Name: 免疫シナプス形成中のB細胞におけるオルガネラダイナミクスの研究 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 39 s
Description: 学ぶ免疫シナプス形成におけるB細胞のオルガネラダイナミクスと細胞骨格再構成のイメージング・生化学的手法。リソソームや中心体の局在変化を定量化し、B細胞活性化機構を解明する。

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M.-I.Y.は、FONDECYT#1180900からの研究助成金によって支援されています。J.I.、D.F.、J.L.は、コミシオン・ナシオナル・デ・シエンシア・イ・テクノロジアのフェローシップによって支援されました。私たちは、ビデオの録画と編集のためにポンティフィシア大学カトリカデチリからデビッド・オソリオに感謝します。

<ol><li>Carrasco, Y. R., Batista, F. D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+Acquire+Particulate+Antigen+in+a+Macrophage-Rich+Area+at+the+Boundary+between+the+Follicle+and+the+Subcapsular+Sinus+of+the+Lymph+Node%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cells Acquire Particulate Antigen in a Macrophage-Rich Area at the Boundary between the Follicle and the Subcapsular Sinus of the Lymph Node.</a> Immunity. 27 (1), 160-171 (2007).</li>
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<li>Lankar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Major+Histocompatibility+Complex+Class+II+Compartments+during+B+Cell+Receptor%E2%80%93mediated+Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Major Histocompatibility Complex Class II Compartments during B Cell Receptor–mediated Cell Activation.</a> The Journal of Experimental Medicine. 195 (4), 461-472 (2002).</li>
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<li>Le Roux, D., Lankar, D., Yuseff, M. I., Vascotto, F., Yokozeki, T., Faure-Andre´, G., Mougneau, E., Glaichenhaus, N., Manoury, B., Bonnerot, C., Lennon-Dume´nil, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syk-dependent+Actin+Dynamics+Regulate+Endocytic+Trafficking+and+Processing+of+Antigens+Internalized+through+the+B-Cell+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Syk-dependent Actin Dynamics Regulate Endocytic Trafficking and Processing of Antigens Internalized through the B-Cell Receptor.</a> Molecular biology of the cell. 18 (September), 3451-3462 (2007).</li>
<li>Reber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+8+Isolation+of+Centrosomes+from+Cultured+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 8 Isolation of Centrosomes from Cultured Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 777 (2), 107-116 (2011).</li>
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<li>Yuseff, M. I., Lennon-Duménil, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+use+conserved+polarity+cues+to+regulate+their+antigen+processing+and+presentation+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">B cells use conserved polarity cues to regulate their antigen processing and presentation functions.</a> Frontiers in Immunology. 6, 1-7 (2015).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

我々は、Bリンパ球がISの形成を促進するために細胞内アーキテクチャを再編成する方法を研究する包括的な方法を説明する。本研究では、B細胞活性化時のセントロソーム、ゴルジ装置、リソソームなどのオルガネラの細胞内分布を定量化するイメージング技術の使用と、それらがISに偏光する方法を含む。さらに、B細胞活性化時のセントロソーム組成の変化を研究するための生化学的アプローチについて述べた。
B細胞におけるISの形成を促進するために、前者は細胞骨格の再配置と小器官の離散的接触部位の確立を引き起こすので、可溶性免疫複合体の代わりに固定化抗原(抗原被覆ビーズ)を使用した。偏光は容易に研究することができる。イメージングB細胞活性化の重要な側面は、サンプルの調製である。すべての画像取得は理想的には1:1細胞:ビーズ比を得るべきであり、抗原接触のユニークな部位への小器官の偏光を定量する。しかし、場合によってはB細胞が2つ以上のビーズを捕捉できるため、抗原の1部位を選択することが困難になります。ビーズ凝集体の形成を避けるためには、細胞に添加する前に抗原結合ビーズを徹底的に渦にすることが重要です。また、免疫蛍...

