Name: 骨格筋生検手順からのヒト筋前駆細胞の単離、培養、特徴付け、分化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 s
Description: 学ぶ骨格筋生検組織からヒト筋前駆細胞を単離・培養する方法。少量組織から高収率で細胞を取得し、増殖と分化能力を追跡することで筋再生メカニズムの解明に貢献します。

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著者らは、コーネル大学、バイオテクノロジー・リソース・センター・イメージング・ファシリティーが蛍光活性化細胞選別に協力してくれたことに感謝している。また、モリー・ゲラーが参加者募集に協力してくれたことに感謝し、エリカ・ベンダーが骨格筋生検を行った。最後に、参加者の時間と研究への参加に感謝します。この研究は、国立衛生研究所の高齢化に関する国立研究所の助成金番号R01AG058630(B.D.C.およびA.E.T.)の下で、グレン医学研究財団と米国若手教員のための老化研究助成金連盟(Bに対して)によって支援されました。.D.C.)、およびコーネル女性のための大統領評議会(A.E.T.に)によって。

<ol><li>Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+mass+and+distribution+in+468+men+and+women+aged+18-88+yr%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr.</a> Journal of Applied Physiology. 89 (1), 81-88 (2000).</li>
<li>D'Souza, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+satellite+cell+number+and+function+in+humans+and+mice+with+type+1+diabetes+is+the+result+of+altered+notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Decreased satellite cell number and function in humans and mice with type 1 diabetes is the result of altered notch signaling.</a> Diabetes. 65 (10), 3053-3061 (2016).</li>
<li>Scheele, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells+derived+from+Obese+humans+with+type+2+diabetes+and+differentiated+into+Myocytes+in+vitro+exhibit+abnormal+response+to+IL-6%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Satellite cells derived from Obese humans with type 2 diabetes and differentiated into Myocytes in vitro exhibit abnormal response to IL-6.</a> PLoS One. 7 (6), e39657(2012).</li>
<li>Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+capacity+of+human+muscle+progenitor+cells+differs+by+age%2C+sex%2C+and+metabolic+fuel+preference%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Expansion capacity of human muscle progenitor cells differs by age, sex, and metabolic fuel preference.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 315 (5), C643-C652 (2018).</li>
<li>Charville, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+expansion+and+in+vivo+self-renewal+of+human+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Ex vivo expansion and in vivo self-renewal of human muscle stem cells.</a> Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).</li>
<li>Alexander, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD82+Is+a+Marker+for+Prospective+Isolation+of+Human+Muscle+Satellite+Cells+and+Is+Linked+to+Muscular+Dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">CD82 Is a Marker for Prospective Isolation of Human Muscle Satellite Cells and Is Linked to Muscular Dystrophies.</a> Cell Stem Cell. 19 (6), 800-807 (2016).</li>
<li>Thalacker-Mercer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cluster+analysis+reveals+differential+transcript+profiles+associated+with+resistance+training-induced+human+skeletal+muscle+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Cluster analysis reveals differential transcript profiles associated with resistance training-induced human skeletal muscle hypertrophy.</a> Physiological Genomics. 45 (12), 499-507 (2013).</li>
<li>Garcia, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Yield+Purification%2C+Preservation%2C+and+Serial+Transplantation+of+Human+Satellite+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">High-Yield Purification, Preservation, and Serial Transplantation of Human Satellite Cells.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 1160-1174 (2018).</li>
<li>Yokoyama, W. M., Thompson, M. L., Ehrhardt, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+and+thawing+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation and thawing of cells.</a> Current Protocols in Immunology. , Appendix 3, 3G (2012).</li>
<li>Bareja, A., Billin, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+therapy+-+from+mice+to+men%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Satellite cell therapy - from mice to men.</a> Skeletal Muscle. 3 (1), 2(2013).</li>
<li>Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+profile+distinguishes+variability+in+human+myogenic+progenitor+cell+expansion+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Transcript profile distinguishes variability in human myogenic progenitor cell expansion capacity.</a> Physiological Genomics. 50 (10), 817-827 (2018).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Satellite+Cell+Transplantation+and+Regeneration+from+Diverse+Skeletal+Muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human Satellite Cell Transplantation and Regeneration from Diverse Skeletal Muscles.</a> Stem Cell Reports. 5 (3), 419-434 (2015).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

