Name: 多角光散乱に結合したサイズ排除クロマトグラフィーによるタンパク質の特性化(SEC-MALS) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 学ぶ SEC-MALSによるタンパク質の絶対分子量とサイズ測定法。溶液中のオリゴマー、複合体、糖タンパク質の特性化に適用でき、標準物質に依存しない正確な解析が可能です。

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私たちは、Tsafiダニエリ博士(ヘブライ大学応用構造生物学センター)に助言とコラボレーションを感謝します。我々はまた、ダニエル・バイオテック社(レホヴォト、イスラエル)が本研究で利用した分析FPLC-MALSシステムの支援と確立に感謝する。

1. システムの準備
<ol><li>FPLCのUV検出器の下流にあるMALSとdRI検出器を接続します。それらは紫外線およびMALS検出器間の重要なインターテクタの容積を加えるのでpHおよび伝導性検出器をバイパスする。検出器との間のカラム間の0.25mm i.d.の毛細管チューブと、検出器の出力に0.75mm i.d.キャピラリーチューブを使用して、コレクターを無駄または分画コレクターにします。</li>
	<li>FPLCと検出器の間に必要な信号接続が確立されていることを確認します, UV検出器からMALSアナログ入力へのアナログ出力, FPLCからMALSオートインジェクトへのデジタル出力, FPLCのI/Oボックスを介して.</li>
	<li>少なくとも 20 kDa から 500 kDa の分数範囲をカバーする適切な分析 SEC カラムをインストールします。製品情報を調べて、カラムがサンプルおよびモバイルフェーズの MW、pH およびその他の特性の範囲に適しているかどうかを確認します。</li>
</ol>2.バッファの準備、一晩システムを緑豊かで清潔度をチェック
<ol><li>HPLCグレードの試薬を使用して、50~100mM NaClで1Lのリン酸緩衝生理食べ物を調製します。ボトルトップポリエッチャースルホンフィルターなどを使用して、バッファを0.1 μmにフィルタリングします。最初の50-100 mLのバッファーを廃ボトルに濾過し、廃棄し、乾燥フィルターから微粒子を除去し、残りを濾過された脱イオン水で十分に洗浄し、キャップした清潔な無菌ボトルに濾過し、防ぐためにキャップほこりが入る。 注:トリスバッファーなどの他の移動相溶媒は、それらの溶媒に優先的に溶解される追加のタンパク質を分析する場合に使用されてもよい。</li>
	<li>流量0.5 mL/minで一晩、またはカラムメーカーが推奨するように一晩フラッシュして、バッファー内のカラムを平衡化し、微粒子を除去します。FPLCの連続フローモードを使用し、すべてのSEC-MALSの実行が完了するまでフローが停止しないようにします。<ol>
<li>dRI フロー セルを一晩のフラッシュ中にパージモードにします。サンプルの実行を開始する前にパージをオフにします。</li>
		<li>フラッシュを開始するときは、カラムの圧力の急激な変化によって引き起こされる「カラム脱落」効果(または粒子の放出)を防ぐために、徐々に流量を傾斜させます。</li>
		<li>システムが非常に安定し、粒子フリーであることが知られており、所望の移動相と平衡状態にある場合は、一晩のフラッシュを短い2-3 hフラッシュに置き換えます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>カラムの下流のチューブを軽くタップして蓄積された粒子を放出し、MALS機器のフロントパネルディスプレイ上の90°検出器で信号を観察することで、システムの清浄度を確認します。ピークツーピークノイズが50 -100 μV 以下であることを確認します。</li>
	<li>「ブランク」インジェクションを実行して、インジェクタがパーティクルのクリーンであることを確認します。「ブランク」は、単に新鮮な、無菌バイアルで調製された実行中のバッファです。<ol>
<li>パーティクルピークの体積が 1 mL 以下で、ベースラインより 5 mV 以下の場合、システムはサンプルの準備ができています。それ以外の場合は、クリーンになるまで追加のブランクインジェクションを実行するか、メンテナンスを実行してインジェクタをクリーニングします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. サンプルの準備と読み込み
<ol><li>SECバッファー内の1-2 mg/mLでBSAの少なくとも200 μLを調製します。 注:沈殿を防ぐために、BSAは純水に溶解してはなりません。</li>
	<li>シリンジチップフィルターを使用してタンパク質を0.02 μmに濾過します。</li>
	<li>乾燥したフィルターから粒子を除去するために濾液の最初の数滴を廃棄します。</li>
	<li>あるいは、サンプルを10,000 x gで15分間遠心分離し、非可溶性凝集体およびその他の大きな粒子の沈殿を可能にする。</li>
	<li>BSA溶液の100 μLをループに注入します。 注:これは、材料の推奨量であり、安定性や可用性などのサンプルの状況に応じて多かれ少なかれ注入されてもよい。注射に必要なタンパク質の量は分子量によって逆に異なり、分子量が33kDa、またはBSAの半分の場合、タンパク質量の2倍が必要です。</li>
</ol>4. MALSソフトウェアの準備
<ol><li>新規開き |MALSソフトウェアメニューの方法から実験し、光散乱システムメソッドフォルダからオンラインメソッドを選択します。DLS ディテクタが存在する場合は、光散乱からオンラインメソッドを選択します|QELS フォルダを使用します。</li>
	<li>[構成]セクションで、サンプルフェーズとモバイル フェーズのパラメータを設定します。<ol>
<li>汎用ポンプビューで、流量を FPLC で使用する流量に設定します。</li>
