Name: アルツハイマー病のモデリングに用いられるアミロイドβ分泌アルギン酸マイクロビーズの製造 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: 学ぶアルギン酸マイクロビーズによる細胞封入法で、アミロイドβの制御放出を実現する技術です。7PA2細胞を用いたin vitroおよびin vivoモデルで、アルツハイマー病の病態解明と治療法開発に貢献します。

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著者らは、カジェン・スレスパラン氏、ジョナサン・ウベツ博士、ドミニク・グルジンスキー氏、チェン・ザオ氏、ティエリー・パイロット博士に、アルギン酸微生物の製造、細胞培養とAβ検出、有用な科学的検出の最適化に協力してくれたことに感謝したいと思います。議論。

1. 準備
<ol><li>約4%(w/v)のアルギネートストック溶液の100mLを調出します。<ol>
<li>アルギン酸ナトリウム塩の4.4gの重量を量り、乾燥粉末をHEPESバッファー生理食塩(HBS、20 mM HEPES(0.477g)、脱イオン水で150mM NaCl(0.877g)で100mLに加え、水和を可能にします。</li>
		<li>磁気撹拌機を毎分約500回転(rpm)で使用し、最大50°Cまで熱して完全なアルジン酸塩水和を可能にします。 注:アルギネートは完全に水和するために1または2時間を必要とする場合があります。時間に保存するために、アルギン酸溶液は、カプセル化プロトコルの1日前に構成され、翌日まで4°Cで保存することができます。アルギン酸塩を冷蔵した場合は、水風呂やホットプレートを使用して37°Cまで優しく加熱し、使用直前に磁気攪拌機で攪拌します。</li>
		<li>使用前に0.22 μmの細孔ポイテルスルホン(PES)フィルターを使用してアルギネート溶液を滅菌フィルターします。アルギネートの容易な流れを可能にするために、フィルタリングは37 °Cで推奨されます。温度が下がることを許されると粘度が上がります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>0.5 M CaCl2の 1,000 mL を準備します。<ol>
<li>無水CaCl2の55.49 gの重量を量り、HBSの1,000 mL(脱イオン水の1,000 mLで20 mM HEPESおよび150 mM NaCl)に溶解する。</li>
		<li>0.22 μmの細孔PESフィルターを使用した無菌フィルター。</li>
	</ol>
</li>
	<li>溶解ミックスの100mLを準備します。<ol>
<li>リン酸緩衝生理食塩水中に100mM HEPES(23.83g)と500mMのクチン酸三ナトリウム二水和物(147.05g)溶液を調製します。</li>
		<li>NaOH または HCl を使用して pH 7.4 に調整します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. カプセル化システムの設定
<ol><li>層流フードをきれいにします。<ol>
<li>UV露光を使用してカプセルを含む層流フードを殺菌し、続いて70%v/vエタノール溶液で噴霧します。</li>
		<li>70%vエタノール溶液の10 mLでエンキャップスレーターシステムを洗い流し、その後10mLの無菌脱イオン水を使用します。</li>
		<li>300 μm のノズルを取り付け、ステップ 2.1.2 を繰り返します。</li>
		<li>濾過されたアルギン酸溶液を含むボトル、濾過された塩化カルシウム溶液を含むボトル、および70%vエタノール溶液で使用される任意のツール、機器、空の培養プレートを含むボトルをスプレーし、層流フードに入れます。使用前に、UVライトを再び30分間オンにして完全に殺菌してください。</li>
		<li>生物学的グレードの消毒液で満たされた廃棄物ビーカーを準備し、フードにビーカーを配置します。</li>
		<li>無菌CaCl2(水性)溶液の100 mLでビーカーを充填し、磁気攪拌機に加えます。撹拌速度を100rpmに設定します。ビーカーをノズルの先端から18cmの高さの磁気プラットフォームに置きます。このビーカーは、アルジンビーズを収集し、そのゲル化を可能にするために使用されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>カプセル化用のセルを準備します。<ol>
<li>0.25%トリプシン-EDTA溶液を使用して、インキュベーターから細胞を取り出し、5〜10分間37°Cでインキュベートします。</li>
		<li>細胞密度を推定するためのサンプルを分離し、残りの細胞を1,000rpmで5分間遠心分離し、細胞ペレットを得る。</li>
		<li>HBS(20 mM HEPESおよび150 mM NaCl)でペレットを再ステージェントし、最終的な所望の細胞濃度を2倍にする(例えば、1.5 x 106細胞/mLの最終濃度のために、HBS内の細胞を再中断して3 x 106細胞/mLの濃度を達成する)。</li>
		<li>50 mL遠心管で、細胞懸濁液を1:1比で〜4%(w/v)アルギン酸溶液で混合し、所望の細胞濃度(例えば、1.5 x 106細胞/mL)を含む最終懸濁液を~2%(w/v)アルギン酸溶液中に得る。</li>
	</ol>
</li>
	<li>カプセル化パラメータを設定します。<ol>