Bリンパ球は、異なる脅威に対する抗体の産生および侵入病原体に対する抗体を産生する適応免疫系の不可欠な部分である。抗体産生の効率は、B細胞が可溶性または表面つな形1、2のいずれかで遭遇した抗原を獲得、処理および提示する能力によって決定される。提示細胞の表面に付着した抗原の認識は、BCRによって、IS3、4と呼ぶ近接細胞間接触の形成につながる。この動的なプラットホームの中でBCR依存の下流のシグナル伝達および内因性リソソームのコンパートメントへの抗原の内部化の両方が起こる。取り込み抗原はMHC-II分子に処理され、組み立てられ、その後Tリンパ球に提示される。生産的なB-T相互作用は、B-T細胞協調と呼び、Bリンパ球が適切なシグナルを受け取ることを可能にし、抗体産生血漿細胞または記憶細胞への分化を促進する8。
B細胞による抗原抽出には2つのメカニズムが関与している。最初の1つは、シナプス裂裂5、6で募集と融合を受けるリソソームに由来するプロテアーゼの分泌に依存しています。第2のものは、クラトリンコーティングされたピット7に内在する抗原含有膜の浸位を引き起こすミオシンIIA媒介引力に依存する。抗原抽出のモードは、抗原が見つかった膜の物理的特性に依存します。それにもかかわらず、いずれの場合も、B細胞は2つの主要な改造事象を受ける:アクチン細胞骨格の再編成とISへの小器官の偏光。アクチン細胞骨格リモデリングは、シナプス膜におけるアクチン依存性突起が抗原と接触する表面を増加させる初期広がり段階を伴う。これに続いて、抗原と組み合わせたBBCRが、分子モーターとアクチン細胞骨格の協調作用によってISの中心に集中する収縮期が続く。11.オルガネラの偏光もアクチン細胞骨格の改造に依存する。例えば、セントロソームは核から結合解除され、関連するアクチンの局所脱重合によって、この小器官をIS5、12に再配置することを可能にする。B細胞において、セントロソームを1つの細胞極(IS)に再配置すると、シナプス膜へのリソソーム募集が導かれ、分泌時に表面つなつ付け抗原6の抽出および/または処理を容易にすることができる。ISで募集されたリソソームは、T細胞13に提示されるエンドソームコンパートメントにおけるペプチド-MHC-II複合体の形成を支持するMHC-IIで濃縮される。さらに、ゴルジ装置はIS14に密接に採用されることも観察されており、分泌経路からのゴルジ由来小胞が抗原の抽出および/または処理に関与する可能性があることを示唆している。
全体として、シナプス形成中のB細胞における細胞内小器官および細胞骨格の再配列は、そのさらなる活性化に必要な効率的な抗原獲得および処理を可能にする重要なステップである。本研究では、B細胞におけるイメージングおよび生化学的解析を行う方法に関する詳細なプロトコルを紹介し、ISの形成に関連するオルガネラの細胞内改造を研究する。これらの技術には、(i)抗原被覆ビーズで活性化されたB細胞の免疫蛍光および画像解析および抗原被覆線のスリップが含まれ、ISに動員される細胞内成分の可視化と定量が可能である(ii))スクロース勾配上の超遠心分離によるB細胞中のセントロソーム富化画分の単離は、セントロソームに関連するタンパク質の同定を可能にし、細胞極性の調節に関与する可能性がある。

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<table><tbody><tr><td>IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cells</td><td>ATCC</td><td>TIB-208</td><td>Fc&gamma;IIRを持たずにIgGを含むBCRを表面に発現するBalb/c由来のマウスB細胞リンパ腫</td></tr><tr><td>100% methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circular</td><td>Marienfield-Superior</td><td>111500</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG&nbsp;</td><td>LifeTech&nbsp;</td><td>A21206</td><td>1:500希釈が推奨されていますが、最適化するべきです</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit &nbsp;IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp;A-11071</td><td>1:500希釈が推奨されていますが、最適化するべきです</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-conjugated phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp;A21238</td><td>1:500希釈が推奨されていますが、最適化するべきです</td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofection kit V</td><td>Lonza</td><td>VCA-1003</td><td>DNAとトランスフェクション試薬を混合する際は、製造元の指示に従ってください</td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofector model 2b</td><td>Lonza</td><td>AAB-1001</td><td>プログラムL-013を使用</td></tr><tr><td>Amino- Dynabeads</td><td>ThermoFisher</td><td>14307D</td><td></td></tr><tr><td>Anti-pericentrin</td><td>&nbsp;Abcam</td><td>ab4448&nbsp;</td><td>1:200希釈が推奨されていますが、最適化するべきです</td></tr><tr><td>Anti-rab6</td><td>Abcam</td><td>ab95954</td><td>1:200希釈が推奨されていますが、最適化するべきです</td></tr><tr><td>Anti-sec61</td><td>Abcam</td><td>ab15575</td><td>1:200希釈が推奨されていますが、最適化するべきです</td></tr><tr><td>BSA</td><td>&nbsp;Winkler</td><td>&nbsp;BM-0150</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Winkler</td><td>CA-0520</td><td></td></tr><tr><td>Culture plate T25</td><td>BD</td><td>353014</td><td></td></tr><tr><td>Fiji Software</td><td>Fiji col.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>17984-25</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>G7651&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Winkler&nbsp;</td><td>BM-0820</td><td></td></tr><tr><td>Goat-anti-mouse IgG antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>315-005-003</td><td>IIA1.6 positive ligand</td></tr><tr><td>Goat-anti-mouse IgM antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31186</td><td>IIA1.6 negative ligand</td></tr><tr><td>HyClone Fetal bovine serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30071.03</td><td>56 oCで30分間加熱して不活性化</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Winkler</td><td>PO-1260</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 TCS microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Winkler</td><td>SO-1455</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope</td><td>&nbsp;Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>M</td><td>P1150-2</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Merck</td><td>30525-89-4</td><td>安全キャビネットでPBSを用いて4%に希釈し、その場で使用</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>液体</td></tr><tr><td>Polybead