリウム圧下の固相抽出カートリッジに積み込まれると、丸底フラスコの流体レベルを確認してください。フラスコが空になり、液体が SPE カートリッジを通過したら、[OK] をクリックしてカートリッジに閉じ込められた製品の洗浄を開始します。次に、製品がカートリッジからバイアルに溶出し、その後0.9%の生理液で希釈されるので、製品コレクションバイアルの活性を監視します。製品溶液がヘリウム圧下で滅菌フィルターを介して製品バイアルに移されるのを見てください。転送が完了したら、製品出力バルブを閉じます。放射性トレーサーが製品バイアルに到着すると、絶対放射性収量を測定する。次に、リードシールドシリンジを使用して、トレーサーの100マイクロリットルを小さなバイアルに移して品質管理を行います。品質管理サンプルをシールドされた品質管理作業領域に持ち込みます。40マイクロリットルのQCサンプルをガス密着シリンジに引き上げ、分析カラムを装備した準備されたHPLC機器に積み込み、製品を注入します。HPLCの実行中に他の品質管理測定を行います。HPLCの実行が終了したら、放射能検出器からクロマトグラムのすべてのピークを統合し、SNAP無線化学純度が95%以上であるかどうかを判断し、UVクロマトグラムのピークを統合して製品の化学的純度を決定します。UV 積のピークの下の領域を使用して、特定のアクティビティを計算します。使用要件を満たすように製品が確認されたら、無線トレーサーをリアルタイムの運動実験ラボにリリースします。実験の少なくとも30分前に、調製した野生型またはトランスフェクション細胞をDPBSで洗浄し、2ミリリットルの無血清増殖培地を添加する。トランスフェクトされた細胞をブロックするには、ジメチルスルホキシドのラセミベラパミル塩酸塩の20.4ミリモル溶液の0.98マイクロリットルを追加します。斜め平面上の細胞を30分間インキュベートします。次に、リアルタイムアッセイ装置と関連するコンピュータの電源を入れます。コントロールソフトウェアを開き、ターゲットを1つ選択します。位置数を2に、検出時間を3秒に、検出遅延時間を2秒に、第1フェーズの名前をベースラインに設定します。下側のセルポールを使用して、デバイスの傾斜支持に細胞培養皿を挿入します。細胞極が細胞培養培地で覆われていることを確認します。10 分間のバックグラウンド測定を開始し、ファイル名とパスを設定します。時間スケールを分に、核種コレクションをカーボン-11に設定します。背景、ターゲット、および背景から減算されたターゲットデータを表示するようにグラフを設定します。無線トレーサーが配達され、使用のために承認されたら、アッセイのための小さいサンプルを取る。無線トレーサー溶液の必要な容積を計算し、ピペットを準備する。計測器ソフトウェアでは、実行を一時停止し、皿の回転が停止するのを待ちます。デバイスの蓋を開き、サポートを左に90度回し、準備されたピペットで無線トレーサーを追加し、デバイスを初期位置に戻します。装置の蓋を閉じて、すぐに実験を再開します。実験を終了する前に20分間実行します。データを処理して分析し、細胞内のSNAP取り込み値を評価します。DMSO処理したコントロール細胞培養皿および野生型細胞株に対して手順を繰り返すことができる。リアルタイム運動アッセイは、野生型細胞を発現する非PGP、ベラパミルをPGP阻害剤としてプレブロックしたPGP発現細胞、およびブロック解除されたPGP細胞で行った。非処理細胞と車両処理細胞との間に有意差は認められなかった。炭素-11SNAPは、PGP発現細胞では蓄積が認められなかった一方で、野生型細胞に急速に蓄積した。ベラパミルを用いたPGP流出トランスポーターを事前遮断すると、野生型細胞に匹敵するPGP細胞におけるSNAP蓄積が生じる。リアルタイムの運動測定と組み合わせて、このセットアップは、低分子量化合物の薬物動態の広い理解を可能にし、したがって、放射線医薬品の前臨床開発のために非常に重要です。タイミングと組織は、カーボン-11の半減期はわずか20分であるため、その後のリアルタイム運動実験で成功したカーボン-11放射合成の主な成分です。炭素-11の短い半減期のために、この手順の多くの部分が同時に行われる。関係者全員が役割の範囲とタイミングを理解することが重要です。製品の安全性と放射線防護は、いずれも放射性医薬品の製造の鍵となります。すべての実験は、オペレータの放射線被ばくを制限するために、合理的に達成可能な低いか、ALARA原則に従わなければなりません。

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^[11C]SNAP-7941の自動合成とリアルタイム運動評価の技術的側面

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