<li>エンキャップスレーターマシンの速度を最大押出速度(8.9 mL/min)、電圧を1.0kV、周波数を5,500 Hzに設定します。 注:これらのパラメータは、直径550μmのマイクロビーズを得るために以前に最適化されました。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 製造
<ol><li>マイクロビーズを製造します。<ol>
<li>20 mLシリンジで、セルアルギン酸懸濁液の5 mLをロードし、エンカプスルタに注射器を取り付けます。</li>
		<li>フィーダーを通してセルアルギネート懸濁液を押す流れを活性化することによって、エンキャップスレーターを開始します。液滴の流れはノズルを通して押し出される。</li>
		<li>廃棄物ビーカーの最初の1 mLを収集し、最初の不均一な流れを無効にします。</li>
		<li>残りの4mLを実行し続け、液滴がCaCl2ゲル化浴に入るようにします。各ミリリットルは別々に(しかし、連続して)実行し、必要に応じて4つの異なるゲル化浴で収集することができます。 注:ゲル化浴に接触すると、液滴中のアルギン酸塩は、ゲル化浴中のカルシウムイオンと瞬時に架け、球状のマイクロビーズを形成します。</li>
		<li>1分後、磁気プラットフォームからゲル化ビーカーを取り出し、マイクロビーズが攪拌することなくさらに4分間座るようにします(室温でマイクロビーズ全体に完全なゲル化を可能にするために必要な時間)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>マイクロビーズを取り出します。<ol>
<li>生殖不能ピンセットのペアを使用して大きなアルギネートの破片やアーティファクトを取り除き、無菌のプラスチックピペットを使用して74 μmメッシュフィルターに移し、ゲル化浴からマイクロビーズを取り出します。</li>
		<li>適切な培養培地を用いてマイクロビーズを遠心管に移し、細胞培養培地で5分間平衡化できるようにする。</li>
		<li>インキュベーションとさらなる実験のためのフラスコ、プレートまたはペトリ皿に転送します。 注:ゲル化浴は再利用しないでください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. マイクロビーズの試験と使用
<ol><li>マイクロビーズの品質をテストします。<ol>
<li>カプセル化および培養後の細胞生存率(またはその他の生物学的読み出し)を評価するために、マイクロビーズを穏やかに破壊し、溶解ミックスを使用してカプセル化された細胞を放出する。 注:溶解ミックスの必要な体積は、試験ごとに使用されるマイクロビーズの数に依存します。推奨される配給は、封入細胞の1mL毎に溶解混合の4mLである。このステップは、各マイクロビーズ集団を1回のサンプルで行う必要があります。</li>
		<li>細胞培養インキュベーター中の細胞を37°Cで5%CO2を10分間補充する。</li>
		<li>トリパンブルーで細胞を染色し、血球計室を使用して、通常どおり溶液中の細胞の細胞生存率を推定します。 注: 細胞の生存率の推定に自動セルカウンタを使用する場合は、アルギネートアーティファクトがカウントに干渉しないように注意する必要があります。これらの場合、ノール細胞カウントが助言される。</li>
		<li>マイクロビーズの安定性を評価するには、顕微鏡とイメージングソフトウェアを使用して、各マイクロビーズ集団からのサンプルの平均直径を時間経過にわたって測定します。直径の劇的なその後の変化は、アルギン酸劣化を示すことができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>分泌されたAβの検出にはマイクロビーズを使用してください。<ol>
<li>7PA2細胞からのサンプル細胞培養培地を標準条件(2D)で24時間間隔で培養し、さらに分析のために-20°Cで保存する。</li>
		<li>24時間間隔で標準条件(3D)で培養したカプセル化された7PA2細胞からのサンプル細胞培養培地を-20°Cで保存し、さらなる分析を行う。</li>
		<li>酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)により7PA2細胞から集められた条件付き培養培養培養物へのAβの分泌を検出する(図4)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>マイクロビーズを使用して、関連するアプリケーションでのさらなる研究を行います。 注:カプセル化された7PA2細胞は、任意またはモデルにおける持続的なAβ分泌の効果を評価するために使用することができる。<ol>
<li>脳内のラット海馬内の微生物ビーズの生着の場合は、ラット脳の1mm厚の冠状断面を生成し、手術用ツールを使用してマイクロビーズを所望の領域に挿入する(図5)。</li>
		<li>記載されたプロトコルに従ってアルギン酸マイクロビーズに異なる細胞タイプをカプセル化し、目的とする生体分子の持続放出を評価する。インビトロおよびインビボシステムで関連するモデル化することができる。</li>
		<li>フローサイトメトリーおよび/または免疫蛍光を用いて、封入細胞の膜結合マーカーの発現を検出する。 注:腫瘍質量増殖およびバイオマーカー発現の初期段階をモデル化するマイクロビーズの製造のための同様の方法の使用の例は、Rios 20によって説明される。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者は何も開示していない。