Amino Microspheres 3.00&mu;m</td><td>Polyscience</td><td>17145-5</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td>無菌水で希釈</td></tr><tr><td>Rabbit anti- alpha tubulin antibody</td><td>Abcam</td><td>ab6160</td><td>1:1000希釈が推奨されていますが、最適化するべきです</td></tr><tr><td>Rabbit anti mouse lamp1 antibody</td><td>Cell signaling</td><td>3243</td><td>1:200希釈が推奨されていますが、最適化するべきです</td></tr><tr><td>Rabbit anti-cep55&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab170414</td><td>1:500希釈が推奨されていますが、最適化するべきです</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody</td><td>&nbsp;Abcam</td><td>ab16504</td><td>&nbsp;1:1000 for Western Blot</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Biological Industries</td><td>01-104-1A</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>&nbsp;Merck</td><td>558255</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Winkler&nbsp;</td><td>SA-1390&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>&nbsp;Merck</td><td>9036-19-5</td><td></td></tr><tr><td>Tube 50 ml</td><td>Corning</td><td>353043</td><td></td></tr></tbody></table>
```

免疫シナプス形成中のb細胞におけるオルガネラダイナミクスの研究

Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation

B細胞受容体(BCR)による表面つな起きた抗原の認識は、シグナル伝達と抗原取り込みの両方が調整される免疫シナプス(IS)の形成を引き起こす。IS形成は、セントロソームのシナプス膜およびリソソームおよびゴルジ装置などの関連細胞内器官への偏光募集を伴う動的アクチンリモデリングを含む。アクチンリモデリングの初期段階では、B細胞は細胞表面を増加させ、シナプスで集められた抗原BCR複合体の量を最大化することができます。特定の条件下では、B細胞が硬質表面に関連する抗原を認識すると、このプロセスはリソソームの局所的な募集および分泌に結合され、抗原抽出を容易にすることができる。取り込まれた抗原は、ペプチドに処理するための特殊なエンドリソソームコンパートメントに内部化され、これは主要な組織適合性複合体II(MHC-II)分子にロードされ、Tヘルパー細胞へのさらなるプレゼンテーションを行う。したがって、ISの形成に関連するオルガネラダイナミクスを研究することは、B細胞がどのように活性化されるかを理解する上で重要である。本稿では、B細胞におけるISの形成に関連する細胞内小器官位置および細胞骨格の再配列の変化を研究するために用いられるイメージングと生化学的手法の両方について議論する。

本論文では、ビーズまたはカバーリップ上の固定化抗原を用いてB細胞を活性化し、ISの形成を誘導する方法を示す。免疫蛍光による異なる小器官の偏光を同定・定量化する方法と、ISに偏光するセントロソームとの動的な変化を受けるタンパク質を特徴付ける方法に関する情報を提供します。生化学的アプローチ。
