Name: CRISPR/Cas9を使用してCAR-TセルのGM-CSFをノックアウト (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: 学ぶCRISPR/Cas9を用いたCAR-T細胞のGM-CSFノックアウト法。遺伝子改変により効果を高め毒性を低減する細胞製造プロトコルを解説。免疫療法研究に有用です。

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この研究は、K12CA090628(SSK)、国立総合癌ネットワーク(SSK)、メイヨークリニックセンター(SSK)、プレドリン財団(SSK)、メイヨークリニック実践局(SSK)の助成金を通じて支援されました。メイヨークリニック医療科学者養成プログラムロバートL.ハウエル医師-科学者奨学金(RMS)。

このプロトコルは、メイヨークリニックの機関審査委員会(IRB)および機関バイオセーフティ委員会(IBC)のガイドラインに従っています。
1. CART19細胞生産
<ol><li>T細胞単離、刺激、および生体内培養<ol>
<li>適切な個人用保護具を用いた細胞培養フード内のすべての細胞培養作業を行う。これらはPBMCの生存可能な供給源であることが知られているとして、アフェレス中に採取された非同定正常ドナー血液コーンから末梢血単核細胞(PBMC)を収穫する。
</li>
		<li>PBMCを分離するには、50 mL密度勾配分離チューブに密度勾配媒体の15 mLを追加します。細胞捕捉を避けるために、2%の胎児ウシ血清(FBS)を含むリン酸緩衝生理食べ物(PBS)の等量でドナー血液を希釈する。<ol>
<li>コーンから希釈されたドナー血液を分離管に加え、血液と密度勾配媒体との間の界面を乱しないように注意する。RTで10分間1,200 x gで遠心分離機。</li>
			<li>新しい50 mL円錐形に上清をデカントし、PBS + 2% FBSで洗浄し、RTで最大400×gを持ち込み、RTで8分間300xgで遠心分離機を、上清を吸引し、40mLのバッファーで再中断し、細胞を数える。</li>
		</ol>
</li>
		<li>メーカーのプロトコルに従って完全に自動化されたセルセパレータを使用して、負の選択磁気ビーズキットを介してPBMCからT細胞を分離します。</li>
		<li>単離されたT細胞を培養するために、10%ヒトAB血清(v/v)、1%ペニシリン連鎖筋細胞-グルタミン(v/v)、および無血清無血性血栓性細胞培地からなるT細胞培地(TCM)を調製する。0.45 μmの無菌真空フィルターを通して濾過し、0.22 μmの無菌真空フィルターで培地を殺菌します。</li>
		<li>0日目(T細胞刺激の日)に、T細胞の刺激前にCD3/CD28ビーズを洗浄する。洗浄するには、必要な量のビーズ(3:1ビーズ:T細胞の比に十分なCD3/CD28ビーズを使用し、ビーズの濃度が可変にすることができる)を無菌1.5 mLマイクロ遠心管に入れ、TCMの1mLで再懸濁する。</li>
		<li>磁石に接触させます。</li>
		<li>1分後、TCMを吸引し、ビーズを洗浄するために新鮮なTCMの1 mLで再中断します。</li>
		<li>この手順を合計 3 回繰り返します。</li>
		<li>3回目の洗浄後、ビーズをTCMの1mLで再濁する。</li>
		<li>T セルをカウントします。</li>
		<li>ビーズを3:1ビーズの比率でT細胞に移す:細胞。</li>
		<li>細胞を1 x 106細胞/mLの最終濃度に希釈する。</li>
		<li>37 °C、24時間CO2でインキュベートします。</li>
	</ol></li>
	<li>T細胞トランスフェクションとトランスダクション<ol>
<li>BSL-2+の予防措置を使用してレンチウイルス作業を行い、細胞培養フード、個人用保護具、使用済み材料の使用済み材料の廃棄を処分前に行います。</li>
		<li>レンチウイルスベクターでCART19コンストラクトを取得します。 注:ここで利用されるCART19構造体は、市販のタンパク質合成ベンダーを使用してデノボを設計し、合成した。CAR構築物は、その後、EF-1αプロモーターの制御下で第3世代レンチウイルスにクローニングされた。単一鎖可変領域フラグメントは、FMC63クローンから導き出され、ヒトCD19を認識する。CAR19構造は第2世代4-1BBコスチミュラトリードメインおよびCD3の刺激(FMC63-41BBz)を有する。12歳
</li>
		<li>前述のようにレンチウイルス産生を行う。12歳<ol>
<li>簡単に言えば、レンチウイルスを生成するために、70-90%の合流に達した293T細胞を利用する。</li>
			<li>目的のレンチウイルスプラスミドの15 μg、ギャグ/ポール/タット/rev包装ベクトルの18 μg、VSV-Gエンベロープベクトルの7μg、プレコンプレメーション試薬の111 μL、129 μLを含むトランスフェクション試薬の室温で30分間のインキュベーションを可能にするトランスフェクション試薬、およびトランスフェクション培地の9.0 mLを293T細胞に添加する前に。次いで、トランスフェクト細胞を37°C、5%CO2で培養した。</li>