		<li>[汎用ポンプ]ビューで、溶剤分岐、[名前]フィールドで、[PBS] を選択します。 </li>
		<li>インジェクタビューで、サンプルブランチをBSAとして入力し、dn/dc = 0.185(未修飾タンパク質の標準値)、A2 = 0、および UV消滅係数 = 0.667 mL/(mg-cm)を設定します。 注:他のタンパク質の場合、UV280 nm消滅係数は、文献に見出されるか、または様々なパブリックドメインソフトウェアツールを使用してその配列から計算される場合があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>[手順] セクションの[基本コレクション]ビューで、[自動挿入のトリガー] チェック ボックスをオンにし、実行の継続時間を 70 分に設定して、SEC の透過量の合計まで溶出全体のデータが収集されます。 列に到達します。 注:必要な時間はカラムと流量によって異なる場合があります - 0.5 mL/分の標準7.8 mm x 300 mm HPLC-SECカラムには35分の回収が必要です。</li>
	<li>[実行] ボタンをクリックして、MALS ソフトウェアで実験を開始します。MALS検出器を介してFPLC機器からパルス信号を受信した後、データの読み取りを開始します。</li>
	<li>計測器の前面パネルのオートゼロボタンをクリックして、dRI信号をゼロにします。</li>
</ol>5. FPLCソフトウェアの準備
<ol><li>FPLC ソフトウェアにタンパク質の名前と実行の名前を取り込む |手動指示の実行 |マークを設定します。</li>
	<li>注入弁を手動荷重からフローパスの下に注入に切り替える|注入弁。</li>
	<li>I/O ボックスの下に 0.5 s パルスを挿入してパルス信号を含める|パルスデジタルアウト.これにより、MALS ソフトウェアのデータ収集がトリガーされます。</li>
</ol>6. サンプルをループに注入します。[FPLC ソフトウェアで実行] をクリックして、実験実行を開始します。
7.SEC-MALS BSAデータの分析
<ol><li>MALS ソフトウェアの[手順]セクションの下で、分析をステップバイステップで実行します。<ol>
<li>基本コレクションビューをオンにして、UV、MALS、RI の溶出体量とほぼ同じピークが表示されることを確認します。</li>
		<li>ベースラインビューで、すべての信号(すべての LS 検出器、UV、および dRI)のベースラインを定義します。ベースラインは、純粋な溶媒のレベルを示すために定義されるべきで、サンプルピークの一方の側から他方への伸張が好ましい。</li>
		<li>[ピーク]ビューで、マウスをクリックしてドラッグして解析するピークを定義します。各ピークの中心 50% を選択します。まず、モノマーピーク(「ピーク1」)を選択し、次にダイマーピーク(「ピーク2」)を選択します。dn/dc = 0.185 および UV 280 nm 消滅係数 = 各ピーク下の BSA の正しい値を確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ピークアライメント、バンド広げ補正、正規化手順を実行します。 注:通常、SEC-MALS法は、BSAのようなジャイレーションR g<10nmの半径を持つ単分散タンパク質を使用して、90°検出器への角検出器のピークアライメント、バンドの広がりおよび正規化のために定期的に校正される。モノマー。この例では、BSAはキャリブレーション分子の両方として機能し、それ自体がMW分析の対象です。<ol>
<li>手順で|位置合わせビューは、マウスをクリックしてドラッグしてピークの中央領域を選択し、[信号の位置合わせ]をクリックし、[OK] をクリックします。 </li>
		<li>手順で|バンドの拡大ビューは、モノマーピークの中央50%を選択します。RIディテクタがリファレンスインストゥルメントとして指定されていることを確認し、[適合を実行]をクリックして、UV信号とLS信号をRI信号に合わせて適用します。<ol>
<li>ピークにズームインして、中央の 50 ~ 70% 内で非常に密接に重なっていることを確認し、[OK] をクリックします。</li>
			<li>オーバーラップが完璧でない場合は、フィットを実行し、オーバーラップが優れるまでさらに1~2回「適用」します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>手順で|[正規化]ビューで[ピーク 1]を選択し、R g値として 3.0 nm と入力し、[OK] をクリックします。 </li>
		<li>手順で|MALS ビューのモル質量と Rgを確認して、過度のノイズが原因で検出角度を解析から選択解除する必要がある場合は、データを確認します。典型的には、これらは、塵粒子が比較的高い強度を散乱する低い角度になります。右側のグラフからピーク内の個々のスライスを選択し、左側のグラフで逆減少レイリー比の角度依存を表示します。最も低い(時には最も高い)角度が一貫してフィットから大きくずれる場合は、ビューの下部にあるリストから選択を解除します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>結果のグラフをEASI グラフビューに表示します。ウィンドウの上部にある[表示]ドロップダウンから[モル質量]を選択します。Ctrl キーを押しながらクリックしてドラッグすると、ピーク領域を拡大表示できます。</li>
	<li>結果のモノマーとダイマーのピークの最終的な表形式の重量平均モル質量結果を表示する |ピーク結果の下のレポート (サマリー) ビュー |モル質量モーメント (g/mol) |Mw.純度はピーク結果で報告 | 質量分数(%) 注:他のモル質量モーメントも示されています。これらは通常、異種ポリマーに関連しますが、不連続サイズのタンパク質には関連しません。ソフトウェアによって生成される他の多くの結果は、質量回復率(注入量に対して濃度検出器を介してELEL化したタンパク質の割合)、ピーク統計、多分散性、Rgなどのレポートに含まれる可能性があります。とRhモーメントなど提供される場合、不確実性の尺定は、測定シリーズ内のノイズに基づいて引用された値の精度を反映し、精度を表すとは考えるべきではありません。報告された値の真の精度は、提供されるdn/dcの精度や消滅係数値、計器のキャリブレーションなど、さまざまな要因によって異なります。</li>