免疫蛍光によるB細胞のイメージングは、B細胞活性化時にISに募集されるセントロソーム、ゴルジ装置、リソソームなどのオルガネラのダイナミクスに従うことを可能にします。これらの小器官の分極をISに測定し、異なる条件下で比較する定量的パラメータを得ることができます。図1Aに示すように、セントロソームとゴルジ装置は、B細胞活性化時にISに募集される。BCR-リガンドで刺激されたB細胞では募集は認められなかった-BCR関与がISにセントロソームおよびゴルジ装置を動員するために必要であることを示す(<strong cla...

本明細行では、ISの形成中にBリンパ球における細胞偏光事象を特徴付ける2つのアプローチについて説明する。第1に、シナプス膜におけるオルガネラ募集および細胞骨格再配列の定量化を含む。第2は、免疫シナプスに偏光を受けるセントロソームの組成の変化を特徴付ける生化学的アプローチである。

免疫シナプス形成中のB細胞におけるオルガネラダイナミクスの研究

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both ...

本稿では、細胞間の位置づけや組成の研究に用いられる画像化と生化学的手法、ならびに免疫シナプスの形成中に観察された細胞骨格の再調整について議論する。アクティブリモデリングの初期段階では、B細胞は細胞表面を増加させ、シナプスに集めた抗原BCR複合体の量を最大化することができます。一方、リソソームの局所的な動員は、シナプス膜における中心と共に、固定化された抗原の抽出を容易にすることが知られているリソソーム分泌物に結合することができる。取り込まれた抗原は、エンドリソソーム内でさらにペプチドに処理され、Tヘルパー細胞に提示するためにMHCクラスII分子にロードされます。したがって、免疫シナプスに関連するオルガネラダイナミクスを研究することは、B細胞がどのように完全に活性化されているかを理解するために重要です。固定化された抗原で活性化されたB細胞の免疫蛍光は、異なる細胞成分と免疫シナプスにどのようにしてリクルートできるかを可能にします。B細胞は、ビーズ表面またはカバースリップ表面で固定化された抗原を介して活性化することができる。抗原コーティングビーズは、以前グルタルアルデヒドで処理されたアミノビーズで特異的リガンドをインキュベートして、アミノ基を活性化することによって調製される。PBSと渦の100マイクロリットルで活性ビーズを再懸濁します。一方、150マイクロリットルのPBSにBCRリガンドのmL当たり100マイクログラムを加えて抗原溶液を調製した。次に、活性化ビーズ50マイクロリットルを抗原溶液に加え、摂氏4度で一晩インキュベートする。また、負のコントロールとして無関係のリガンドを使用してください。インキュベーション後、PBSでビーズを洗浄します。上清を吸引し、PBSに置き換えます。3 回繰り返します。次に、BSAの溶液の500マイクロリットルでビーズを再懸濁して3つのアミノ基をブロックする。最後に、70マイクロリットルのPBSでビーズを再懸濁します。最終的な濃度を計算するには、ヘモサイトメーターを使用してビーズを数えることができます。B細胞活性化のために、50 mLチューブを使用し、5%の牛胎児血清を補充したクリックでmLあたり150万の濃度に細胞を再中断します。次に、150,000 B細胞を加え、100マイクロリットルの細胞ビーズ混合物をポリL-リジンコーティングカバースリップの塗布を37度で異なる時間ポイントでインキュベートする。B細胞を活性化する第2のアプローチは、それらを抗原コーティングされたカバースリップに播種することです。この目的のために、抗BCRおよびB220とのコートスライドは細胞の接着を改善する。抗原溶液をPBSに添加して、それぞれ1mL当たり10マイクログラム、mL当たり0.5マイクログラムの最終濃度にします。次に、パラフィルムフィルムで覆われた24のウェルプレートの蓋の上にカバースリップをセットし、40マイクロリットルの抗原溶液を加えます。プレートを密封し、一晩4度でインキュベートします。カバースリップでアクティベーションを開始するには、まずPBSで洗浄し、数分間乾燥させます。次に、150,000 B細胞を加え、異なる時間ポイントに対して37度でインキュベートします。いずれの場合も、ビーズまたは抗原コーティングスライドのいずれかで活性化する場合は、最も長いタイムポイントから始めて、短いタイムポイントに進むのがおすすめです。ドライカバースリップを顕微鏡スライドに取り付けたら、分解能の要件に応じて、蛍光または共焦点顕微鏡を使用してサンプルを表示できます。透過光を使用してサンプルを焦点を合わせます。セルとビーズが 1 つの比率で相互作用しているフィールドを検索する必要があります。抗原で覆われたカバーリップ上で活性化されたB細胞の場合、より良い解像度のために100xの目的を使用してください。パラメーターの場合は、セル全体をカバーする z スタックを使用することを検討してください。セルの下側境界と上側境界を区切るために、アクチンにラベルを付けることができます。