一次hMpPCは、骨格筋生物学と再生プロセスを理解するために使用される重要な研究モデルです。さらに、hMpCは治療に使用される可能性を秘めている。しかし、ヒト10に由来する細胞の限られた理解を含む、研究と治療の両方に一次hMpCを使用する上で認識された課題がある。ドナー培養物間の膨張能力のばらつきも大きく、hMPCの使用の可能性を制限し、研究結果11に影響を与える可能性がある。例えば、最近、このプロトコルに記載された方法を用いてhMpCを単離し、膨張容量が変化する細胞を産生し、これは性別または年齢11と一致しなかった転写プロファイルによって駆動されたことが最近実証された。
ここでは、筋管への分化を含む多数の下流アプリケーションに対して十分な量でhMpCを分離するための効率的かつ高収率法を提示し、それによってインビトロにおける筋原性プロセスをモデル化する。我々の方法は、以前に集団12を発現する濃...

骨格筋は人体最大の臓器系であり、全身質量1の30~40%を占める。運動におけるそのよく認識された役割に加えて、骨格筋は体温と姿勢を維持し、全身栄養恒常性の中心的な役割を果たしています。人間の参加者、動物、および細胞培養モデルを含む研究はすべて、骨格筋生物学と再生に関する問題に対処するために価値があります。ヒト原発性筋前駆細胞(hMpC)の単離および培養は、細胞培養技術および操作をヒトサンプルに適用することを可能にする堅牢なモデルを提供する。hMpCを使用する利点は、各ドナー2、3からの遺伝的および代謝表現型を保持することです。ドナー表現型の維持は、研究者が筋原性プロセスにおける個々の変動を調べることを可能にする。例えば、hMPC人口拡大能力4の年齢と性別の違いを特定するために、hMPC特性分類法を採用しています。
このプロトコルの目的は、骨格筋生検組織からHMPCを分離、培養、特徴付け、および区別する技術を詳細に説明することです。hMPCを記述し、hMPC分離5、6の潜在的な細胞表面メーカーを同定した前の研究に基づいて、このプロトコルは、hMPCの特性に分離をリンクすることにより、知識の重要なギャップを埋めます。さらに、このプロトコルに含まれる詳細なステップバイステップの指示により、hMPCの分離と特性評価は、hMPCの経験が限られているものを含む幅広い科学的聴衆にアクセス可能になります。我々のプロトコルは、細胞集団を追跡するためのイメージングサイトメーターの使用を記述する最初の一つである。新しく設計されたイメージングサイトメーターは、最先端のハイスループットおよびマイクロプレートベースで、培養容器の各ウェル内のすべての細胞の生細胞イメージング、細胞カウント、多チャンネル蛍光解析を数分以内に可能にします。このシステムは、培養への中断を最小限に抑えながら、細胞集団全体の増殖および生存率の動的変化を迅速に定量することを可能にする。例えば、我々は、異なるドナーから派生した各培養物の成長運動学を決定するために、インビトロで連続した日に合流の客観的な測定を行うことができる。文献中の多くのプロトコル、特にLPCの分化を伴うプロトコルは、分化または治療7を開始する前に、細胞が合流の定義されたレベルに達する必要がある。我々の方法は、研究者が公平で非主観的な方法で治療を開始することを可能にする培養容器内の各井戸の合流を客観的に決定することを可能にする。
以前は、一次hMpNCを使用する主な制限は、実験に利用可能な細胞の数を制限する低収率でした。我々および他の人は、骨格筋生検組織からのMpCの収率が組織のミリグラム当たり1−15 PPCであることを示している(図1)8.私たちのプロトコルは、蛍光活性化細胞選別(FACS)で精製する前に細胞の4つの通路を可能にするので、私たちの凍結保存されたhMPC収率は、少量の生検組織(50−100 mg)に由来し、研究目的に対処するのに十分です。複数の実験が必要です。当社のFACSプロトコルは、約80%の純粋な(Pax7陽性)MPC母集団を生成するため、当社のプロトコルは収量と純度の両方に最適化されています。

