Name: マウス造血幹細胞および前駆細胞およびMLL-AF9駆動白血病におけるミトコンドリア活性酸素種のフローサイトメトリック解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 学ぶマウス造血幹細胞と前駆細胞およびMLL-AF9白血病細胞におけるミトコンドリア活性酸素種のフローサイトメトリック検出法。遺伝子操作がROSレベルに与える影響を評価し、細胞代謝と治療戦略への知見を提供する。

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この研究は、フォックスチェイス癌センター理事会(DDM)、米国血液学会学術賞(SMS)、米国癌学会RSG(SMS)および国防総省(賞#:W81XWH-18-1-0472)によって支援されました。

このプロトコルに記載されているすべての動物の手順は、フォックスチェイス癌センターの機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されています。
注:プロトコルワークフローは図1に示すように4つの部分に分かれており、必要な試薬は材料の表に記載されています。
1. 骨髄(BM)分離
注:MLL-AF9白血病マウスは、前述の11として生成された。
<ol><li>前述の12、13、14、15、野生型C57.Bl6マウス(CD45.2先天性マーカーを発現する)およびC57から、単核骨髄細胞を回収する。MLL-AF9発現白血病細胞(CD45.2+)で移植したBl6-SJLマウス(CD45.1前生細胞を発現する)。 注:BMは、12、13を粉砕するか、または骨14、15を洗い流すことによってマウスから回収することができる。ここで提示された実験では、BMは、フラッシングを介して健康マウスと白血病マウスの両方から回収された。</li>
</ol>2. ミトコンドリアROSフルオロゲン染料染色
<ol><li>単核骨髄細胞が健康なマウスおよび/または白血病マウスから回収されたら、トリパンブルーで細胞のアリコートを染色し、血球計を使用してカウントして、総BM細胞の開始数を決定します。</li>
	<li>細胞を300 x gで5分間遠心分離し、F-PBS(PBSは2%の胎児牛血清と1%ペニシリン/ストレプトマイシンカクテルを補充)でペレットを再ステーペンし、2 x 106細胞/mLの濃度にします。</li>
	<li>次のようにラベル付けされた9つの単色制御チューブにチューブあたりの細胞懸濁液のAliquot 200 μL: 汚れなし、B220-Cy5-PE、cKit-Cy7-APC、Sca1-PacBlue、CD150-APC(健康なHPCのみ)、CD45.2-APC(白血病細胞のみ)、CD34-FITC、ミトコンドリアROS染料および生死細胞染色。 注:(オプション)ミトコンドリアROSの誘導に対する陽性対照は、5%CO2インキュベーターで37°Cで1時間のメナジオンナトリウムビスルボディ(MSB)の20μMで200μLで2x105細胞を処理することによって調製することができる。ミトコンドリアROSのMSB媒介誘導を逆転させる第2の制御は、MSBの20μMに加えて100 μM N-アセチル-L-システイン(NAC)を5%CO2インキュベーターで1時間100μMで200μLで2x105細胞を処理することによって調製することができる。</li>
	<li>チューブ(実験管)の残りの細胞をアリコートし、遠心分離機を300 x gで5分間使用します。</li>
	<li>製造元の指示に従って、生きている/死んだ細胞の汚れでF-PBSの細胞を再中断する。氷の上で30分間インキュベートし、単色のコントロールチューブに生きた/死んだ汚れを加えるようにしてください。</li>
	<li>生きた/死んだ色素で染色された単色および実験管の両方に室温(RT)F-PBSの1.0 mLを加える。RTで300 x gで遠心分離機5分。</li>
	<li>ミトコンドリアROS色素の50μgをジメチルスルホキシド(DMSO)の13μLで再中断し、5mMストック溶液を得た。</li>
	<li>ベラパミル(50μM)の有無にかかわらずRT F-PBSで5μMの最終濃度にミトコンドリアROS色素を希釈します。</li>
	<li>生きている/死んだ細胞の汚れの洗浄を吸引する。各実験チューブにベラパミルを含むミトコンドリアROS染料染料染色剤200μLを加え、ミトコンドリアROS染料単色制御チューブを追加します。</li>
	<li>渦は、暗闇の中で37°Cで10分間混合し、インキュベートする。</li>
	<li>ミトコンドリアROS染色シングルカラーコントロールおよび実験チューブにRT F-PBSの1.0 mLを追加します。RTで300 x gで遠心分離機5分。</li>
	<li>上清を吸引し、RT F-PBS の追加の 1.0 mL で細胞を洗浄します。RTで300 x gで遠心分離機5分。</li>
</ol>3. リネージ抗体染色
<ol><li>表1に記載されている抗体カクテルを準備する。 注:これらの抗体カクテルは、以前に14、15、16に最適化されている。</li>
	<li>健康なBMを含む実験チューブの最終ミトコンドリアROS色素洗浄から上清を吸引し、各チューブに200μLの抗体カクテル#1を加える。混ぜる渦。また、単色制御チューブを準備します。暗闇の中で氷の上で60分間インキュベートします。</li>
	<li>白血病BMを含む実験管の最終ミトコンドリアROS色素洗浄から上清を吸引し、各管に200μLの抗体カクテル#2を加える。混ぜる渦。暗闇の中で氷の上で60分間インキュベートします。</li>
	<li>RTで300 x gで1.0 mLの冷たいF-PBSおよび遠心分離機5分で洗う。</li>
	<li>冷たいF-PBSの500 μLの細胞を再中断し、凝集体を除外するために40 μmフィルターを使用して流れサイトメーターチューブ内の細胞をろ過する。</li>
</ol>4. フローサイトメトリーの取得と分析
注:いくつかの造血幹細胞および前駆体のサブセットは、長期造血幹細胞などまれである。したがって、理想的には、様々なHSPCサブセット内のミトコンドリアROSの十分な分析のために、フローサイトメトリー獲得時に各実験管に対して3〜500万のイベントを収集する必要があります。
<ol><li>無染色制御チューブを使用して、分析された細胞集団の大きさと複雑さに基づいて前方(FSC-A)と側(SSC-A)散布プロットを設定します。</li>
	<li>無染色および単色制御管を使用して、フローサイトメーターを補正します。</li>
	<li>前方および側面散乱プロットから余分な破片をゲートアウトします(図2A,B、左から最初のパネル)。</li>
	<li>前方識別子などの二重識別子を使用して二重にゲートアウトします(図2A、B、左から2番目のパネル)。</li>
	<li>図2A、Bで提案されているゲーティング戦略に従って、生細胞、系統低細胞および様々なHSPCおよび白血病サブセットを選択する。</li>
	<li>対象の各集団について、ヒストグラムプロットにおけるTRPEチャネル(x軸)の中央値蛍光強度(MFI)を分析し、ミトコンドリアROSシグナルの違いを評価します(図3A-C、左パネル)。ミトコンドリアROSのレベルは、散布図中のミトコンドリアROS染色と特定の系統マーカーを比較することによって単一細胞レベルで評価することができる。</li>
</ol>