本稿で概説する方法は、アルギン酸マイクロビーズ27の狭いサイズ分布を達成する細胞をカプセル化するのに有用である。また、免疫単離環境17,19で細胞を成長させる利点を与え、外部ストレスから細胞を保護する。さらに、アルギン酸中の細胞のカプセル化は、生理学的条件をより密接に模倣し、特に細胞間相互作用およびマトリックス剛性20に関する。これらの因子はすべて、生体内生体生着のような関連用途での後続の使用のために特に重要であり、周囲の組織17における潜在的な免疫反応を排除する。さらに、このプロトコルの主な利点は、目的のアプリケーションに応じて簡単にチューニング可能です:プロトコルを変更し、より大きくまたは小さく、より柔らかいまたは硬いビーズの製造のためのパラメータを最適化することが可能です。記載された方法は、最小限に侵襲的な方法で注入されるほど小さいビーズを製造するために使用され、多数の細胞を宿主と十分な大きさで、観察可能な行動および病理学的効果をもたらすAβの十分な放出を提供する動物モデルの注射時に。
このプロトコルの成功は、多くの重要な手順に依存します。慎重な細胞処理と最適な細胞培養技術は、細胞の生存率および機能20、28を維持するために重要である。標準的な培養条件を使用すると、観察されるように、7PA2細胞の正常な機能の保全を保証します。これにより、2D培養と比較した場合に封入細胞からAβ1〜42に対して同様の放出プロファイルが可能になります。さらに、プロトコルが最適に動作するために、低粘度アルギン酸溶液は、高粘度アルギン酸溶液と比較してより良い結果を保証します。これは、同種の層ジェットがノズルを介して押し出され、製造されたビーズ27のマトリックス内の細胞の均一な分布を保証する。細胞をカプセル化するために使用される材料は、形状の保持を可能にする非常に迅速なゲル化機構を持っている必要があります。
このプロトコルのもう一つの重要なステップは、ゲル化後の製造されたマイクロビーズの取り扱いです。ここでは、大口径プラスチックピペットを用いてビーズを転写してマイクロビーズの取り出しを示す。あるいは、マイクロビーズを含む塩化カルシウム溶液をメッシュフィルターに注ぎ込んで、ビーズ検索に用いることができる。大きな(5、10または25 mL)血清ピペットを使用してマイクロビーズを描き、注ぐ代わりにメッシュフィルターを通して洗浄することができます。この利点は、注ぐに比べて手順の無菌性に対する信頼性が高い。しかし、限界のは、マイクロビーズの大部分が救出されない場合、より低い収率を危険にさらすことに加えて、ピペットによって圧縮された場合、いくつかのビーズが歪む可能性があることです。
このアプローチは、異なる疾患(例えば、カプセル化された膵島からのインスリンの放出)をモデル化し、研究するために異なる細胞株をカプセル化するために使用されてきた。我々のアプローチの目新しさは、このプロトコルを用いて生成されたマイクロビーズの生体中のアルツハイマー病の重要な側面をモデル化する上で有用な方法である。カプセル化された細胞からのAβの放出プロファイル(図4)をボーラス注射によって生成されたAβのレベルと比較すると(他の研究3、26で報告されているような)、Aβのより慢性的で持続的な放出は、Aβのより慢性的で持続的な放出であり、かつ持続的に期待。図6は、達成され得る予測傾向を示す。生体内モデリングにこのシステムを使用することは、疾患の進行方法により関連性が高く、創薬および開発においてより有用である可能性があります。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig6.jpg"> 図 6: ボラス注射と比較して封入された7PA2細胞からのAβ1-42の予測放出プロファイル。 生着した7PA2含有マイクロビーズからのAβ放出のプロファイルは、ADとの関連性の動物モデルにおける慢性および持続性Aβの効果の試験を可能にする。逆に、ボーラス注射は、短期間にAβレベルのスパイクを作成し、その後、脳からのAβの急速なクリアランスを作成します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig6large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