<table><tbody><tr><td>0.25% トリプシン、2.21 mM EDTA</td><td>コーニング</td><td>25-053-Cl</td><td>細胞培養容器からの付着性hMPCの除去に使用されるトリプシン</td></tr><tr><td>10 cm 細胞培養プレート</td><td>VWR</td><td>664160</td><td>hMPCの培養に使用されるプレート</td></tr><tr><td>15 mL ファルコンチューブ</td><td>ファルコン</td><td>352196</td><td>15 mL コニカルチューブ hMPC の単離および培養プロトコル全体で使用されます。</td></tr><tr><td>24ウェル細胞培養プレート</td><td>Grenier Bio-One</td><td>662 160</td><td>hMPCs</td></tr><tr><td>7-AAD 生存率染色溶液</td><td>eBioscience</td><td>00-6993-50</td><td>FACSソーティング中に生細胞を特定するための生存率染色</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 抗ヒト CD29, クローン: TS2/16</td><td>BioLegend</td><td>303016</td><td>FACS&nbsp;</td></tr><tr><td>黒色 96ウェル細胞培養プレート</td><td>Grenier Bio-One</td><td>655079</td><td>Celigo S を使用した蛍光イメージングに最適な96ウェル細胞培養プレート</td></tr><tr><td>Celigo S</td><td>Nexcelcom Bioscience</td><td></td> イメージング<td>サイトメーター hMPC培養を追跡するために使用されるイメージングサイトメーター</td></tr><tr><td>セルストレーナー VWR</td><td></td><td>352350</td><td>筋生検処理中に大きな破片を除去するセルストレーナー</td></tr><tr><td>コラーゲンI型(ラットTail)</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>細胞培養プレート用コラーゲン&nbsp;</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ D</td><td>Roche</td><td>11 088 882 001</td><td>骨格筋生検組織のコラーゲンおよびその他の結合組織の分解に使用</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>VWR</td><td>WN182</td><td>hMPCの凍結保存に使用</td></tr><tr><td>ディスパーゼII</td><td>シグマライフサイエンス</td><td>D4693</td><td>骨格筋生検組織の</td></tr><tr><td>酵素消化に使用されるプロテアーゼダルベッコのモディファイドイーグルミディアム低グルコースパウダー</td><td>Gibco</td><td>31600-034</td><td>筋生検処理用低グルコースDMEM</td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水</td><td>Gibco</td><td>21600-010</td><td>筋生検処理用PBS</td></tr><tr><td>EDTA二ナトリウム塩二水和物</td><td>J.T.ベイカー</td><td>4040-01&nbsp;</td><td>FACSバッファに必要</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>VWR</td><td>89510-186&nbsp;</td><td>hMPC増殖培地に用いるウシ胎児血清</td></tr><tr><td>ハムのF12</td><td>Gibco</td><td>21700-026</td><td>hMPCsのための基本媒体</td></tr><tr><td>熱不活化馬血清</td><td>Gibco</td><td>26-050-070</td><td>hMPC分化培地を作るために使用される馬の血清</td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>iNCyto</td><td>DHC-N0105</td><td>細胞を数えるために使用</td></tr><tr><td>冬眠 骨格</td>筋生検を保存するための<td>Gibco</td><td>A1247501</td><td>培地組織</td></tr><tr><td>Hoechst 33342、三塩酸塩、三水和物</td><td>Life Technologies</td><td>H21492</td><td>Celigo</td></tr><tr><td>S Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416P-4</td>を使用してすべての細胞を識別するためのDNA染色 <td>hMPCの制御速度凍結に使用</td></tr><tr><td>Moxiバッファー</td><td>Orflo</td><td>MXA006</td><td>自動セルカウンター用バッファー</td></tr><tr><td>Moxi Cassettes</td><td>Orflo</td><td>MXC002</td><td>自動セルカウンター用カセスト</td></tr><tr><td>Moxi z Mini 全自動セルカウンター</td><td>Orflo</td><td></td><td>自動セルカウンター</td></tr><tr><td>Mr. Frosty 冷凍容器</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>5100-0001</td><td>市販可能な速度制御セル凍結容器</td></tr><tr><td>ノーマルヤギ血清(10%)</td> <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>50062Z</td><td>FACSバッファー</td></tr><tr><td>に使用したヤギ血清PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159</td><td>BD Pharmingen</td><td>557747</td><td>FACS用標識抗体&nbsp;</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン 100x Solution</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td>培養培地に添加された抗生物質</td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>P3566</td><td>DNA染色 セリゴS</td></tr>組<tr><td>換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子</td><td>プロメガ</td><td>G5071</td>サプリメントを使用して死細胞を同定し、<td>hMPC増殖培地で自発分化</td></tr><tr><td>を防止します。回収細胞培養凍結培地&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12648-010</td><td>筋生検スラリーの凍結処理に使用される培地</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S233-3</td><td>ハムのF12に追加</td></tr><tr><td>滅菌丸底5mLチューブ</td><td>VWR</td><td>60818-565</td><td>FACS</td></tr><tr><td>UltraComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-2222-42</td><td>コンペンセーションビーズフォートキャリブレーションフローFACS設定</td></tr></tbody></table>