<ol><li>Dröse, S., Brandt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+superoxide+production+by+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+experimental+medicine+and+biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain.</a> Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).</li>
<li>Gerber, P. A., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Oxidative+Stress+and+Hypoxia+in+Pancreatic+Beta-Cell+Dysfunction+in+Diabetes+Mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidant+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus.</a> Antioxidant & Redox Signaling. 26 (10), 501-518 (2017).</li>
<li>Höhn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Happily+%28n%29ever+after%3A+Aging+in+the+context+of+oxidative+stress%2C+proteostasis+loss+and+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence.</a> Redox Biology. 11, 482-501 (2017).</li>
<li>Reuter, S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress%2C+inflammation%2C+and+cancer%3A+how+are+they+linked%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked.</a> Free Radical Biology & Medicine. 49 (11), 1603-1616 (2010).</li>
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<li>Harris, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+metabolism+impacts+the+spatiotemporal+onset+and+magnitude+of+HSC+induction+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Glucose metabolism impacts the spatiotemporal onset and magnitude of HSC induction in vivo.</a> Blood. 121, 2483-2493 (2013).</li>
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<li>Lagadinou, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCL-2+inhibition+targets+oxidative+phosphorylation+and+selectively+eradicates+quiescent+human+leukemia+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).</li>
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<li>Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-potential+compensation+reveals+mitochondrial+volume+expansion+during+HSC+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment.</a> Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).</li>
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</ol>