神経変性疾患のモデリングは、脳の複雑で複雑な性質のために困難です。アルツハイマー病(AD)では、シナプス機能の進行性の喪失とニューロンの死は、アミロイド前駆体の異常な処理に続くアミロイドβ(Aβ)ペプチドの持続的な過剰産生および蓄積の下流効果であると考えられている。アミロイドカスケード仮説1に従うタンパク質(APP)。
このアミロイド誘発病理のメカニズムを理解し、新しい治療標的の同定を支援するために、科学者は生体内前臨床モデルで様々な開発を行ってきた。モデルの1つのカテゴリーは、ラット脳2、3、4に合成Aβペプチドのボーラス注射を利用する。このようなモデルの主な制限は、それらは一度にすべて堆積高濃度でAβペプチドで単一点または繰り返し治療に依存していることです。これは、疾患5におけるAβの放出の慢性的で持続的な性質と矛盾する。生体内モデルの別のカテゴリーは、疾患6、7、8、9、疾患の家族変動と関連する1つ以上の遺伝子変異を発現するトランスジェニック動物モデルである。 10.しかし、家族性ADは全アルツハイマー症例11の5%未満しか占めないため、ヒトにおける散発的なADへの翻訳におけるこれらのモデルの関連性は疑わしい12である。トランスジェニックアプローチのもう一つの欠点は、出生時からの加速されたAβ形成であり、これは認知機能の欠損と病理学的変化にあまりにも迅速かつ積極的に患者12の散発性ADの疾患進行に似ている。.たとえば、5x FAD モデルでは、わずか 1.5 か月13でプラークが生成されます。
興味深いことに、これらのカテゴリーは両方ともAD研究2、3、4、5、6との関連性の認知機能の変化をもたらし、時にはそれらは、アミロイドプラーク6、8、タウリン酸化6、7および/またはシナプスおよび神経喪失7、9などの疾患の病理学的特徴の出現 14.しかし、これらのタイプのモデルは、多くの場合、ADの後期段階に関連する脳内のアミロイドの高レベルの効果に関する洞察を与えるかもしれませんが、彼らはAβへの慢性的かつ持続的な暴露に応答して示された以前の変化を反映しません。 ペプチド12は、シナプスマーカー15および細胞外マトリックス16中の成分の改変発現などである。したがって、生体内認知における持続的なAβ分泌の影響をより正確に示し、病理の変化を示す慢性モデルを作成する必要性が依然として残っている。
この目的のために、我々は、その後、成人ラット脳内に移植することができ、ヒドロゲルマイクロビーズ内のアミロイド分泌細胞を固定化することにより、制御された方法でAβの一定の持続的な分泌を可能にするシステムを開発しました。散発的なADの。
アルギン酸塩は、生体適合性であり、生体内17に移植された場合に有害反応を誘導しないため、選択された生体材料であった。アルギン酸ヒドロゲル中の細胞カプセル化は、過去40年間にわたり十分に確立されています。クリニックへのその翻訳の最初の例は、1型糖尿病17型の治療のために報告された。ランゲルハンス島のカプセル化に成功した最も初期の報告は1980年にさかのぼります。インスリン分泌細胞を含むマイクロビーズの移植は、膵臓機能を回復させ、インスリン注射療法18の必要性を排除する糖尿病患者の治療選択肢に革命をもたらした。これらの作品は、細胞カプセル化が機械的または化学的かどうかにかかわらず、外部のストレスからそれらを保護する方法について報告します。実際、アルギン酸ビーズはバリアとして機能し、その表現型を保持する周囲の環境から細胞を単離し、細胞副産物の栄養素およびクリアランスのための周囲の媒体への十分なアクセスを可能にする19。さらに、アルギネートの使用は、軟部組織20の機械的特性の一致を可能にする。アルギネートヒドロゲルは、単にアルギネート濃度および架橋密度20、21を変化させることによって、1〜30kPaの剛性を有するように調整することができる。これは、インビトロでカプセル化された細胞の表現表現を維持するだけでなく、生体内22に生まれ変わりした後の炎症作用を避けるためにも、本質的な側面である。
このプロトコルでは、7PA2細胞-ヒトAPP V717F変異遺伝子23で安定的にトランスフェクトされる中国ハムスター卵巣細胞株が使用される。これらの細胞は、Appの触媒産物を連続的に産生し、Aβ1-4224、25を含む、かつ前臨床における合成生産の代替としてAβを生成するために使用されてきたが、生体内研究26における急性。生体分子の持続的分泌を可能にするように設計された「ソフト」アルギネートマイクロビーズ内の7PA2細胞を固定化する製造方法について述べた。概念実証として、時間の経過に一度のAβ1-42ペプチドの放出について報告する。使用されるアルギネートは、分子量が120,000~190,000g/molの低粘度アルギネートで、マンヌロン酸とグルロン比は1.56(M/G)です。
さらなる研究では、これらのマイクロビーズは、ADに関連するラット脳の領域内(例えば、海馬)内に安全に移植することができ、生体内および病理学ex vivoにおける行動に対する慢性Aβ分泌の影響を研究することができる。さらに、このシステムは、インビトロおよびex vivoアプリケーションにおける慢性Aβ放出の効果を研究するために使用することができる。例えば、7PA2含有アルギン酸微生物ビーズは、ニューロンまたは星状の培養とインビトロで共培養することができ、ADに関連する細胞機構に対する慢性Aβ曝露の影響を評価することができる。さらに、この方法は、ex vivo電気生理学における慢性Aβ産生と長期増強との関係を調べるために用いることができる。
このプロトコルのハイライトは、製造方法のモジュール性と柔軟性であり、製造パラメータを微調整することにより、ターゲット寸法を有するアルギネートビーズの製造を可能にします。アプリケーションに応じて、プロトコルは、マイクロビーズサイズ、カプセル化された細胞の密度、およびマイクロビーズ剛性に関して特注ターゲットを得るために調整することができる。このプロトコルは、様々な細胞タイプのカプセル化に使用することができ、異なる病態を研究するために、より関連性の高い3次元(3D)をインビトロモデルで開発する。我々は最近、癌進行の初期段階をモデル化するためにアルギネート封入細胞を使用する方法について報告した20.
カプセル化プロセスの概念は、ノズルを介してアルギン酸溶液中に懸濁された細胞の層ジェットの押し出しに基づいています。振動ヘッドは、制御された周波数でジェットを破壊し、同じ大きさのアルギン酸ベースの液滴を生み出します。外部電界は、形成されたアルギン酸系液滴を分離することができ、カルシウムイオンなどの二種イオンに富んだ溶液と接触すると、球状の形状を維持し、迅速に架け離すことができます。ゲル化溶液中のインキュベーションは、均質な物理ヒドロゲル27内の細胞を含む球状マイクロビーズの形成を可能にする。マイクロビーズおよびアルギネートヒドロゲルの標的サイズは、<s></s>長期間(数週間)の細胞培養培養剤との栄養素と酸素交換を可能にする。図 1使用するカプセル化装置の概略表現を示す(図1B)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig1.jpg"> 図 1: カプセル化システム。(A) カプセル化システムの概略表現。アルギネート細胞懸濁液をシリンジ(2)に装填し、シリンジポンプ(1)に設定された押出速度で貯留槽を通して供給する。貯水池では、振動帽子(3)が波形発生器(4)によって設定された周波数で振動し、等しい間隔で流れを破壊し、等しいサイズの液滴を形成する。溶液がノズル(5)を介して供給され、液滴が形成されると、電圧発生器(6)によって設定された電極(7)に静電電位が適用され、液滴の表面をわずかに充電し、反発の結果として流れが広がります。静電力。液滴がゲル化浴(8)に関与するにつれて、Ca2+-アルギン酸の駆動架橋は球状マイクロビーズの形成をもたらす。(B) アルジン酸マイクロビーズの製造前のカプセル化剤の写真。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig1large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
マイクロビーズのサイズは、用途に応じて変更できます。マイクロビーズのサイズを制御するために、図1Aおよびプロトコルで概説されている様々なパラメータがそれに応じて調整される。使用されるノズルの内部直径は、液滴のサイズに大きな影響を与えます。さらにカプセル化パラメータ、すなわち押し出し速度、振動周波数、電圧を調整することは、一貫したサイズ分布を達成するための鍵となります。テーブル1は、異なるパラメータがこのシステムで実現するマイクロビーズのサイズを変更する方法を概説します。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">パラメーター</td>
			<td>ノズルサイズ</td>
			<td>振動周波数</td>
			<td>流量</td>
			<td>電極電圧</td>
		</tr>
<tr>
<td><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"></td>
			<td><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"></td>
			<td><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"></td>
			<td><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"></td>
		</tr>
<tr>
<td>ビーズサイズ</td>
			<td>
<img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg">
</td>
			<td><img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/59597/59597img02.jpg"></td>
			<td><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"></td>
			<td>–</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1:製造パラメータとマイクロビーズサイズへの影響。この表は、ノズルと使用される溶液の粘度に関係なく、各パラメータが製造されたマイクロビーズの結果として生じるサイズにどのように影響するかを示しています。