抗原被覆ビーズで活性化されたB細胞の場合、1点に閉じ込められたオルガネラにラベルを付ける場合、まず細胞領域とビーズ領域の2つの領域を区切ります。次に、ポイントによって位置またはオルガネラを特定し、そのローカリゼーション座標を取得します。2 つのベクトルを描画します:1 つはセルの中心とオルガネラの間、もう 1 つはセルの中心とビーズの中心の間に描画します。両方の長さを測定し、アルファと呼ばれる 2 つのベクトル間の角度を測定します。アルファのグアシアンを使用して中心と細胞の中心の間のベクトルを使用して投影を行い、投影されたベクトルaをbで割ってオルガネラの極性指数を計算します。したがって、ゼロと1の間の極性指数は偏波表現型を示す。0 からマイナス 1 の間の値は、非偏波表現型を示します。リソソームのようなより分散したオルガネラの極性指数を決定するために、前に述べたアルゴリズムと同じアルゴリズムを使用して、ラベルの質量中心の座標(この場合はリソソーム)のオルガネラ局所座標を変更することができます。前述の分析と同様に、ゼロと1の間の極性指数は偏波表現型を示し、一方、ゼロとマイナス1の間の値は非偏波表現型を示す。新しいシナプスに密接にリクルートされた各オルガネラの量を定量化するために、ビーズにおけるオルガネラ蛍光の割合を計算することができます。このためには、ビーズと細胞領域を区切り、それぞれの蛍光強度を測定し、ビーズと細胞の蛍光の合計でビーズを除算する必要があります。新しいシナプスに接触している各オルガネラの量を取得します。または、ビードの反対側に長方形を描画します。細胞長の4分の1に相当する重量を使用し、長方形内の蛍光強度を測定し、それを全蛍光で割ります。このアルゴリズムは、常に新しいシナプスに密接であるオルガネラの割合を取得しますが、必ずしもインターフェースと直接接触するとは限りません。安静および活性化されたB細胞におけるセントロソーム関連成分を定量化する。簡単に言えば、3つのパラメータを決定します。セルとビーズの領域、および中心の局所化座標。次に、中心を囲む円を定義し、前に定義したセントロソームの中心から放射状プロファイル解析を実行します。プロットを作成したら、最大蛍光の70%が維持される半径を決定します。この半径を使用して、中心を囲む円を描きます。最後に、対象成分の蛍光密度を中心領域と細胞領域で取得し、両方の値を分割して蛍光密度比を求める。免疫シナプス界面でのオルガネラの分布を測定するために、まず抗原被覆と接触しているB細胞の領域を同定する。この領域を定義しやすくするために、アクチンにラベルを付けることができます。次に、スライドと接触する領域、セルの高さおよび幅を測定します。抗原被覆スリップに面した領域は、B細胞活性化時に広がるB細胞の測定である。セルの中央領域を、境界から高さおよび幅の 4 分の 1 で区切って区切る場合は、高さと幅の値を使用します。通常これらは、セル面積の約3分の1に相当する。最後に、新シナプスの中心でのオルガネラの集生を計算し、中央領域の蛍光密度を全細胞の蛍光密度で割る。この指標の正の値は、新しいシナプスの中心にあるオルガネラの濃縮を示す。反対に、負の値は周辺分布を示します。抗原被覆カバーリップ上で活性化されたB細胞のZプレーン全体のオルガネラの分布を測定するには、まずシナプス界面と細胞の上限を区切る。次に、セルの中心を横切って線を引き、画像を再スライスして XZ イメージを取得します。細胞の頭部を測定し、同じ領域の10画分に、免疫シナプスから細胞の上限まで分割する。各z分画の蛍光を測定し、各z分数の蛍光を細胞の全蛍光で割って蛍光の割合を計算します。最後に、z分数あたりの蛍光強度の割合をプロットします。分数 1 と 2 はシナプス インターフェイスを表します。ワークフローまたはセントロソー分離手順を次に示します。条件ごとに 2,000 万個の B セルを使用します。細胞を細胞の前処理 D およびノコダゾールセントロソーム剥離を促進するために必要なプロトコルに従って.次に、5 mLのTBSバッファーに再懸濁して細胞を見る。8%スクロースを補った0.1x TBSバッファーの1 mLを使用して繰り返します。細胞ペレットを150マイクロリットルのリシスバッファーで再懸濁します。遠心分離機は、細胞質とオルガネラを核から分離するために摂氏4度で10分間10分間10、000gで遠心分離する。慎重に細胞上清を回収し、1.5 mLチューブの上に置きます。60%スクロースを補った300マイクロリットルの勾配バッファーでそれを埋めます。摂氏4度で30分間10,000gの遠心分離機サンプル。この遠心分離工程は、遠心分離体を濃縮するために重要である。遠心分離後、インターフェイスに到達するまで上清を慎重に取り出します。チューブに残っているサンプルを渦。0.45 mLの70%スクロース、50%スクロースの0.27 mL、勾配バッファー内の40%スクロースの0.27 mLを重ね合わせ、超遠心分離管で不連続なスクロース勾配を準備します。