著者は何も開示していない。

ROSの検出のために開発されたフルオロゲン染料は、フローサイトメトリー22により顕微鏡検査または生細胞中の固定細胞において頻繁に評価される。ミトコンドリアROSフルオロゲン染料を用いてBM細胞内のミトコンドリアROSのフローサイトメトリック評価には2つの大きな利点があります:1)生細胞分析に適した高速かつ簡単な技術であり、2)希少な区別と分析を可能にします。表面マーカー染色を使用してBMの単一細胞レベルでの集団。ここで提示されるステップバイステッププロトコルは、正常なマウスとフローサイトメトリーを用いたMLL-AF9によって駆動されるAMLのマウスモデルと同様に、造来性幹および前駆体集団の外生性レドックスステータスを研究するために開発された。このプロトコルの実行中に考慮する必要がある重要な技術的変数がいくつかあります。
第一に、プロおよび抗酸化コントロールの使用は、ユーザーがミトコンドリアROS染色の増加のためのベースラインを確立するだけでなく、染色の特異性を可能にする。ここで提示されたプロトコルについては、プロオキ...

活性酸素種(ROS)は、分子酸素由来の反応性の高い分子です。ROS産生の最も明確に定義された細胞位置はミトコンドリアであり、酸化リン酸化(OXPHOS)中に電子輸送鎖(ETC)を通過する電子が特定の形成につながる分子酸素によって吸収されるスーパーオキシド1と呼ばれるROSの種類。スーパーオキシドジスムターゼまたはSODと呼ばれる一連の酵素の作用を通じて、スーパーオキシドは過酸化水素に変換され、その後、カタレーゼやグルタチオンペルオキシダーゼ(GPX)などの酵素によって水に中和されます。ROS調節機構の摂動は、多くの場合、高分子損傷(すなわち、DNA、タンパク質、脂質)などの有害で潜在的に致命的な細胞の結果を有する酸化ストレスと呼ばれるROSの過剰産生につながる可能性があります。さらに、酸化ストレスは、糖尿病、炎症性疾患、老化および腫瘍2、3、4などのいくつかの病理に関連している。酸化ホオスタシスを維持し、酸化ストレスを防ぐために、細胞は様々なROS調節機構を有する5.
特定のROSの生理学的レベルは、適切な胚および成人のヘマトポエシス6に必要である。しかし、過剰なROSは、造来茎および前駆体プールのDNA損傷、細胞分化および枯渇に関連している。また、レドックス生物学の変化は、白血病と健康な細胞の間で異なる可能性があるという証拠もあります。例えば、ROSレベルは、彼らの健康な相手に対して急性骨髄性白血病(AML)細胞で高くなる傾向があり、他の研究は、白血病幹細胞が生存7、8のためにROSの低定常状態レベルを維持することを示唆している。重要なことに、これらの酸化還元の違いを治療的に活用するための戦略は、いくつかのヒト癌の設定9、10で約束を示している。したがって、マウスモデルにおけるROSレベルの評価を可能にするアッセイは、これらの種が細胞生理学および疾患病因にどのように寄与するかについての理解を改善し、潜在的に有効性を評価するためのプラットフォームを提供する可能性がある。新しいレドックスターゲティング抗癌療法。