<table><tbody><tr><td>&マイクロ;マネージャーソフトウェア</td><td>Vale Lab, UCSF, USA</td><td>v.1.46</td><td></td></tr><tr><td>0.22 um PES filter</td><td>Merck, UK</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>15mm Netwell insert 74 um mesh filter</td><td>Constar, usa</td><td>#3477</td><td></td></tr><tr><td>褐藻類由来のアルギン酸ナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich,uk</td><td>A0682</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>Sigma-Aldrich,uk</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>セルタイター96&nbsp;AQueous One Solution 細胞増殖アッセイ</td><td>Promega, USA</td><td>G3580</td><td></td></tr><tr><td>Encapsulator</td><td>Inotech</td><td>IE-50</td><td>serial no. 05.002.01-2005</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich,uk</td><td>H4024</td><td></td></tr><tr><td>Hu A&beta; 1-42 ELISA</td><td>ThermoFisher, UK</td><td>KHB3441</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>ImageJ</td><td>v1.49p</td><td></td></tr><tr><td>倒立光学顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>ライカ顕微鏡</td><td>ライカ マイクロシステムズ 英国</td><td>DMI6000B</td><td></td></tr><tr><td>Neo sCMOS カメラ</td><td>アンダー、英国</td><td>5.5</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Sigma-Aldrich、英国</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich、英国</td><td>433209</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸トリスジウム二水和物</td><td>Sigma-Aldrich、英国</td><td>W302600-K</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA溶液</td><td>Sigma-Aldrich、英国</td><td>T4049</td><td></td></tr></tbody></table>