	<li>[ファイル]メニューから、[方法として保存]を選択し、分析した BSA データを、すべてのタイプのタンパク質の将来の測定の標準的な方法として保存します。BSA に対して決定された正規化およびバンド拡大パラメータは、解析で引き継がされます。</li>
</ol>

DS はワイアット テクノロジー コーポレーションの従業員で、MALS 製品はこのプロトコルで使用されています。ATは、ワイアットMALSとAKTA FPLC機器の販売代理店であるダニエルバイオテックの従業員です。

SEC-MALS実験は、モノマー、ダイマー、トリマーの良好な分離を提供し、各ピークのモル質量と流体力学的サイズの定量的な結果を提供しました。これは、明らかに存在する種を識別し、特徴付けるだけでなく、純度を定量化します。通常、得られた結果は5%以内に正確であり、正確かつ繰り返し可能な1-2%3、69以内に。このレベルの精度と再現性により、SECによって分離されている限り、MWに近い可能性のある種を自信を持って区別することができます(同じピーク内で部分的に重複する可能性があります)。タンパク質の品質管理と基本的な生物物理学的特性の利点は明らかです。
微粒子の不在の検証は、敏感で反復可能なSEC-MALS測定のために非常に重要です。粒子ピークは、一般に、同等のUVまたはRI信号を伴わずに大きなMALS信号として現れます。モバイル相およびサンプルは、このような粒子を排除するために慎重に準備する必要があります。HPLCグレードの試薬またはより良い、0.1 - 0.2 μmへの移動相および希釈バッファーのろ過(乾燥膜に常に存在する粒子を除去するためにフィルターを前洗浄)、余分きれいな移動相のびんおよび他のガラス製品の維持SEC-MALSおよび流れの下での拡張カラム平衡(流れが停止されたか、または使用されていないカラムのときに蓄積された可能性のある粒子および凝集体を除去するために)はすべて推奨される。サンプルは、目的の材料を除去しない最小の細孔サイズにフィルタリングする必要があり、通常は0.1 μm以上、可能であれば0.02 μmです。フィルターがすぐに詰まった場合、サンプルは遠心分離され、細孔サイズの下降の段階で濾過され、再精製される可能性があります。システムが高品質、新鮮でフィルタリングされたモバイルフェーズで一貫して維持され、カラムショックが防止され、サンプルがきれいで、カラムに付着しない場合、測定値は前述の微粒子ノイズを示さない高品質のデータ。
MALSはタンパク質の典型的なSECバッファーに依存しません。PBS 以外の多くのバッファシステムは、さまざまな賦形剤71を含む分離および安定性を最適化するために使用することができる。MALS は特定の列にも依存しません。分析に関する賦形剤の主な懸念事項は、屈折率の大幅な変化であり、特定屈折率増分dn/dcの改変、およびUV分析が必要なときに280 nmを吸収する賦形剤である。例えば、アルギニンは一般的なタンパク質のdn/dcに劇的に影響を与える一般的な凝集還元賦形剤であり、負の政権に持ち込むことさえあります(負のdn/dcを持つタンパク質は、dn/ 場合でもSEC-MALSによって分析することができます) dcは経験的に決定されますが、dn/dc = 0の場合、タンパク質によって散乱される光の強度はヌルとなり、MW分析は不可能になります)。タンパク質のdn/dc値のトピックは、標準的な水性バッファーの場合、未修飾タンパク質の大部分が標準値の2-3%以内に収まることが示されているZhao et al.35によって広範囲に議論されています(0.185または0.186 mL/g==660 nm)。、10 kDa以下のタンパク質はより可変であるが、0.21 mL/gと高いかもしれないいくつかの種がある。
提示されたデータにおけるBSAモノマーおよびダイマーピーク全体のMWプロファイルは、いずれも2%以下に非常に均質であり、単分散種を示す。ピーク全体の不均一な MW 値は、不均一性または不適切な分析によって発生する可能性があります。特に、凹型(「スマイル」)または凸(「グリマセ」)であるBSA MWプロファイルは、バンドの広がり補正を正しく適用しなかった結果として生じる可能性があります。他のタンパク質の場合、凸プロファイルはモノマーとオリゴマーの間の動的平衡から生じる可能性があり、そこではモノマーとオリゴマーの比率がピーク濃度に依存するため(BSAはこの挙動を示さないため、しばしば使用される。正しいバンド拡大パラメータを検証するためのコントロールサンプルとして)。末端に至るまで変化せず、サンプル濃度で変化しないMWプロファイルは、SECによって部分的に解決される分子量種の分布の典型的なものであり、動的平衡は他方と容易に区別される。タンパク質の異なる総量を注入することによって明らかに不均一な分布の源- 分布は動的平衡によって変化しますが、固定分布または不適切なバンド広げ補正では異なります。
上記の制約を考えると、SEC-MALS はさまざまなタスクには適していません。それは粗サンプルの分析のために適していない;サンプルは、標準的な親和性と研磨方法によって十分に精製されるべきです。同じ質量または非常に近い質量を持つタンパク質またはmAbの変異体および変異体および変異体を同定するのに十分な精度または解決力を持っていないし、最近では、イオン-exchangを離れたり分離したりしない分析物では使用できないことが示されている。eまたは逆相クロマトグラフィーは、SEC 72、73、74によって解決されない種を分離し、特徴付けるためにMALSと組み合わせることができる。タンパク質の量が厳しく制限されている場合、SEC-MALSは通常10~200 μg3を必要とし、内径が0.25mmを超えるチューブを持つFPLCシステムではさらに多くを必要とするため、SEC-MALSは実現不可能な場合があります。しかし、より少ない量はUHPLC-SEC-MALSによって分析されるかもしれません。モバイルフェーズへの導入時に凝集する非常に不安定なタンパク質はSEC-MALS分析には適していないが、オフライン動的光散乱を用いたバッファ最適化はこの問題75を克服するかもしれない。