			<li>収穫、遠心分離機(10分の900 x g)、フィルター(0.45 μMナイロンフィルター)、および18時間の13,028 x gまたは2時間の112,700 x gのいずれかで超遠心分離によって24および48hで上清を濃縮する。</li>
			<li>将来の使用のために-80 °Cで凍結する。</li>
		</ol>
</li>
		<li>1日目に、0日目に1 x 106/mLで刺激されたT細胞のロゼットを分解するために、T細胞を穏やかに再中断する。</li>
		<li>すべてのレンチウイルス作業のための適切なBSL-2+予防措置の下で、3.0の感染の多重性(MOI)で刺激されたT細胞に新鮮なまたは凍結収穫されたウイルスを追加する。</li>
	</ol></li>
	<li>CAR-Tセル拡張<ol>
<li>増殖の段階の間、37°CでトランスプリケートされたT細胞をインキュベートし続け、5%CO2.CAR-T細胞を3日目と5日目にカウントし、新鮮な予め温められたTCMを培養に加え、CAR-T細胞濃度を1 x 106/mLに維持する。</li>
		<li>刺激の6日後(6日目)に磁石を用いて、移圧されたT細胞からビーズを取り出す。50mL円錐管にT細胞を1分間磁石で収穫、再中断、置きます。次に、上清(CAR-T細胞を含む)を収集し、ビーズを廃棄します。</li>
		<li>集めたCAR-T細胞を1 x 106細胞/mLの濃度で培養に戻し、膨張を再開します。</li>
		<li>6日目に、フローサイトメトリーによるCARの表面発現を評価する。 注:ヤギの抗マウスIgG(H+L)クロスadsadsedis二次抗体による染色、またはCD19特異的ペプチドによる染色による、フルオロクロムに結合した染色など、CARの表面発現を検出するためにいくつかの方法を使用することができます。ここでは、培養からアリコート(約10万T細胞)を取り出し、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、2%の胎児ウシ血清、1%のアジドナトリウムで調製したフローバッファーで洗浄する。抗CAR抗体で細胞を染色し、2回洗浄します。生きた/死んだ染色およびCD3モノクローナル抗体(OKT3)で細胞を染色する。細胞を洗浄し、フローバッファで再中断します。細胞メーターで取得し、トランスダクション効率を決定します。</li>
	</ol></li>
	<li>CAR-T細胞凍結保存<ol>
<li>刺激の8日後(T細胞増殖の8日目)のCAR-T細胞を収穫および凍結保存し、培養から細胞を収穫する。</li>
		<li>300 x gで 5 分間スピンダウンします。</li>
		<li>10%ジメチルスルホキシドおよび90%の胎児ウシ血清からなる凍結培地中のバイアル当たり1000万細胞/mLで凍結培地を再中断する。</li>
		<li>凍結容器で凍結し、-80°C冷凍庫で-1°C/minの冷却速度を達成し、48時間後に液体窒素に移します。</li>
		<li>インビトロまたはインビボ実験に使用する前に、暖かいTCMでCAR-T細胞を解凍する。</li>
		<li>細胞を洗浄して希釈し、ジメチルスルホキシドを除去し、暖かいTCMで2 x 106細胞/mLの濃度に再沈下します。37 °C、5% CO2で一晩休む。</li>
	</ol></li>
</ol>2. GM-CSF k/o CART19 生産
<ol><li>GM-CSFを破壊するには、ヒトサイトカインGM-CSFにコードするCSF2遺伝子に対して高い効率を有すると以前に報告されたヒトGM-CSF(CSF2)のエキソン3を標的とするガイドRNA(gRNA)を利用する。14歳 注:このgRNA(U6プロモーター下)を含む市販の研究グレードCas9第3世代レンチウイルス構造を用いた。このコンストラクトには、ピューロマイシン耐性遺伝子が含まれています。gRNAの配列はGACCTGCCTACAGCGCCである。12歳
</li>
	<li>レンチウイルスを製造するには、70-90%の合流率に達した293T細胞を利用してください。</li>
	<li>目的のレンチウイルスプラスミドの15 μg、ギャグ/ポール/タット/rev包装ベクトルの18 μg、VSV-Gエンベロープベクトルの7 μg、プレコンプレクエンテーション試薬の111 μL、トランスフェクション試薬の129 μL、およびトランスフェクション培地の9.0 mLを30分間インベートすることができます。mperature。</li>
	<li>293T細胞にトランスフェクション試薬を追加します。次に、37°C、5%CO2で培養する。</li>
	<li>収穫、遠心分離機(10分の900 x g)、フィルター(0.45 μMナイロンフィルター)、18時間13,028 x gまたは112,700 x gで超遠心分離によって24および48hで上清を濃縮し、将来の使用のために-80°Cで凍結します。</li>
	<li>1日目に、T細胞をそっと再び再び中断し、ロゼットを分解します。</li>
	<li>BSL-2+承認された実験室で、凍結または新たに収穫されたウイルスを刺激されたT細胞に加えてCAR-T細胞を生成する。CRISPRレンチウイルスを標的とするCAR19レンチウイルスおよびGM-CSFの両方を用いてT細胞をトランスデュースする。3のMOIでCAR19レンチウイルスを追加します。CRISPRレンチウイルスの滴定は実現できなかったので、15ugプラスミド調製から生成されたウイルス粒子を使用して10 x 106 T細胞をトランスデュースする。</li>