アルツハイマー病のモデリングに用いられるアミロイドβ分泌アルギン酸マイクロビーズの製造

Fabrication of Amyloid-&#946;-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

アミロイドカスケード仮説によると、アルツハイマー病(AD)の発症における最も初期の引き金は、有毒なアミロイドβ(Aβ)フラグメントの蓄積であり、最終的には疾患の古典的な特徴につながる:アミロイドプラーク、神経線維性のもつれとシナプスと神経の損失.疾患の進行を反映する関連する非トランスジェニック前臨床モデルの欠如は、効果的な薬物治療の発見を妨げる主な要因の1つである。そのために、慢性Aβ産生の効果の研究に有用なアミロイド分泌細胞を含むアルギネートマイクロビーズの製造プロトコルを開発しました。
ヒトAPP遺伝子で移植された中国ハムスター卵巣細胞は、Aβ(すなわち、7PA2細胞)を分泌し、本研究で用いた。Aβの持続放出のためのインビトロモデルにおける3次元(3D)を、アルギン酸中の7PA2細胞の封入により製造した。このプロセスは、生体内研究をさらに進めるために500〜600μmのビーズ径を標的にするために最適化された。アルギン酸塩中の7PA2細胞カプセル化の最適化は、例えば、アルギン酸濃度、ゲル流量、静電電位、頭部振動周波数、ゲル化溶液の改変を行った。分泌されたAβのレベルは、時間の経過とともに分析され、アルギネートビーズと標準的な細胞培養方法(最大96時間)と比較した。
HEPESで緩衝した1.5 x 106 7PA2細胞/mLの濃度と2%(w/v)のアルギン酸濃度を5分間0.5M塩化カルシウムでゲル化し、最も安定なマイクロビーズを製造することが分かった。製造されたマイクロビーズは、1)均一なサイズの1)、2)平均直径550μm、3)マイクロビーズ当たり約100〜150細胞を含有し、4)Aβを分泌することができる。
結論として、アミロイド産生7PA2細胞を含む安定アルギン酸微生物ビーズの製造に最適化された方法により、インビトロとインビボの両方でADの重要な側面のモデリングが可能になる可能性があります。