SEC-MALSが伴う追加の努力にもかかわらず、タンパク質研究のために非常に貴重であり、学術およびバイオ医薬品コミュニティによって広く使用されています。上記のプロトコルに記載されているモノマー、オリゴマーおよび凝集体の特性測定に加えて、SEC-MALSは糖タンパク質(タンパク質およびグリカン成分のMWを個別に決定する)、界面活性剤、またはサーボケタンなどの修飾タンパク質を特徴付けることができる。脂質溶解膜タンパク質(タンパク質および可溶化成分のMWを個別に決定する)、ウイルス様粒子、タンパク質およびタンパク質核酸複合体、多糖類などのタンパク質アセンブリ、タンパク質-多糖類コンジュゲート、ペプチドおよび他の多くの生体高分子。

溶液中のタンパク質の分子量(MW)の信頼性の高い分析は、生体分子研究1、2、3、4に不可欠です。MW分析は、正しいタンパク質が産生されたかどうか、およびそれ以上の実験5、6での使用に適しているかどうかを科学者に知らせます。タンパク質研究ネットワークP4EU7およびARBRE-Mobieu8のウェブサイトに記載されているように、タンパク質品質管理は、最終製品の純度だけでなく、そのオリゴマー状態、均質性、同一性、コンフォメーションを特徴付ける必要があります。構造、翻訳後の変更およびその他のプロパティ。
非変性溶液におけるMW測定は、単量体かオリゴマーかにかかわらず、水性環境に存在するタンパク質の形態を識別する。多くのタンパク質の目標は単量体形態を産生するが、他の人にとっては特定の天然オリゴマーが生物活性9、10、11、12の鍵である。その他のオリゴマーおよび非ネイティブ凝集体は望ましくず、結晶学、核磁気共鳴(NMR)または小角X線散乱による構造決定の欠陥、ならびに機能的アッセイにおけるアーティファクトまたは不正確さにつながる。等温滴定カロリーメトリーまたは表面プラズモン共鳴2、13による結合を定量化する。
モノクローナル抗体(mAbs)などのバイオ医薬品の場合、溶液ベースのMW分析は、品質管理と製品特性解析の同様の目的を果たします。過剰な凝集体および断片は、人間の使用に適していない不安定な製品を示しています。規制当局は、治療分子だけでなく、最終製品14、15、16、17に存在する可能性のある潜在的な分解剤の慎重な特性評価を必要とします。
タンパク質MWを分析するための最も広範な方法のいくつかは、ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動ナトリウム(SDS-PAGE)、毛細血管電気泳動(CE)、ネイティブPAGE、質量分析(MS)、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)および分析です。超遠心分離(AUC)。このうち、SDS-PAGE、CEおよびMSはネイティブ状態では行われなせず、典型的にはオリゴマーおよび凝集体の解離を招き、したがって、天然オリゴマーの決定または凝集体の定量には適していない。ネイティブPAGEは、理論的にはネイティブ状態を保持しますが、私たちの経験では多くのタンパク質に対して最適化することは困難であり、結果はあまり信頼できません。AUCは、堆積速度または堆積平衡によって、定量的であり、最初の原理からMWを決定することができますが、それは非常に面倒であり、データ解釈、長い実験時間と、非常に高価な楽器。
分析SECは、パックされたカラムを通る流れの間に高分子を分離する定量的で比較的堅牢でシンプルな方法です。SECの原則とアプリケーションは、いくつかのレビュー18、19、20とハンドブック「サイズ除外クロマトグラフィー:原則と方法」21で十分に提示されています。保持の違いは、カラムの終わりから溶出する前に、静止した段階で細孔に出入りする時間が異なるためです。この差は、分子22の相対サイズおよび拡散係数から(名目上)生じる。キャリブレーション曲線は、分子のMWを溶出量に関連する一連の参照分子を使用して構築される。タンパク質の場合、参照分子は、一般に、電荷または疎水性表面残質を介してカラムと相互作用しない、よく振る舞う球状タンパク質である。溶出体積は紫外線(UV)吸光度検出器で測定します。UV消滅係数が既知の場合、配列からしばしば計算される場合、タンパク質ピーク総質量も定量されてもよい。
特に、SECによるMWの分析は、特徴付けされるタンパク質に関する2つの主要な仮定に依存しています:1)彼らは同じ立体構造と特定の体積(つまり、拡散特性と同じ関係)を参照基準と共有し、MW)および2)は、基準規格と同様に、立体的特性を除いてカラムと相互作用しない−電荷または疎水性相互作用によるカラムパッキングに付着しない。これらの仮定からの逸脱は、較正曲線を無効にし、誤ったMW判定につながります。これは、広範な非構造化領域23、24または非球状/線形オリゴマーアセンブリ10に起因する大きなストークス半径を有する本質的に無秩序なタンパク質の場合である。グリコシル化タンパク質は、一般に、添加された炭水化物塊が考慮される場合でも、非グリコシル化形態よりも大きなストークス半径を持つであろう19。SECからの溶出は、タンパク質のオリゴマー状態およびモル質量ではなく、ポリペプチド・洗剤脂質複合体の総大きさに依存するため、洗剤溶解性膜タンパク質はキャリブレーションタンパク質とは異なる方法で溶出する25 、26.カラム化学、pHおよび塩条件はすべて、帯電または疎水性表面残渣27、28を有するタンパク質の溶出量に影響を与える。