	<li>ステップ1で説明したように、T細胞刺激、拡張、および凍結保存の残りのステップを参照してください。
</li>
	<li>ピュロマイシン耐性を持つlentiCRISPR編集T細胞については、3日目及び5日目に1mL当たり1μgのピューロマイシン濃度でプロミシン二塩酸塩で細胞を治療する。</li>
</ol>3. GM-CSF破壊効率とGM-CSF k/o CART19の機能評価
<ol><li>GM-CSF破壊効率:分解(TIDE)シーケンシングと解析によるインデルの追跡<ol>
<li>GM-CSF遺伝子に関心のあるエキソンを配列するには、以下のプライマーを使用します。TGACTACAGAGAGGAGAのGM-CSF(CSF2)のフォワードプライマーシーケンスと、TCACCTGGACCCCACACCの逆プライマーシーケンスを使用します。</li>
		<li>ゲノム抽出キットを用い、最大500万個のCAR-T細胞からDNAを抽出します。PCR反応の場合は、μMのPCR反応における各プライマーの最終濃度を有する反応あたりのTaqマスターミックスの25 μLを使用し、テンプレートDNAの0.1-0.5 μg、およびナクレルトフリー水で最大50 μLをもたらすPCR反応の総体積を使用します。</li>
		<li>表 1に記載されている PCR 循環条件を参照してください。</li>
		<li>1-2%のアガロースゲルでPCRサンプルを100Vで30分間実行し、ゲル抽出キットを使用して抽出します。</li>
		<li>シーケンス PCR アンプリコン。生データを適切なTIDEソフトウェアにアップロードして、対立遺伝子修正頻度を計算します。15歳
</li>
	</ol>
</li>
	<li>GM-CSFの生産とGM-CSFk/o CART19の機能評価<ol>
<li>CAR-T細胞のサイトカイン産生を決定するために、急性リンパ芽球性白血病細胞株NALM6を発現するCD19を用いて野生型CART19細胞およびGM-CSFk/o CART19を37°Cで4時間、5%CO2の存在下で1:5比でインキュベートする。溶液、抗ヒトCD49d、抗ヒトCD28、および抗ヒトCD107a。</li>
		<li>フローサイトメトリーのための培養から細胞を収穫する。フローサイトメトリーバッファーで細胞を洗浄します。生きている/死んだ染色キットで細胞を染色する。室温で15分間暗いところでインキュベートし、固定培地で細胞を固定し、室温で15分間暗いところでインキュベートします。</li>
		<li>洗浄後、抗ヒトIFNγモノクローナル抗体、抗ヒトGM-CSF、抗ヒトMIP-1β、抗ヒトIL-2、抗ヒトCD3、および抗ヒトCD3とを組み合わせて透過的に細胞内に染色し、室温で30分間インキュベートするmin. サンプルを洗浄し、再中断します。フローサイトメーターでサンプルを取得し、細胞内GM-CSF式の割合を分析します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+to+target+hematologic+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies.</a> Cancer Research. 74 (22), 6383-6389 (2014).</li>
<li>Lim, W. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Principles+of+Engineering+Immune+Cells+to+Treat+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer.</a> Cell. 168 (4), 724-740 (2017).</li>
<li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axicabtagene+Ciloleucel+CAR+T-Cell+Therapy+in+Refractory+Large+B-Cell+Lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+in+Children+and+Young+Adults+with+B-Cell+Lymphoblastic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).</li>
<li>Schuster, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+in+Refractory+B-Cell+Lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2545-2554 (2017).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li>