骨格筋生検手順からのヒト筋前駆細胞の単離、培養、特徴付け、分化

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

一次ヒト組織および細胞の使用は骨格筋再生プロセスのような生物学的および生理学的プロセスの調査にとって理想的である。ヒト原発性成人幹細胞、特に骨格筋生検に由来するヒト筋肉前駆細胞(hMpC)を用いて働く上で認識された課題があり、採取された組織からの低細胞収率およびドナーの大きな不均一性を含む。文化間の成長と死のパラメータ。不均一性を実験設計に組み込むには、有意な効果を検出するためにより大きなサンプルサイズが必要ですが、hMPC拡張能力の変動性を支えるメカニズムを特定できるため、より深く理解することができます。骨格筋再生における不均一性。培養能力の拡大能力を区別する新しいメカニズムは、骨格筋再生を改善する治療法の開発につながる可能性を秘めている。

ヒト筋肉組織からのhMPC単離の代表的なフローサイトメトリー結果を図1に見ることができる。hMPCは、死んだ細胞や破片を除去するために、サイドスキャッタとフォワードスキャッタに基づく最初のゲーティングイベントによって識別され、続いて7-AADに対して負のセルのみを選択し、したがって実行可能です。細胞表面マーカーCD56およびCD29の両方に対して陽性の細胞の選択は、hMPC母集団を表す。60 mg の生検は約 75−250 hMppc を提供します。
代表的な合流スキャンを図2Aに示します。図2Bの緑色のアウトラインは、イメージングサイトメーターによって生成され、選択された解析設定に基づいてイメージングサイトメーターがどのように合流を決定したかを示す。図示される両方の画像にお...

骨格筋生検組織から得られたヒト原発性筋前駆細胞(hMpAc)を分離、培養、特徴付け、分化する技術を提示する。これらの方法によって得られ、特徴付けられたhMpPCは、その後、ヒトの筋形成および骨格筋再生に関連する研究の質問に対処するために使用することができる。