7PA2細胞は、アルギン酸マイクロビーズに正常にカプセル化されています 調製後、このプロトコルを用いて均一な球状アルギネートマイクロビーズが正常に生成される。次の図 2Aの画像は、パラメータの 1 つ (電圧) を変更すると、アルギン酸液滴の流れと分散がどのように変化するかの例を示しています。図 2Bは、ゲル化処理直後に得られたアルギネートビーズの一例を示す。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig2.jpg"> 図 2: 製造方法の最適化。(A) 河川分散の変化を示す写真。(B)製造直後のアルギネート球状マイクロビーズを示す明視野画像。(C) 最適化ステップの例:選択した製造パラメータを調整して、目標マイクロビーズサイズを達成する。各パラメータと得られるマイクロビーズのサイズとの関係を示す選択されたグラフ(少なくともn=100マイクロビーズからのサイズ分布)。ノズル内径、吐出液の粘度およびゲル化条件は、製造されたビーズのサイズにも影響を与える可能性があります。エラー バーは S.D. を表<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig2large.jpg" target="_blank">し、この図の大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください。</a>
記載されたプロトコルは柔軟であり、アルギン酸ベースのマイクロビーズの異なるサイズの製造を可能にし、用途に応じて組成が変化する。図2Cでは、300μmのノズルを介して押し出されたHEPES(pH 7.2)の2%(w/v)アルギン酸溶液を用いて、マイクロビーズサイズに対するアルギン酸流量、電圧、周波数の影響を報告する。
本研究の範囲は、ラット脳内に埋め込むことができるマイクロビーズを作製することであったので、作製パラメータを調整し、500~600μmの範囲の平均マイクロビーズ径を得た。品質管理の目的のために、この方法は、製造されたビーズの母集団全体の変動を最小限に抑えるために最適化されました(すなわち、狭いサイズ分布)。(1)産生ビーズは、20G針を装備したハミルトン注射器を使用してラットの脳に注入することができることに注意してください。そして(2)ラット脳の1つの半球は、このサイズの2つまたは3つのビーズをホストすることができます。
最適化後、HEPESで緩衝した2%(w/v)アルギン酸溶液に懸濁した1.5 x 106細胞/mLの濃度で7PA2細胞を封入し、0.5M塩化カルシウムゲル化浴に投下し、所望のマイクロビーズを得た。図 3以下は、標準的な細胞培養条件で1日後にマイクロビーズに均等に分布するカプセル化された7PA2細胞を示す。7PA2細胞増殖は、製造元のプロトコルに従ってMTSアッセイを用いて試験した。7日間のアルギネートの有無にかかわらず増殖した7PA2細胞の挙動には有意差はなかった(図3B)。カプセル化された細胞を標準的な培養条件でインキュベートする場合、細胞は実験の期間中にわたって増殖し続けると予想され、その結果、細胞脱出の小さな程度が期待され、他の作品28で報告される。この効果は、より小さな細胞密度でカプセル化するか、マイクロビーズがインキュベートされる血清濃度を低下することによって軽減することができる。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig3.jpg"> 図 3:カプセル化された7PA2細胞。(A)アルギネートマイクロビーズ全体の細胞分布も示す封入された7PA2細胞の明視野画像。製造パラメータは、ビーズあたり〜150 7PA2細胞を得るように設定した。7日間の培養においてアルギン酸ビーズに有意な変動は認められなかった。(B)アルギン酸を用いてインキュベートした7PA2細胞の全体的増殖とアルギン酸を用いずにインキュベートした細胞との間に差は認められなかった。7PA2細胞は、アルギネートビーズの体積を横切って成長し、移動します。血清濃度の低下は、細胞の増殖を遅くすると考えることができる。エラー バーは S.D. を表<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig3large.jpg" target="_blank">し、この図の大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください。</a>
7PA2細胞を封入するアルジン化マイクロビーズは、時間の経過とともに安定しています 得られたアルジン酸マイクロビーズの大きさや形状を調べるために、製造・ゲル化後に顕微鏡分析を行った。選択されたプロトコルを使用して得られたマイクロビーズの平均直径は550±2 μmである。
理論的には、直径550μmのマイクロビーズで期待される細胞数は、次のように計算できます。
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597eq1.jpg">
ここで、V = ボリュームとr = 半径。単一のマイクロビーズの体積はV = 8.8 x 10-5 mLです。したがって、封入時のマイクロビーズ当たりの細胞数= (1.5 × 106)x (8.8 x 10-5)≥ 130 セル。
実験的に、製造直後に封入細胞の数を数えた。アルギネートビーズを溶解ミックスを用いて穏やかに破壊し、細胞をトリパンブルー溶液で染色した。細胞の生存率推定および計数は、血球計を用いて行った。得られた結果は、マイクロビーズあたり平均116±17の生細胞を示した(n =5、データは報告されていない)。予想通り、カプセル化直後の理論細胞数と実験細胞数のわずかな差が認められた。一部の用途では、特に時間の経過とともに放出されたAβの量を決定するためには、各アルギン酸ビーズに封入された細胞の数を予測することが重要である。
興味深いことに、カプセル化プロセスは細胞の生存率に大きな影響を与えません。結果は、大腸癌細胞(すなわち、HCT-116)が同様の方法を用いてカプセル化された前の研究で報告され、2D対照20と比較してアルギン酸マイクロビーズにおける細胞生存率に差はない。
封入プロセスで使用されるアルギン酸塩の安定性を測定するために、14日間(n=100)にわたってマイクロビーズ径を測定しました。カプセル化直後と比較して、カプセル化後14日目の平均直径の変化は観測されなかった(データは報告されていない)。
カプセル化された7PA2細胞は、時間の経過とともにAβを放出する 7PA2細胞の2Dおよび3D培養物から分析された条件付き培養培養物は、Aβ1-42レベルの一定の増加を明らかにする。細胞培養培養培養を24時間毎にサンプリングし、最大4日間、ELISAを用いて分析した。我々のデータは、マイクロビーズ(3D)からのAβ1-42の放出速度が2D培養から放出されるプロファイルと類似していることを示している(図4)。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig4.jpg"> 図 4:7PA2細胞からのAβ1-42分泌率。(A) Aβ放出(4日後に正常化した%)インビトロモデルの2Dおよび3Dモデルは、同様のプロファイルを有する。両方のモデルは、4日間にわたってAβレベルの一定の増加を示し、予想通り、安定した濃度に達していない。(B)Aβ1-42の濃度は初期細胞数に正規化され、培養方法にかかわらず経時にAβ1〜42の同様の分泌を示す。 アルギン酸塩の存在もカプセル化のプロセス(3Dインビトロモデル)もAβ1-42の分泌を変えない。エラー バーは S.D. を表<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig4large.jpg" target="_blank">し、この図の大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください。</a>
カプセル化された7PA2細胞の潜在的応用 我々は、アルギン酸マイクロビーズに封入された7PA2細胞がAβ1-42の持続放出に有効に使用できることを報告し、したがって、任意の前臨床モデルにおける慢性Aβ分泌の効果を試験するために使用される。図5では、ラットの脳内に容易に注入して配置できるアルギン酸マイクロビーズを用いる利点を示す。Ex vivoセクションは、ミリメートルのアルギネートビーズと製造されたアルジン酸マイクロビーズを比較する、イラストレーションの目的で使用されます。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig5.jpg"> 図 5: 関連する前臨床アプリケーションにマイクロビーズを使用する。ラット脳の生着のためのマイクロビーズは、脳の変性に損傷を避け、正常な脳機能に悪影響を与えるために大きすぎる病変を作成せずに埋め込まれるのに十分小さくなければなりません。画像(A)は、ミリメートルスケールのビーズとマイクロメートルスケールのビーズを並べてサイズ比較した結果を示しています。(B) 生体内でミリメートルスケールのビーズを脳内に埋め込むとはうまくいかない。画像(C)は、このプロトコルを用いて製造されたマイクロビーズを示す。サイズは、正常な生理学に有害な影響を与えることなく、ラットの海馬内への挿入に適しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig5large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
上の画像は、このような研究のためのマイクロビーズのサイズを制御することの重要性を強調しています。ここでは、直径600μm以下のマイクロビーズを用いる利点を実証する。これにより、最小限に侵襲的な注射(例えば、ハミルトン注射器)を使用して、脳内の注入されたビーズの位置をより良く制御することができます。
要約すると、7PA2細胞をカプセル化すると、マイクロビーズのサイズ、カプセル化された細胞の数およびマイクロビーズから分泌されるAβの予測(例えば、濃度、放出プロファイル)を制御できます。マイクロビーズのサイズを制御することは、2つの理由から不可欠です:1)放出されたAβの濃度を微調整制御を可能にし、2)ラット脳の制御された領域に移植を可能にする。ここで得られた結果は、アルギネートマイクロビーズの顔のチューニングを記述し、さらなる研究のための潜在的な応用を強調する。