<li>Gust, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Activation+and+Blood-Brain+Barrier+Disruption+in+Neurotoxicity+after+Adoptive+Immunotherapy+with+CD19+CAR-T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Endothelial Activation and Blood-Brain Barrier Disruption in Neurotoxicity after Adoptive Immunotherapy with CD19 CAR-T Cells.</a> Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).</li>
<li>Fitzgerald, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+Release+Syndrome+After+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cell+Therapy+for+Acute+Lymphoblastic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> Critical Care Medicine. 45 (2), e124-e131 (2017).</li>
<li>Liu, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+genome+editing%3A+Fueling+the+revolution+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Research+in+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 genome editing: Fueling the revolution in cancer immunotherapy.</a> Current Research in Translational Medicine. 66 (2), 39-42 (2018).</li>
<li>Ren, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+chimeric+antigen+receptor+T+cell+therapy+with+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Advancing chimeric antigen receptor T cell therapy with CRISPR/Cas9.</a> Protein Cell. 8 (9), 634-643 (2017).</li>
<li>Sterner, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+inhibition+reduces+cytokine+release+syndrome+and+neuroinflammation+but+enhances+CAR-T+cell+function+in+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts.</a> Blood. , (2018).</li>
<li>Dietz, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+source+of+viable+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+leukoreduction+system+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers.</a> Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).</li>
<li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).</li>
<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), e168(2014).</li>
</ol>

SSKは、ノバルティス(メイヨークリニック、ペンシルバニア大学、ノバルティス大学との間の契約に基づく)にライセンスされているCAR T細胞療法の分野における特許の発明者です。これらの研究は、ヒューマニゲン(SSK)からの助成金によって部分的に資金提供されました。RMS、MJC、RS、およびSSKは、本研究に関連する特許の発明者です。研究室(SSK)は、トレロ、ヒューマニゲン、カイト、レンティゲン、モルフォシス、アクチニウムから資金を受け取ります。

本報告では,CRISPR/Cas9技術を利用してCAR-T細胞に二次修飾を誘導する方法論について述べた.具体的には、目的の遺伝子を標的とするgRNAとCas9を含むウイルスベクターを用いてレンチウイルス伝達を用いてGM-CSFk/o CART19細胞を生成することが実証されている。我々は以前、GM-CSF中和が異種移植片モデルでCRSおよびNTを改善することを示した。12前述したように、GM-CSFk/o CAR-T細胞は、製造プロセス中のGM-CSFの阻害を可能にし、他の重要なT細胞機能を維持しながらGM-CSFの生産を効果的に低減し、増強をもたらす野生型CAR-T細胞と比較した生体内の抗腫瘍活性12歳