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

骨格筋再生を調節するヒト筋肉前駆細胞を分離することで、ドナーの変動を維持しながら再生プロセスの根本となるプロセスを調査することができます。この技術は、少量の組織と少数の細胞を用いたその表向きの分析から、ヒトの筋肉前駆細胞の大きな収量を得ることを可能にする。この方法は、ヒトの筋肉前駆細胞を分離して増殖および分化能力を追跡し、これらのデータを骨格筋再生プロセスに関連付けるために特別に設計されています。この非常に簡単な技術の最も困難な側面は、すべてのステップが細胞の収率と純度を最適化するために再現的に行われることを保証することです。セルの分離を成功させるためには、複数の手順を完了する必要があります。いくつかの手順は、視覚的に観察されている場合は理解しやすいです。生検組織からヒトの筋肉前駆細胞を分離するには、無菌状態下で無菌ペトリ皿に筋肉組織を入れ、滅菌メスを使用して組織を1ミリメートル立方体にミンチする。すべての組織がミンチされたら、PBSの10ミリリットルを含む15ミリリットルのチューブに部分を移し、組織を邪魔することなく上澄を慎重に吸引する前に、組織が重力によって沈降することを可能にする。ちょうど実証したように断片を2回目に洗浄した後、PBSを低グルコースダルベックの改変イーグル培地の10ミリリットルに置き換えます。組織が落ち着いた後に上清を取り除き、3ミリリットルの消化培地で再懸濁する。1ミリリットルの血清学的ピペットで10分ごとに筋肉片のトリチュレーションで、30分間摂氏37度で組織を置きます。インキュベーションの最後に、83マイクロリットルの追加消化媒体と24マイクロリットルのディスパーゼ溶液をサンプルに加え、均一なスラリーが達成されるまで広孔ピペットチップで5〜10分ごとに組織をトリチュレートします。均一なスラリーは、ヒトの筋肉前駆細胞の最大回復に重要です。スラリーが標準的な1,000マイクロリットルのピペット先端を通過しない場合は、消化を続けます。Pax7陽性細胞を単離するには、プロトコルに従って細胞を染色し、ゲートする。1平方インチ当たり20ポンドの圧力で100マイクロメートルのノズルを備えたフローサイトメーター上のCD56、CD29ダブルポジティブヒト筋肉前駆細胞を、蛍光活性化細胞選別バッファーの300マイクロリットルクッションを含む回収管にソートします。その後、並べ替えられたヒト筋肉前駆細胞を、10倍の4番目の細胞に3.5倍の4番目の細胞で事前に温めた成長培地を含むコラーゲンコーティングされた24ウェルプレートに播種する。合流スキャンを実行するには、プレートをイメージングサイトメーターにロードし、[新規スキャンの作成]および[プレートカテゴリ]、[プレートプロファイル]、[プレートID]を選択します。背景と比較してセルが白く表示されるフォーカス平面を見つけ、[手動登録]を選択します。マウスを使用して、スキャンする必要があるすべてのウェルをハイライト表示し、[スキャンの開始] を選択します。ウェル領域全体が自動的にスキャンされます。プレートとセルタイプに最適な解析設定を選択し、[解析開始]を選択します。イメージングサイトメーターを使用して、最初に合流を測定します。次に、画像サイトメーター上の細胞を数え、各ウェルの培地を200マイクロリットルの染色溶液に交換する。摂氏37度で15分後、染色液を新鮮なハムのF12の100マイクロリットルに交換してください。プレートをイメージングサイトメーターに戻し、[アプリケーション]で[細胞生存率]および[ライブデッドトータル]を選択します。ライブチャンネルは明視野画像になり、デッドチャンネルはヨウ化プロピジウム染色を表示し、トータルチャンネルはHoechst 33342染色になります。[フォーカス設定] で、[自動登録] をクリックします。[合計] チャネルで、チャネルを青に設定します。[フォーカスの検索]を使用して核にフォーカスを移動し、[オフセットを設定]をクリックしてフォーカスを選択します。Dead チャネルの下で、チャンネルを赤に設定し、[フォーカスを探す] を使用して、デッド セルにフォーカスを移します。[オフセットの設定] をクリックしてフォーカスを選択し、[スキャンの開始] を選択してスキャンを開始します。次に、プレートとセルタイプに適した解析パラメータを選択し、[解析開始]を選択して解析を開始します。分析が完了したら、分析がセルを適切にカウントしたことを視覚的に確認します。スキャンと分析が満足のいく場合は、プレートをインキュベーターに戻し、それ以外の場合は分析パラメータを再スキャンまたは変更します。ヒトの筋肉前駆細胞は、死んだ細胞または破片を排除するために、側および前方散乱領域に基づいて最初の格子イベントによって同定され、続いて7-AADに対して陰性であり、したがって生存可能である細胞のみを選択することによって同定することができる。CD56およびCD29細胞表面マーカーの両方に陽性である細胞は、ヒトの筋肉前駆細胞集団を表す。ヒト筋肉前駆細胞は、それらのPax7発現によっても同定することができる。実際、Pax7はFACSの後の総人口で濃縮され、複数の通路を通って維持される。ここでは、代表的な合流スキャンが示されている。緑色のアウトラインは画像サイトメーターによって生成され、選択した分析設定に基づいてイメージングサイトメーターがどのように合流を決定するかを示しています。異質性と核数はドナー間で一般的です。この異質性を発見し、正確に特徴付けるのは、イメージングサイトメーターの重要なアプリケーションです。しかし、ユニークなドナーからの合流点測定と核数は非常に相関性が高い。ヒト筋肉前駆細胞は、ミオチューブを形成するように分化し、それらの胚性ミオシン重鎖発現によって区別され得る。すべてのドナーから同じ集団の細胞を単離するためにフローサイトメーター上の格言パラメータを選択する際に一貫性を保ることが重要です。一度単離されると、ヒト筋肉前駆細胞は、ヒト筋肉前駆細胞の増殖および分化のユニークな代謝要件を特定するなど、複数の目的に使用することができる。ヒトの筋肉前駆細胞の分離により、ヒトおよびマウスの筋肉前駆細胞における細胞表面マーカー発現の違いが判別された。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

ミクロ解剖植技術は、骨格筋幹細胞のソースとして、若年成人や胚の筋肉から増殖性骨格筋細胞を単離するための堅牢で信頼性の高い方法です。一意に、これらの細胞は、クローン的に生体移植のために使用される骨格筋幹細胞株を生成するために導出されている。...