不連続勾配にセントロソーム濃縮サンプルを配置し、各アダプタの各サンプルの重量を較正します。40,000 gのチューブを摂氏4度で1時間遠心し、最低加速度で、勾配を乱さないように休憩を加えます。遠心分離後、同じ体積で12分を慎重に収集します。読み込みバッファーを使用してサンプルを再中断し、SDS-PAGE を実行します。免疫シナプスの形成中のB細胞における細胞小器官分布を研究するために、我々は異なる時点で抗原コーティングビーズで活性化された2A1.6 B細胞を用いた。コントロールとして、B細胞は無関係なBCRリガンドを含むビーズで活性化した。その後、免疫蛍光染色を用いて、固定化された抗原で活性化すると局所化を変化させる異なるオルガネラを検出する。ここでは、Rab6aでラベル付けされたアルファチューブリンとゴルジ装置で標識されたセントロソームを示しています。グラフでは、各ドットが1つのセルを表す、活性化の各時点における中心およびゴルジ装置の極性の極性指数を示す。活性化の間、これらのオルガネラの極性指数が1に近い値に達することを観察することができ、リソソームのようなより分散した分布を示すIS.Organellesへの採用の増加も極性指数を使用して定量化することができる。我々は、ライオソームの極性指数が活性化時により正の値に達することを観察することができ、これはISへの採用から生じる。免疫シナプスに対するリソソームの採用を定量化するための補完的なアプローチを示す。抗原被覆ビーズとの活性化の同じプロトコルを用いて、ISへのリソソーム募集は、ビーズの周囲またはシナプス領域内で定義された領域に採用されたリヨソームの蛍光ラベルを定量化することによって計算した。私たちは、そのオープンアクティベーションを観察することができます。シナプスの部位に結合リソソームの増加があります。.ここでは、特異的および非特異的抗原被覆ビーズで活性化されたB細胞中の中心でのアクチンの定量化を提示する。アクチンのプールは矢印で示されます。この場合のアクチンなどのセントロソーム関連成分の定量化は、ドットプロットで表され、各ドットは1つのセルを表します。活性化後、B細胞は中心系の周りのアクチンの量が減少する。このステップは、新しいシナプスへの分極を可能にするために、核外領域からセントロソームを切り離すために重要である。抗原被覆表面で活性化されたB細胞については、アクチンリモデリングやシナプス膜へのオルガネラの採用を研究することができます。ここでは、ゴルジ装置や小胞子などの小器官の分析を示し、それぞれ中央分布と末梢分布を示す。さらに、活性化の異なる時点の後にB細胞の広がる領域を計算することができます。このため、アクチンにラベルを付けて、XY平面のセル制限を定義できるようにしています。グラフでは、活性化の30分と60分後にセル領域の増加を観察することができます。オルガネラの分布は、シナプス界面にそれぞれXZ平面で計算することもできる。グラフは、最初の 2 つの平面がシナプス界面に対応する z 平面におけるアクチンの分布を表します。アクチンが活性化するとこの領域が豊かになることを観察することができます。イメージング解析に加えて、生化学的アプローチは、B細胞活性化時のセントロソーム組成物の変化を研究するためにも使用することができる。ここでは、ベージュの長方形で強調されたセントロソーム含有分率の代表的な西洋のブロットを示します。セントロソーム画分は、不連続なスクロース勾配で単離され、ガンマチューブリンレベリングによって検出された。下のウェスタンブロットは、活性化時に枯渇するB細胞を休ませる中等分でアクチンとArp2を示しています。Bリンパ球は、機能的免疫シナプスを形成するために膜界面で動的変化を起こします。このプロセスは、このビデオでここで説明するイメージングおよび生化学的手法によって研究することができます。この解析は、B細胞がどのように効率的に活性化できるかに関する分子メカニズムに関する価値情報を提供できると考えています。

studying-organelle-dynamics-in-b-cells-during-immune-synapse-formation

Research

JoVE Journal

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T細胞免疫シナプスの粒子出力を研究するためのビーズ担持脂質二重層の調製

学ぶ免疫シナプス形成におけるB細胞のオルガネラダイナミクスと細胞骨格再構成のイメージング・生化学的手法。リソソームや中心体の局在変化を定量化し、B細胞活性化機構を解明する。

免疫シナプス形成中のB細胞におけるオルガネラダイナミクスの研究

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