ゲノム中のCas9の永久的な統合は、臨床的に実行可能な製品に翻訳された場合、望ましくない効果と関連する可能性があるため、我々は概念実証のための研究グレードCRISPR/Cas9改変CART19を生成する方法として、この特定の方法論を提案する実...

キメラ抗原受容体T(CAR-T)細胞療法は、癌の治療において大きな期待を示す。1,2 CD19(CART19)を標的とする2つのCAR-T細胞療法は、マルチセンター臨床試験で顕著な結果を実証した後、B細胞悪性腫瘍の使用のために最近、米国で承認されました。3,4,5 CAR-T細胞のより広範な使用への障壁は、固形腫瘍およびサイトカイン放出症候群(CRS)および神経毒性(NT)を含む関連毒性における限られた活性である。3,5,6,7,8,9 CAR-T細胞治療の治療指標を高めるために、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、タレン、CRISPRなどのゲノム工学ツールを用いて、CAR-T細胞をさらに改変し、毒性の低い、またはより効果的なCAR-T細胞を生成する試みを行います。10歳,11歳
この記事では、CRISPR/Cas9編集CAR-Tセルを生成する方法について説明します。この方法の具体的な目的は、CRISPR/Cas9を介したCAR-T細胞製造中にCAR-T細胞を遺伝的に改変し、毒性が低い、またはより効果的なCAR-T細胞を生成することです。この方法論を開発するための根拠は、CAR-T細胞療法の臨床経験から学んだ教訓に基づいて構築されており、CAR-T細胞療法の治療窓口を拡大し、適用を拡大するための新しい戦略の緊急の必要性を示しています。他の腫瘍および合成生物学の最近の進歩によって支えられ、診療所に入り始めたCAR-T細胞の複数の修飾を可能にする。亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、タレン、CRISPRなど、さまざまな設定で複数のゲノム工学ツールが開発・応用されていますが、CAR-T細胞のCRISPR/Cas9改質について説明しています。10歳,11 CRISPR/Cas9は外来DNAを除去するように設計されているRNAベースの細菌防御機構である。CRISPRは、ガイドRNA(gRNA)を介して同定された標的配列を切り分けるためにエンドノクレアーゼに依存しています。CAR-T細胞のCRISPR編集は、他のゲノム工学ツールに対していくつかの利点を提供します。これらには、gRNA配列の精度、目的の遺伝子を標的とするgRNAを設計する簡易性、高い遺伝子編集効率、および複数のgRNAを同時に使用できるため、複数の遺伝子を標的とする能力が含まれる。
具体的には、ここで説明する方法では、CRISPRガイドRNAとCas9をコードするレンチウイルスを用いて、T細胞のCAR伝達中に遺伝子を破壊した。CAR-T細胞を編集するための適切な手法を選択する際には、ここで説明する技術は、研究グレードのCAR-T細胞を生成する効率的なメカニズムであることを示唆していますが、Cas9をゲノムに永久的に統合する長期的な効果は不明であるため、この方法論は、概念実証研究グレードCAR-T細胞を開発するために提案するが、良好な製造実践グレードCAR-T細胞を製造するためのものではない。
特に、ヒトCD19を標的とする顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)ノックアウトCAR-T細胞の生成について説明する。これらのCAR-T細胞は、GM-CSF(遺伝子名CSF2)およびCas9に特異的なガイドRNAをコードするレンチウイルス粒子との伝達によって生成された。我々は以前、GM-CSF中和が異種移植片モデルでCRSおよびNTを改善することを見出した。12 GM-CSFk/o CAR-T細胞は、製造プロセス中のGM-CSFの阻害を可能にし、野生型CAR-T細胞と比較してCAR-T細胞抗腫瘍活性および生体内での生存を高めながら、GM-CSFの産生を効果的に減少させる。12このように、ここではCRISPR/Cas9編集CAR-Tセルを生成する方法論を提供する。

<table><tbody><tr><td>CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>12-0037-42</td><td></td></tr><tr><td>CD3 Monoclonal Antibody (UCHT1), APC, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>17-0038-42</td><td></td></tr><tr><td>Choice Taq Blue Mastermix</td><td>Denville Scientific</td><td>C775Y51</td><td></td></tr><tr><td>CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28</td><td>Gibco</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX System B4-R2-V2</td><td>ベックマン・コールター</td><td>C10343</td><td>フローサイトメーター</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>ミリポア