<table><tbody><tr><td>熱不活化 FBS</td><td>VWR Seradigm LIFE SCIENCE</td><td>97068-085</td><td>メディア</td></tr><tr><td>ペニシリン ストレプトマイシン</td><td>コーニング</td><td>30-002-CI</td><td>メディア</td></tr><tr><td>PBS</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP399-20</td><td>バッファー</td></tr><tr><td>15 mL コニカルチューブ</td><td>BD ファルコン</td><td>352096</td><td>組織培養</td></tr><tr><td>50 mL コニカルチューブ</td><td>BD ファルコン</td><td>352098</td><td>ティッシュカルチャーサプライ</td></tr><tr><td>40 &mu;m細胞ストレーナー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22-363-547</td><td>組織培養用品</td></tr><tr><td>RBC溶解バッファー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>50-112-9751</td><td>組織培養用品</td></tr><tr><td>メナジオン亜硫酸水素ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>M5750</td><td>酸化促進</td></tr><tr><td>剤NAC</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>A7250</td><td>抗酸化剤</td></tr><tr><td>CD3 PE-Cy5クローン 145-2c11</td><td>バイオレジェンド</td><td>100310</td><td>抗体</td></tr><tr><td>CD4 PE-Cy5 クローン RM4-5</td><td>eBioscience</td><td>15-0041-81</td><td>抗体</td></tr><tr><td>CD8 PE-Cy5 クローン 53-6.7</td><td>eBioscience</td><td>15-0081-81</td><td>抗体</td></tr><tr><td>CD19 PE-Cy5 クローン 6D5</td><td>Biolegend</td><td>115510</td><td>抗体</td></tr><tr><td>B220 PE-Cy5 クローン RA3-6B2</td><td>Biolegend</td><td>103210</td><td>抗体</td></tr><tr><td>Gr1 PE-Cy5 クローン RB6-8C5</td><td>Biolegend</td><td>108410</td><td>抗体</td></tr><tr><td>Ter119 PE-Cy5 クローン Ter-119</td><td>Biolegend</td><td>116210</td><td>抗体</td></tr><tr><td>CD48 PE-Cy5 クローン HM48-1</td><td>Biolegend</td><td>103420</td><td>抗体</td></tr><tr><td>CD117&nbsp;APC-Cy7 クローン 2B8</td><td>Biolegend</td><td>105825</td><td>抗体</td></tr><tr><td>Sca1 peacific Blue clone D7</td><td>Biolegend</td><td>108120</td><td>抗体</td></tr><tr><td>CD150 APC clone TC15-12F12.2</td><td>Biolegend</td><td>115909</td><td>抗体</td></tr><tr><td>CD34 FITC クローン RAM34</td><td>BD Bioscience</td><td>553733</td><td>抗体</td></tr><tr><td>CD45.2 APC clone 104</td><td>Biolegend</td><td>1098313</td><td>抗体</td></tr><tr><td>MitoSOX赤</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>M36008</td><td>染料</td></tr><tr><td>Mitotracker グリーン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>M7514</td><td>染料</td></tr><tr><td>ライブ/デッド イエロー染料</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>L34967</td><td>染料</td></tr></tbody></table>

マウス造血幹細胞および前駆細胞およびmll-af9駆動白血病におけるミトコンドリア活性酸素種のフローサイトメトリック解析

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

健康なマウスとMLL-AF9によって駆動されるAMLを有するマウスから、様々な生きた骨髄(BM)由来の幹および前駆細胞集団におけるミトコンドリアROSを分析するためのフローサイトメトリックアプローチを提示する。具体的には、健康または白血病BM細胞がミトコンドリアスーパーオキシドを検出するフルオロゲン性色素で最初に染色され、続いて使用されるフルオロクロム結合モノクローナル抗体による染色を行う2段階の細胞染色プロセスについて説明します。様々な健康で悪性の前駆体集団を区別する。また、フローサイトメトリーによるサンプルの取得と分析に関する戦略も提供しています。プロトコル全体は、3-4時間の短い時間枠で行うことができます。我々はまた、フローサイトメトリーによるフルオロゲン染料を用いた生造血および白血病の幹および前駆体のミトコンドリアコンパートメントにおけるROS産生のモニタリングの利点と限界を考慮すべき重要な変数を強調する。.さらに、ミトコンドリアROSの豊富さが、明確な健康なHSPCサブ集団と白血病前駆体の間で変化するデータを提示し、血液学的研究におけるこの技術の可能な応用について議論する。

提示されたのは、複数の健康およびMLL-AF9発現白血病前駆体のミトコンドリアにおけるROSを分析する方法である。図 1は、4 つの主要なステップで構成されるプロトコル ワークフローの概略図を示します: 1) マウスからの BM 分離;2)ミトコンドリアROS、特にスーパーオキシドを認識するフッ素色素でBM細胞を染色する。3)様々な健康および白血病血化集団を線引きする表面マーカー抗体染色;そして4)フローサイトメトリーの獲得と分析。
図 2A,Bは、健康で白血病BMにおける様々な造血幹細胞および前駆体集団を分析するための代表的なゲーティング戦略を示す。破片を除去するために FSC/SSC プロットが適用され、FSC 領域 (FSC-A) 対 FSC 高さ (FSC-H) プロットを使用して、二重子と凝集体を除外します。系統表面マーカー(表1およびステップ3.1)のパネルは、リンパ球、赤血球、顆粒球...

急性骨髄性白血病(AML)のマウスモデルから、マウスの健康な造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)におけるミトコンドリア活性酸素種(ROS)を検出するために多パラメータフローサイトメトリーを用いる方法について説明する。MLL-AF9.