大人と胚骨格筋のMicroexplantの文化と骨格筋幹細胞の単離

酵素的解離、線維/脂肪細胞とマウス骨格筋からの筋原性前駆細胞のフローサイトメトリーによる表面標識および精製方法。...

骨格筋からの前駆体の精製

筋線維の単離および培養は、ゴールドスタンダードである...

成人骨格筋からの個々の筋線維とその衛星細胞の単離および培養

ヒト骨格筋内の血管は、再生アプリケーションに最適ですいくつかの多系列前駆体集団を保有する。内膜から筋原内皮細胞、培地から周皮細胞、および外膜から外膜細胞：この分離法は、血管の三つの構造層からそれぞれ3多能性前駆細胞集団の同時精製を可能にする。...

ヒト骨格筋からの血管由来の多能前駆体の単離

ヒトの筋肉に由来する主な接着細胞タイプは、筋原性細胞と線維芽細胞です。ここでは、CD56抗原に基づく磁気活性化細胞ソーティングを用いて細胞集団を濃縮します。その後、特異的抗体による免疫標識と画像解析技術の使用により、個々の細胞の細胞質および核特性を定量化できます。...

ヒト骨格筋からの一次筋原細胞および線維芽細胞の単離および定量的免疫組織化学的特性評価

このプロトコルは、筋肉または皮膚組織からの筋原性および線維芽細胞株の生細胞単離および初代培養の技術について説明しています。 これらの細胞株を不死化するための技術についても説明する。...

病気のモデリングのための筋生検からの患者由来の細胞株の単離と不死

このプロトコルは、成人および高齢者の骨格筋からの単離および筋芽細胞の前駆細胞の培養の、堅牢で再現性と簡単な方法について説明します。ここで使用される筋肉は足と脚の筋肉を含みます。このアプローチは、機能的研究のための一次筋芽細胞の濃縮集団の単離を可能にします。...

成人および高齢人間の骨格筋から筋原性前駆細胞/一次筋芽細胞の調製と文化

ここでは、成人の筋肉組織からのヒト筋芽細胞の純粋な集団を得るための方法を説明する。これらの細胞は、in vitro骨格筋分化を研究するため、特にCa 2+シグナル伝達に関与するタンパク質を研究するために使用される。...

ヒト筋芽細胞の単離、筋分化の評価、および貯蔵操作カルシウムエントリー測定

ミオブラストは、多核化ミオチューブと最終的に骨格筋筋筋筋繊維を形成するために分化する前駆細胞を増殖させる。ここでは、若年成人マウス骨格筋からの原発筋芽生の効率的な単離および培養のためのプロトコルを提示する。この方法は、培養中の筋肉細胞の分子的、遺伝的、代謝的研究を可能にする。...

マウス骨格筋移植からの原発性筋芽生の単離と分化

このプロトコルは、マウスの個々の骨格筋からの筋幹細胞および線維脂肪原性前駆細胞の単離について説明しています。このプロトコルには、単一筋解剖、蛍光活性化細胞選別による幹細胞の単離、免疫蛍光染色による純度評価、および5-エチニル-2'-デオキシウリジン取り込みアッセイによるS期侵入の定量的測定が含まれます。...

個々の骨格筋からの静止幹細胞集団の分離

このプロトコルは、組織解離、逐次ろ過、プレプレート処理、定義された培養条件を通じて、成体および新生マウスの骨格筋から一次筋芽細胞を単離・濃集する標準化された方法を提供し、衛星細胞由来の筋肉芽細胞培養の確立と維持を可能にし、下流の実験応用を可能にします。...

In vitro 筋形成研究のための骨格筋サテライト細胞の単離

学ぶ骨格筋生検組織からヒト筋前駆細胞を単離・培養する方法。少量組織から高収率で細胞を取得し、増殖と分化能力を追跡することで筋再生メカニズムの解明に貢献します。

骨格筋生検手順からのヒト筋前駆細胞の単離、培養、特徴付け、分化

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