SECは、多角光散乱(MALS)および差動屈折率(dRI)検出器3、4、11、29と組み合わせると、MW判定のためにはるかに汎用性と信頼性が高くなります。 30、31、32.dRI検出器は、検体の存在による溶液屈折率の変化に基づいて濃度を決定します。MALS検出器は、入射レーザービームに対して、検光器によって散乱される光の割合を複数の角度に測定します。総称してSEC-MALSとして知られているこの計測器は、MWは方程式1を使用して最初の原理から直接計算することができるので、溶出時間とは無関係にMWを決定します。
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59615/59615eq1.jpg">(1)
ここでMは検体の分子量であり、R(0)は、MALS検出器によって決定され、角度ゼロに推定される光の量(すなわち、レーザー強度に対する検体によって散乱される光の量)を減少させ、c UVまたはdRI検出器によって決定される重量濃度は、dn/dcが検体の屈折率増分(本質的に検体とバッファーの屈折率の差)、およびKに依存する光学定数である波長および溶媒屈折率29などのシステム特性。
SEC-MALSでは、SECカラムは、溶液中の様々な種を分離し、MALSおよび濃度検出器細胞に個別に入るように使用されます。実際の保持時間は、タンパク質種をどの程度うまく解決するかを除いて、分析には有意性がありません。器械はコラムから独立して目盛りが付き、参照標準に依存しない。したがって、SEC-MALSは、基本的な物理方程式からのMW決定のための「絶対」方法と考えられています。サンプルが不均一であり、カラムによって完全に分離されていない場合、各溶出体積で提供される値は、時間スライスあたりのフローセルを流れる各溶出体積の分子の重量平均(約75 μL)になります。
散乱強度の角変動を解析することにより、MALSは、約12.5nm29より大きい幾何学的半径を有する高分子およびナノ粒子のサイズ(根平均平方半径、Rg)を決定することもできる。単光タンパク質やオリゴマーなどの小さな種の場合、0.5nmおよび最大33の流体半径を測定するために、動的光散乱(DLS)モジュールをMALS計測器に追加することができます。
UVまたはdRI濃度分析は、Eq. 1でcの値を提供する可能性がありますが、dRIの使用は2つの理由で好ましい:1)dRIは、UVを含まない糖や多糖などの分子を分析するのに適した普遍的な濃度検出器である。染色体34;2)水バッファー内のほぼすべての純粋なタンパク質の濃度応答dn/dcは、1〜2%(0.185mL/g)35以内に同一であるので、UV消滅係数を知る必要はない。
タンパク質研究におけるSEC-MALSの使用は非常に広範です。これまでで最も一般的な用途は、精製タンパク質が単量体またはオリゴマーリおよびオリゴマー化の程度であるかどうかを確立し、凝集体3、10、11、17を評価することです。 31、36、37、38.従来の手段では特徴づけられない洗剤溶解膜タンパク質に対してそうする能力は特に高く評価され、そのための詳細なプロトコルは31、39、40に公表されている。,41歳,42歳,43.その他の一般的な用途には、糖タンパク質、リポタンパク質および類似のコンジュゲート4、31、44の翻訳後修飾および多分散性の程度の確立が含まれる。,45歳,46歳,47;タンパク質、タンパク質核酸およびタンパク質多糖色複合体24、46を含むヘテロ複合体の形成(またはその欠如)および絶対修行法(ストイチオメトリ比とは対照的に) 48,49,50,51,52;モノマーダイマー平衡解離定数49、53、54を決定する。タンパク質の立体構造を評価する 55,56.タンパク質を超えて、SEC-MALSはペプチド57、58、ヘパリン59、キトサン60、61、小さいなどの広く異種天然ポリマーの特性評価に非常に貴重です。ウイルス62と合成または加工ポリマーのほとんどのタイプ63、64、65、66.広範な文献は、文献67とオンライン(http://www.wyatt.com/bibliography)で見つけることができます。
ここでは、SEC-MALS実験を実行および分析するための標準プロトコルを示す。ウシ血清アルブミン(BSA)は、タンパク質モノマーおよびオリゴマーの分離および特徴付けの例として提示される。BSAプロトコルは、複合体、糖タンパク質および界面活性剤結合膜タンパク質を含むさらなるSEC-MALS分析の基礎となる特定のシステム定数を決定します。
SEC-MALSは、多くのベンダーの標準的な高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)または高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)装置を使用して行われる可能性があることに注意してください。このプロトコルは、研究開発のためのタンパク質を生産するラボで一般的に見られるFPLCシステムの使用について説明します(材料の表を参照)。プロトコルを実行する前に、FPLCシステム、MALSおよびdRI検出器は、製造業者の指示に従って制御、データ取得および分析のためのそれぞれのソフトウェアパッケージと共に、必要なキャリブレーション定数をインストールする必要があります。またはソフトウェアに入力されたその他の設定。インラインフィルターは、親水性の0.1 μmの細孔膜が取り付けられているポンプとインジェクタの間に配置する必要があります。