このプロトコルは、細胞を固定化するアルギネートの急速な物理的ゲル化による細胞封入方法を示す。得られたマイクロビーズは、時間をかけてアミロイドβの制御および持続的な分泌を可能にし、インビトロおよびインビボモデルで分泌されたアミロイドβの効果を研究するために使用することができる。

According to the amyloid cascade hypothesis, the earliest trigger in the development of Alzheimer&#8217;s disease (AD) is the accumulation of toxic ...

このプロトコルは、放出速度と関心のあるタンパク質であるアミロイドの量を制御するために使用されるマイクロビーズの製造について説明します。マイクロビーズは、適切な生体材料で細胞を固定化し、周囲の環境から保護するだけでなく、副産物や栄養素を周囲の環境と交換できるようにします。この技術を用いて細胞をカプセル化することで、マイクロビーズのサイズと細胞数の厳密な制御が保証され、様々な製造パラメータを調整することでこれを行います。したがって、このプロトコルに記載されている細胞をカプセル化すると、インビトロ系とインビボ系の両方で使用するアミロイドの慢性的な放出が増え、病気のメカニズムをよりよく理解し、新しい治療法をテストすることも可能になります。この方法は、制御系を処方し、単独でも組み合わせでも、多くの細胞タイプの生体分子の放出を研究するために使用することができます。まず、インキュベーターからコンフルエントに近いフラスコを取り除きます。0.25%トリプシン-EDTA溶液で細胞を処理し、細胞を取り外すために5〜10分間37 Cでインキュベートします。DMEM/F12培地を添加した後、50ミリリットルのチューブに細胞を集めます。細胞を1000RPMで5分間遠心分離する。上清を取り除き、HEPES緩衝生理生理にペレットを再懸濁し、最終的に所望の細胞濃度を2倍にします。50ミリリットルの遠心分離管に、この細胞懸濁液を4%重量および体積アルギン酸溶液と1対1の比率で混合し、2%重量および体積アルギン酸溶液中の所望の細胞濃度を含む最終的な懸濁液を得る。カプセル化パラメータを設定するには、カプセル化機の速度を最大押し出し速度に設定し、電圧と周波数を設定します。マイクロビーズを製造するには、20ミリリットルのシリンジに、5ミリリットルの細胞アルギン酸懸濁液をロードし、封入器に注射器を取り付ける。カプセル化器を起動するには、セルアルギン酸懸濁液をフィーダに押し込む流れを活性化し、ノズルを通して液滴の流れが押し出されます。最初の不均一な流れを避けるために、廃棄物ビーカーに最初の1ミリリットルを収集します。その後、残りの4ミリリットルを実行し続け、液滴が塩化カルシウムゲル化浴に落ちるようにします。ゲル化浴に接触すると、液滴中のアルギン酸は、ゲル化浴中のカルシウムイオンと瞬時に交配し、球状マイクロビーズを形成する。1分後、ゲル化ビーカーを磁気プラットフォームから取り出し、マイクロビーズを攪拌することなくさらに4分間休ませて室温でゲル化を完了させます。マイクロビーズを取り出すために、まず滅菌ピンセットを使用して、大きなアルギン酸破片またはアーティファクトを除去します。プラスチックピペットの端部を切断した後、それを使用して、ゲル化浴から、廃ビーカーの上に保持された74マイクロメートルのメッシュフィルターにマイクロビーズを移します。成功を確実にするために、マイクロビーズの損傷を避けるためにプラスチックピペットの端を常に切断し、カプセル化後にビーズを1隻から別の容器に移すたびにこれを行います。遠心管の上にメッシュフィルタを反転させます。その上に適切な培養培地をピペットしてビーズをチューブに洗い、その培地内で5分間平衡化させます。次に、インキュベーションおよびさらなる実験のために適切な培地で満たされたフラスコにそれらを移します。カプセル化および培養後の細胞生存率を評価するには、溶解ミックスを加えてマイクロビーズを穏やかに破壊し、カプセル化した細胞を放出する。細胞培養インキュベーターで細胞を37°Cで5%の炭酸ガスを10分間穏やかな攪拌でインキュベートする。トリパンブルーで染色し、血球計室を使用して、これらの細胞の細胞生存率を推定する。マイクロビーズの安定性を評価するには、顕微鏡およびイメージングソフトウェアを使用して、各マイクロビーズ集団からのサンプルの平均直径を経て測定します。調製後、このプロトコルを用いて均一および球状のアルギン酸マイクロビーズが正常に生成された。標準的な細胞培養条件で1日後、7PA2細胞をカプセル化し、マイクロビーズ中に均等に分布した。MTSアッセイを用いて7PA2細胞増殖を試験した場合、7日間にわたってアルギン酸の有無にかかわらず増殖した7PA2細胞の挙動に有意な差はなかった。7PA2細胞の2Dおよび3D培養物から分析されたコンディショナラな培地は、両方の培養においてアミロイド-β1-42レベルの一定の増加を明らかにした。マイクロビーズ(3D培養)からのアミロイドベータ1-42の放出速度は、2D培養物から放出されるプロファイルと類似している。アルギネートマイクロビーズにカプセル化された7PA2細胞は、アミロイドベータの持続放出に有効に使用することができる。ラット脳に生着するためのマイクロビーズは、大きな病変を生じることなく埋め込まれるほど小さくなければならない。生体内の目的のために脳内にミリメートルスケールのビーズを埋め込むのは機能しませんが、このプロトコルを使用して製造されたマイクロビーズはラットの海馬内に挿入するのに適したサイズを有する。最終製品の細胞の分布が均一であることを確認するには、細胞アルギン酸懸濁液中の細胞を徹底的に混合することが重要であり、これは各マイクロビーズからのアミロイドの均一な放出を保証します。

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JoVE Journal

Biology

生物学

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β-アミロイドオリゴマーの調製 1から42まで</sub海馬スライスでのシナプス可塑性の減損の>と誘導

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合成アミロイド β 蛋白の脳室内投与によるラットの動物モデルにおけるアルツハイマー病の貴重な模倣の確立

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A11 肯定的なアミロイド β オリゴマーの合成と評価を使用してドットのしみが付く分析

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出芽酵母 γ-セクレターゼによるアミロイドベーターゼ産生に影響を与える遺伝子、突然変異、および化学物質をスクリーニングするためのアルツハイマー病のモデル

学ぶアルギン酸マイクロビーズによる細胞封入法で、アミロイドβの制御放出を実現する技術です。7PA2細胞を用いたin vitroおよびin vivoモデルで、アルツハイマー病の病態解明と治療法開発に貢献します。

アルツハイマー病のモデリングに用いられるアミロイドβ分泌アルギン酸マイクロビーズの製造

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