多角光散乱に結合したサイズ排除クロマトグラフィーによるタンパク質の特性化(SEC-MALS)

SEC-MALSは、溶液中の高分子の分子量、大きさおよび立体構造を決定するための定量的方法である。オリゴマーや複合体を識別し、糖タンパク質や膜タンパク質などの難しいサンプルを特徴付けることができます。SEC-MALS は絶対メソッドです。

それは基礎物理学に依存し、分子標準、分子の立体構造、または分離媒体との相互作用に対するコラボレーションに依存しません。SEC-MALS は、秒で区切られた多くのシステムに適用できます。ペプチドや小さなポリマーからタンパク質、ヌクレオキャプシド、多糖類、合成ポリマー、ウイルス様粒子、小ウイルスまで。

システムとバッファーが、低粒子含有量に関するベンダーの推奨事項を見逃していることを確認することが重要です。ベンダのテクニカル サポート担当者に問い合わせてください。テキスト プロトコルで説明されているように、SEC-MALS システムの準備からこの手順を開始します。

各PLCグレードの試薬を使用して、50〜100ミリモル塩化ナトリウムでリン酸緩衝生理食塩水の1リットルを調製します。ボトルアップポリエーテルセルフォームフィルター、または同様を使用して、バッファーを0.1ミクロンにフィルタリングします。乾燥フィルターから微粒子を除去するために、バッファーの最初の 50 ~ 100 ミリリットルを廃棄物ボトルにフィルター処理します。

その後、残りを、以前に濾過された脱イオン水で洗浄した清潔で無菌のボトルにろ過し、ほこりが入るのを防ぐために保管します。バッファー内のカラムを平衡化し、微粒子を除去するために、1 分間に 0.5 ミリリットルの流量でカラムを一晩フラッシュします。FPLCの連続フローモードを使用し、すべてのSEC-MALSの実行が完了するまでフローが停止しないようにします。

夜間フラッシュ中に DRI フロー セルをパージ モードにします。フラッシュを開始する際、列の急激な圧力変化によって引き起こされる列の流出効果を防ぐために、流量を徐々に傾斜させます。サンプル実行を開始する前に、パージをオフにします。

柱の下流のチューブを軽くタップして、蓄積されたパーティクルを放出することで、システムの清潔さを確認します。MALS機器のフロントパネルディスプレイの90度検出器の信号を観察します。ピークからピークへのノイズが50~100マイクロボルト以下であることを確認します。

また、屈折率(RI信号)が10倍からマイナス7屈折率単位まで10倍未満に安定していることを確認します。ブランク注入を行い、インジェクタが粒子から汚れな状態であることを確認します。ブランクは、単に新鮮な、無菌バイアルで調製されたランニングバッファです。

粒子のピークが体積が1ミリリットル以下で、ベースラインより5ミリボルト以下の場合、システムはサンプルの準備ができています。それ以外の場合は、追加のブランク注射をクリーンになるまで実行するか、または注入器を洗浄するためのメンテナンスを行います。次に、SCCバッファーに1ミリリットルあたり1〜2ミリグラムで少なくとも200マイクロリットルのBSAを調製します。

注射器の先端フィルターを使用して、02ミクロンにタンパク質を濾過します。乾燥フィルターから粒子を除去するために、濾液の最初の数滴を捨てます。あるいは、試料を10,000倍Gで15分間遠心分離し、非可溶性凝集物および他の大きな粒子の沈殿を可能にする。

次に、100マイクロリットルのBSA溶液をループに注入する。MALS ソフトウェア メニューでメソッドから新しい実験を開きます。次に、光散乱システムメソッドフォルダからオンライン方式を選択する。

DLS検出器が存在する場合は、QELSフォルダを使用した光散乱からオンライン方式を選択します。構成セクションで、サンプルおよび移動フェーズのパラメーターを設定します。汎用ポンプビューで、FPLCで使用される流量を設定します。

次に、汎用ポンプビュー、ソルベントブランチ、名前フィールドに移動し、PBSを選択します。インジェクタ ビューのサンプル ブランチで、BSA という名前を入力します。dn/dc を 0.185 に設定し、A2 を 0 に設定し、UV 絶滅係数を 1 ミリグラムあたり 0.667 ミリリットルに設定します。