<table><tbody><tr><td>AKTA pure</td><td>GE Healthcare</td><td>29-0182-26</td><td>高速タンパク質液体クロマトグラフ (FPLC)&nbsp;</td></tr><tr><td>AKTA UNICORN</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>FPLC制御ソフトウェア</td></tr><tr><td>ASTRA</td><td>Wyatt Technology</td><td></td><td>MALSデータ取得・解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(純度>97%)</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>A1900</td><td>分析物</td></tr><tr><td>DAWN または miniDAWN</td><td>Wyatt Technology</td><td>WH2 または WTREOS</td><td>マルチアングル光散乱 (MALS) 検出器</td></tr><tr><td>増加 200 10/300</td><td>GE ヘルスケア</td><td></td><td>サイズ排除カラム、200 &Aring; 細孔、内径 10 mm、長さ 300 mm</td></tr><tr><td>Optilab</td><td>Wyatt Technology</td><td>WTREX</td><td>示差屈折率 (RI) 検出器</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム NaCl</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>71382</td><td>HPLCグレードNaCl</td></tr>ステ<tr><td>リカップボトルトップフィルターポリエーテルスルホン0.1&micro;m 1000 mL&nbsp;</td><td>ミリポア</td><td>SCVPU11RE</td><td>移動相</td></tr><tr><td>フィルターWhatman Anotop 10シリンジフィルター0.02 &micro;m</td><td>GE Healthcare</td><td>6809-1002</td><td>サンプル</td></tr><tr><td>フィルターWhatman Anotop 10シリンジチップフィルター、0.1 & マイクロ;mポア、直径10 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>6809-1012</td><td>サンプルフィルターWhatman</td></tr><tr><td>Anotop 25シリンジフィルター0.1 & マイクロ;m</td><td>GE Healthcare</td><td>6809-2012</td><td>移動相フィルター</td></tr><tr><td>WyattQELS</td><td>Wyatt Technology</td><td>WIQ</td><td>動的光散乱検出器</td></tr></tbody></table>

多角光散乱に結合したサイズ排除クロマトグラフィーによるタンパク質の特性化(sec-mals)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

分析サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)は、溶液中のタンパク質およびタンパク質タンパク質複合体の分子量の決定に一般的に使用される、分子を推定するために分析体の溶出量に依存する相対的な技術である。重量。タンパク質が球状でない場合、または非理想的なカラム相互作用を受けると、タンパク質基準に基づく較正曲線は無効であり、溶出量から決定される分子量は正しくありません。多角光散乱(MALS)は、基本的な物理方程式から溶液中の分析物の分子量を決定する絶対技術です。分析のためのMALSとの分離のためのSECの組み合わせは、モノマー、ネイティブオリゴマーまたは凝集体、およびヘテロ複合体を含む1つ以上のタンパク質種の溶液を特徴付ける汎用性の高い、信頼性の高い手段を構成する。測定は各溶出量で行われるため、SEC-MALSは溶出ピークが均質か不均一であるかを判断し、固定分子量分布と動的平衡を区別することができます。糖タンパク質やリポタンパク質などの修飾タンパク質、または洗剤溶解膜タンパク質などのコンジュゲートの解析も可能です。したがって、SEC-MALSは、生物工学的またはバイオテクノロジー研究のために産生される分子の生物物理学的特性と溶液挙動を確認しなければならないタンパク質化学者にとって重要なツールです。SEC-MALSのこのプロトコルは、純粋なタンパク質モノマーおよび凝集体の分子量と大きさを分析します。取得したデータは、複合体、糖タンパク質、界面活性剤結合膜タンパク質を含むSEC-MALSのさらなる分析の基盤として機能します。

図1a、bは、BSAの3つのオリゴマー形態(モノマー、ダイマー、トリマー)がモノマーとダイマーのベースライン分解で200Å細孔列上で十分に分離されたことを示し、図2aは75Å細孔列上の分離が行われなかったことを示しています。良好なモノマーダイマー解像度を達成します。後者の例は、「不良」の結果を示すために含まれていました。2つの列の分離のこれらの違いは、実際には、製造業者の記載された分離範囲に従って予想されるかもしれません。トリマーはダイマーから完全に分離されていないし、より高いオリゴマーは、トリマーとお互いから十分に分離されていません。図2bは、クロマトグラム全体に存在する粒子を有するノイズの多い光散乱信号の一例であり、これは正確なMW判定を妨げる。
今後は図 1bに焦点を当てます。13.8 mLで浸透したモノマーは、MALSと流体力学半径Rh3.54±0.01nmで決定された64.1±0.4kDaの重量平均モル質量Mwを示す。 これらの結果は、BSA、66.4 kDaおよび3.5 nmの配列質量および既知の流体力学半径と、それぞれ68、SEC-MALSの通常の精度内に、5%3、69と一致している。12mLで輝いたダイマーは、MALSが予想通り127±1kDaのMw値を示し、実験精度5.68±0.06nmの実験精度とRhの2倍であった。 また、トリマーピークはMALSによって判定された194±9kDaのMwを用いて11mLで観察され、実験精度の3倍、予想通りであった。 R DLS信号の強度が低いため、トリマーのhを決定できませんでした。