マウス造血幹細胞および前駆細胞およびMLL-AF9駆動白血病におけるミトコンドリア活性酸素種のフローサイトメトリック解析

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

活性酸素種またはROSは、細胞によって産生される活性酸素種であり、その行動に影響を与える。過剰なROSはまた、広範囲にわたる細胞大混乱を引き起こす可能性がありますが、重症例では、細胞死。したがって、ROS恒常性の維持は、細胞機能および生存にとって基本的に重要である。ここで提示されるプロトコルは、ミトコンドリアによって生成される特定のタイプのROSの測定に焦点を当てています, 主に生きている、正常な、または健康な造血幹細胞および前駆細胞集団の代謝副産物として, ならびに血液癌のマウスモデルからの白血病細胞で, 急性骨髄性白血病またはAML.このプロトコルは、遺伝子欠失や過剰発現などの遺伝子操作が、いくつかの健康で悪性造血集団におけるミトコンドリアROSにどのような影響を与えるかを評価するためにも使用できます。その結果、リダックス状態と細胞の代謝に関する洞察に満ちた情報を提供する可能性があります。この技術は、原性プローブのフロー決済メトリック分析を承認し、生きている健康で悪性造血性茎および前駆体亜集団におけるミトコンドリアROS産生を監視する。このプロトコルは簡単で、数時間で完了できます。さらに、生細胞分析に適しており、染色の表面マークを使用して、骨髄中の幹細胞集団におけるミトコンドリアROSを区別し、分析することができます。原稿によると、野生のタイトマウスおよび白血病MLL-AF9マウスから単核骨髄細胞を採取した後、9つの単色制御チューブのそれぞれに細胞懸濁液の200マイクロリットルをアリコートした。残りの細胞を他の実験管にアリコートし、それぞれ200マイクロリットルを含む。次に、それぞれ骨髄細胞と白血病細胞を含む2つの実験チューブと1つのコントロールチューブを遠心分離機に入れる。5分間Gの300倍で遠心分離機。次に、上清をデカントし、メーカーの指示に従って、生きている/死んだ細胞染色で室温F-PBSの細胞を再中断します。氷の上で30分間インキュベートします。その後、3本の生きた染色チューブに室温F-PBSを1ミリリットル加え、ミトコンドリアROS染料染色用の単色制御チューブを1本加えます。チューブを室温で5分間Gの300倍の遠心分離機に入れます。次いで、50マイクログラムのミトコンドリアROS染料をDMSOの13マイクロリットルに再懸濁させることにより、5ミリモルミトコンドリアROS染料のストック溶液を得る。その後、13マイクロリットルミトコンドリアROS染料に室温F-PBSの13ミリリットルを加え、5マイクロモルの最終濃度に希釈します。必要に応じて、ミトコンドリア流出ポンプを阻害する溶液に50ミリモルベラパミルの13マイクロリットルを加えます。遠心分離機からチューブを入手し、生きた/死んだ細胞染色の洗浄を吸引します。ライブ/デッド染色制御に200マイクロリ

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流出ポンプの阻害による造血幹細胞および前駆細胞におけるミトコンドリア膜電位の流れ細胞測定評価の精度向上

造血幹細胞(HSPC)は、血液形成中の代謝可塑性による静止状態から分化状態に移行します。ここでは、HSPCのミトコンドリア呼吸と糖状化を測定するための最適化された方法を提示する。...

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細胞外フラックス分析装置を用いたマウス造血幹および原始前駆細胞における細胞生体エネルギーの評価

ここでは、マウス骨髄細胞を表現型造血幹および前駆細胞に単離および染色するための簡単なプロトコルと、支持するニッチ内皮および間葉系幹細胞について説明します。内膜および中枢骨髄領域に位置する細胞を濃縮する方法も含まれる。...

マウス骨髄造血幹・前駆細胞および間質ニッチ細胞のフローサイトメトリー解析

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骨髄異形成症候群および急性骨髄性白血病における骨髄微小環境集団の同定

学ぶマウス造血幹細胞と前駆細胞およびMLL-AF9白血病細胞におけるミトコンドリア活性酸素種のフローサイトメトリック検出法。遺伝子操作がROSレベルに与える影響を評価し、細胞代謝と治療戦略への知見を提供する。

マウス造血幹細胞および前駆細胞およびMLL-AF9駆動白血病におけるミトコンドリア活性酸素種のフローサイトメトリック解析

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