手順セクションの基本的なコレクション ビューで、自動挿入時のチェックボックストリガーを選択します。実行の継続時間を 70 分に設定し、SEC 列の総パーミネーション ボリュームに達するまで、全体のデータが全体の分析に対して収集されるようにします。実行ボタンをクリックして、MALS ソフトウェアで実験を開始します。

これは、MALS検出器を介してFPLC機器からパルス信号を受信した後、データの読み取りを開始します。計測器のフロントパネルのオートゼロボタンをクリックして、DRI信号をゼロにします。FPLCソフトウェアでの作業、手動に移動、手動の指示を実行し、マークを設定し、タンパク質と実行の名前を挿入します。

注入弁を手動負荷から注入に、流路下、注入弁に切り替える。IOボックスパルスデジタルアウトの下に0.5秒パルスを挿入してパルス信号を含めます。これにより、MALS ソフトウェアでデータ収集がトリガーされます。

次に、サンプルをループに挿入します。FPLC ソフトウェアで実行をクリックして、実験実行を開始します。MALS ソフトウェアの手順セクションで、分析をステップバイステップで実行します。

基本コレクション ビューをチェックして、UV、MALS、および RI でほぼ同じ影響量でピークが表示されることを確認します。ベースラインビューで、すべての信号のベースラインを定義します。ピークビューで、マウスをクリックしてドラッグして、解析するピークを定義します。

各ピークの中央50%を選択します。まず、モノマーピークを選択し、次にダイマーピークを選択します。各ピークの下で、BSAの280ナノメートルでdn/dcと絶滅係数の正しい値を確認してください。

手順の整列ビューで、マウスをクリックしてドラッグして、ピークの中央領域を選択します。[信号の位置合わせ] をクリックし、次に[問題ありません]をクリックします。手順では、バンドの広がり視野は、モノマーピークの中央50%を選択する。

屈折率検出器が参照機器として指定されていることを確認します。次に「適合を実行」をクリックし、UVおよび光散乱信号を屈折率信号に合わせて適用します。ピークを拡大して、中央の 50 ~ 70% 内で重なっていることを確認し、[大丈夫] をクリックします。

手順の正規化ビューで、ピーク 1 を選択します。RG 値として 3.0 ナノメートルを入力し、[正規化] をクリックして、[大丈夫] をクリックします。EASIグラフビューで結果のグラフを表示します。

ウィンドウ上部の表示ドロップダウンからモル質量を選択します。コントロールを使用し、クリックしてドラッグしてピーク領域にズームします。モノマーとダイマーピークの最終的な集計重量平均モルマス結果を表示するには、ピーク結果、モル質量モーメント、MWに移動し、結果に選択して、要約を報告します。

純度はピーク結果、質量分率の下で報告される。ファイルメニューから保存方法を選択し、分析したBSAデータを、すべての種類のタンパク質の将来の測定のための標準的な方法として保存します。BSAに対して決定された正規化およびバンドの広がりパラメータは、分析に引き継がれる。

ここに示されている BSA の SEC-MALS 分析、200 オングストローム孔サイズ除外列を使用しています。クロマトグラムトレースはモノマーピークに正規化され、明確にするためにオフセットされます。無視され得る一般的なアーチファクトは、光散乱信号の始まり付近の粒子ピーク、ならびに屈折率信号における総透過量付近の塩および溶存空気ピークを含む指摘される。

クロマトグラムは優れたモノマー-ダイマートリマー分離を示し、光散乱信号はノイズに対して高い信号を示す。モノマーおよびダイマー重量平均モル質量値は、高い均質性を示す。低品質のSEC-MALS分析の例を次に示します。

この例では、75オングストローム孔サイズ排除カラムでの不十分な分離は、タンパク質から十分に分離されていない8〜9分の間の粒子ピークをもたらす。ここでは、ノイズ比に対する信号が不十分であり、光散乱シグナルではタンパク質に隣接する広範な粒子が明らかである。良いSEC-MALS結果の鍵は、適切なカラムを選択し、システムが低光散乱ノイズで校正されていることを確認し、サンプルを事前にフィルタリングまたは遠心して粒子を除去することです。

SEC-MALSに続いて、タンパク質サンプルは、結合親和性、バイオライザ、表面プラズモン共鳴、等温滴定熱量測定、バイオレリド・フォロメトリー、マイクロスケール熱泳動、または組成の多角光散乱についてさらに分析することができる。タンパク質の構造は、X線結晶学、クライオ電子ミスクロスコピー、またはNMRによって決定され得る。