モノマーピーク全体で計算されたモル質量点は、均質性を示す2〜5%以内に均一である。BSAフラグメント70に対応する38-50 kDaの範囲でモル質量を持つ後続の肩を見つけることは珍しいことではありません。薄暗層ピークとトリメリックピークを横切るモル質量点は均一ではなく、不均一性を示します。ダイマーピークは、ダイマーピークに出血したトリマーの痕跡が原因でやや不均一であり、トリマーピークは、不十分に解決された高いオリゴマーの共溶化のために不均一である。
モノマーピークの信号対雑音レベルは、40:1の信号と同様に、100:1を超える3つの信号すべてで非常に許容されます。タンパク質ピークを超えるクロマトグラム領域は平坦であり、LSトレースにおける全除外(ボイド)体積付近の微粒子によるピークの例外と、dRIトレースにおける(正の)塩ピークおよび(負の)溶解空気ピークを除き、総透過量の近くボリューム。これらは図 1aで指摘されています。
純度のレベルは、SEC-MALS実験でも計算することができます:レポート内のモノマーピークの質量画分は、モノメリック形態の純度の割合を表します。BSAモノマーの場合、計算された純度は88%です。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59615/59615fig1.jpg"> 図 1: 200Å細孔サイズ排除カラムを用いてウシ血清アルブミン(BSA)のSEC-MALS分析。クロマトグラムトレースは、モノマーピークに正規化され、明確にするためにオフセットされます。(A) 無視される可能性のある一般的なアーティファクトは、光散乱信号の先頭付近の粒子ピーク、屈折率信号の総透過量付近の塩および溶解空気ピークを含む指摘されている。(B)クロマトグラムは、優れたモノマーダイマートリマー分離を示し、光散乱信号は、高い信号対雑音を示します。モノマーおよびダイマーMW値は高い均質性を示す。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59615/59615fig1large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59615/59615fig2.jpg"> 図 2: 低品質のSEC-MALS分析の例。クロマトグラムトレースは、モノマーピークに正規化され、明確にするためにオフセットされます。(A) 75 Åの細孔サイズ除外列の不十分な分離;8-9分の間の粒子ピークは、タンパク質から十分に分離されていません。(B)不十分な信号対雑音比およびタンパク質に隣接する広範な粒子は、光散乱(LS)信号において明らかである。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59615/59615fig2large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、溶液中のタンパク質および複合体の絶対特性を表す多角光散乱(SEC-MALS)とのサイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせを記述する。SEC-MALSは、純粋なタンパク質、天然オリゴマー、ヘテロ錯体、糖タンパク質などの改変タンパク質の分子量と大きさを決定します。

多角光散乱に結合したサイズ排除クロマトグラフィーによるタンパク質の特性化(SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

SEC-MALSは、溶液中の高分子の分子量、大きさおよび立体構造を決定するための定量的方法である。オリゴマーや複合体を識別し、糖タンパク質や膜タンパク質などの難しいサンプルを特徴付けることができます。SEC-MALS は絶対メソッドです。それは基礎物理学に依存し、分子標準、分子の立体構造、または分離媒体との相互作用に対するコラボレーションに依存しません。SEC-MALS は、秒で区切られた多くのシステムに適用できます。ペプチドや小さなポリマーからタンパク質、ヌクレオキャプシド、多糖類、合成ポリマー、ウイルス様粒子、小ウイルスまで。システムとバッファーが、低粒子含有量に関するベンダーの推奨事項を見逃していることを確認することが重要です。ベンダのテクニカル サポート担当者に問い合わせてください。テキスト プロトコルで説明されているように、SEC-MALS システムの準備からこの手順を開始します。各PLCグレードの試薬を使用して、50〜100ミリモル塩化ナトリウムでリン酸緩衝生理食塩水の1リットルを調製します。ボトルアップポリエーテルセルフォームフィルター、または同様を使用して、バッファーを0.1ミクロンにフィルタリングします。乾燥フィルターから微粒子を除去するために、バッファーの最初の 50 ~ 100 ミリリットルを廃棄物ボトルにフィルター処理します。その後、残りを、以前に濾過された脱イオン水で洗浄した清潔で無菌のボトルにろ過し、ほこりが入るのを防ぐために保管します。バッファー内のカラムを平衡化し、微粒子を除去するために、1 分間に 0.5 ミリリットルの流量でカラムを一晩フラッシュします。FPLCの連続フローモードを使用し、すべてのSEC-MALSの実行が完了するまでフローが停止しないようにします。夜間フラッシュ中に DRI フロー セルをパージ モードにします。フラッシュを開始する際、列の急激な圧力変化によって引き起こされる列の流出効果を防ぐために、流量を徐々に傾斜させます。サンプル実行を開始する前に、パージをオフにします。柱の下流のチューブを軽くタップして、蓄積されたパーティクルを放出することで、システムの清潔さを確認します。MALS機器のフロントパネルディスプレイの90度検出器の信号を観察します。ピークからピークへのノイズが50~100マイクロボルト以下であることを確認します。また、屈折率(RI信号)が10倍からマイナス7屈折率単位まで10倍未満に安定していることを確認します。ブランク注入を行い、インジェクタが粒子から汚れな状態であることを確認します。ブランクは、単に新鮮な、無菌バイアルで調製されたランニングバッファです。粒子のピークが体積が1ミリリットル以下で、ベースラインより5ミリボルト以下の場合、システムはサンプルの準備ができています。それ以外の場合は、追加のブランク注射をクリーンになるまで実行するか、または注入器を洗浄するためのメンテナンスを行います。次に、SCCバッファーに1ミリリットルあたり1〜2ミリグラムで少なくとも200マイクロリットルのBSAを調製します。注射器の先端フィルターを使用して、02ミクロンにタンパク質を濾過します。乾燥フィルターから粒子を除去するために、濾液の最初の数滴を捨てます。あるいは、試料を10,000倍Gで15分間遠心分離し、非可溶性凝集物および他の大きな粒子の沈殿を可能にする。次に、100マイクロリットルのBSA溶液をループに注入する。MALS ソフトウェア メニューでメソッドから新しい実験を開きます。次に、光散乱システムメソッドフォルダからオンライン方式を選択する。DLS検出器が存在する場合は、QELSフォルダを使用した光散乱からオンライン方式を選択します。構成セクションで、サンプルおよび移動フェーズのパラメーターを設定します。汎用ポンプビューで、FPLCで使用される流量を設定します。次に、汎用ポンプビュー、ソルベントブランチ、名前フィールドに移動し、PBSを選択します。インジェクタ ビューのサンプル ブランチで、BSA という名前を入力します。dn/dc を 0.185 に設定し、A2 を 0 に設定し、UV 絶滅係数を 1 ミリグラムあたり 0.667 ミリリットルに設定します。手順セクションの基本的なコレクション ビューで、自動挿入時のチェックボックストリガーを選択します。実行の継続時間を 70 分に設定し、SEC 列の総パーミネーション ボリュームに達するまで、全体のデータが全体の分析に対して収集されるようにします。実行ボタンをクリックして、MALS ソフトウェアで実験を開始します。これは、MALS検出器を介してFPLC機器からパルス信号を受信した後、データの読み取りを開始します。計測器のフロントパネルのオートゼロボタンをクリックして、DRI信号をゼロにします。FPLCソフトウェアでの作業、手動に移動、手動の指示を実行し、マークを設定し、タンパク質と実行の名前を挿入します。注入弁を手動負荷から注入に、流路下、注入弁に切り替える。IOボックスパルスデジタルアウトの下に0.5秒パルスを挿入してパルス信号を含めます。これにより、MALS ソフトウェアでデータ収集がトリガーされます。次に、サンプルをループに挿入します。FPLC ソフトウェアで実行をクリックして、実験実行を開始します。MALS ソフトウェアの手順セクションで、分析をステップバイステップで実行します。基本コレクション ビューをチェックして、UV、MALS、および RI でほぼ同じ影響量でピークが表示されることを確認します。ベースラインビューで、すべての信号のベースラインを定義します。ピークビューで、マウスをクリックしてドラッグして、解析するピークを定義します。各ピークの中央50%を選択します。まず、モノマーピークを選択し、次にダイマーピークを選択します。各ピークの下で、BSAの280ナノメートルでdn/dcと絶滅係数の正しい値を確認してください。手順の整列ビューで、マウスをクリックしてドラッグして、ピークの中央領域を選択します。[信号の位置合わせ] をクリックし、次に[問題ありません]をクリックします。手順では、バンドの広がり視野は、モノマーピークの中央50%を選択する。屈折率検出器が参照機器として指定されていることを確認します。次に「適合を実行」をクリックし、UVおよび光散乱信号を屈折率信号に合わせて適用します。ピークを拡大して、中央の 50 ~ 70% 内で重なっていることを確認し、[大丈夫] をクリックします。手順の正規化ビューで、ピーク 1 を選択します。RG 値として 3.0 ナノメートルを入力し、[正規化] をクリックして、[大丈夫] をクリックします。EASIグラフビューで結果のグラフを表示します。ウィンドウ上部の表示ドロップダウンからモル質量を選択します。コントロールを使用し、クリックしてドラッグしてピーク領域にズームします。モノマーとダイマーピークの最終的な集計重量平均モルマス結果を表示するには、ピーク結果、モル質量モーメント、MWに移動し、結果に選択して、要約を報告します。純度はピーク結果、質量分率の下で報告される。ファイルメニューから保存方法を選択し、分析したBSAデータを、すべての種類のタンパク質の将来の測定のための標準的な方法として保存します。BSAに対して決定された正規化およびバンドの広がりパラメータは、分析に引き継がれる。ここに示されている BSA の SEC-MALS 分析、200 オングストローム孔サイズ除外列を使用しています。クロマトグラムトレースはモノマーピークに正規化され、明確にするためにオフセットされます。無視され得る一般的なアーチファクトは、光散乱信号の始まり付近の粒子ピーク、ならびに屈折率信号における総透過量付近の塩および溶存空気ピークを含む指摘される。クロマトグラムは優れたモノマー-ダイマートリマー分離を示し、光散乱信号はノイズに対して高い信号を示す。モノマーおよびダイマー重量平均モル質量値は、高い均質性を示す。低品質のSEC-MALS分析の例を次に示します。この例では、75オングストローム孔サイズ排除カラムでの不十分な分離は、タンパク質から十分に分離されていない8〜9分の間の粒子ピークをもたらす。ここでは、ノイズ比に対する信号が不十分であり、光散乱シグナルではタンパク質に隣接する広範な粒子が明らかである。良いSEC-MALS結果の鍵は、適切なカラムを選択し、システムが低光散乱ノイズで校正されていることを確認し、サンプルを事前にフィルタリングまたは遠心して粒子を除去することです。SEC-MALSに続いて、タンパク質サンプルは、結合親和性、バイオライザ、表面プラズモン共鳴、等温滴定熱量測定、バイオレリド・フォロメトリー、マイクロスケール熱泳動、または組成の多角光散乱についてさらに分析することができる。タンパク質の構造は、X線結晶学、クライオ電子ミスクロスコピー、またはNMRによって決定され得る。

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