シグマ</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水</td><td>Gibco</td><td>14190-144&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MPC-S (磁性粒子濃縮器)</td><td>Applied Biosystems</td><td>A13346</td><td></td></tr><tr><td>Easy 50 EasySep Magnet</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18002</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Human T Cell Isolation Kit&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>17951</td><td>ネガティブセレクション磁気ビーズ; 17951RF チップとバッファーを含む</td></tr> ウ<tr><td>シ胎児血清</td><td>ミリポア シグマ</td><td>F8067</td><td></td></tr><tr><td>FITC マウス アンチヒト CD107a&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>555800</td><td></td></tr><tr><td>固定培地 (培地 A)</td><td>Invitrogen</td><td>GAS001S100</td><td></td></tr><tr><td>GenCRISPR gRNA コンストラクト: 名前: CSF2 CRISPR ガイド RNA 1;種:ヒト、ベクター: pLentiCRISPR v2;耐性:アンピシリン;コピー番号: High;プラスミド調製:標準送達:4 &mu;g (無料 )</td> <td>GenScript</td><td>N/A</td><td>カスタムオーダー</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG (H+L) 交差吸着二次抗体, Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21235</td><td></td></tr><tr><td>https://tide.nki.nl.</td><td>デスクトップジェネティクス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヒトAB血清;男性ドナー;タイプAB;US</td><td>Corning</td><td>35-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>IFN γ モノクローナル抗体 (4S.B3), APC-eFluor 780, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>47-7319-42</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>L3000075</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td><td>Invitrogen</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07851</td><td></td></tr><tr><td>Monensin Solution, 1000X</td><td>BioLegend</td><td>420701</td><td></td></tr><tr><td>マウス反ヒトCD28クローンCD28.2</td><td>BD Pharmingen</td><td>559770</td><td></td></tr>マウス<tr><td>反ヒトCD49dクローン9F10</td><td>BD Pharmingen</td><td>561892</td><td></td></tr><tr><td>マウス反ヒトMIP-1&β;PE-Cy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>560687</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty 冷凍コンテナ</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>NALM6, clone G5&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-3273</td><td>急性リンパ芽球性白血病細胞株</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリーウォーター</td><td>Promega</td><td>P119C</td><td></td></tr><tr><td>Olympus 真空フィルターシステム、500 mL、PES メンブレン、0.22uM、滅菌済み</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-227</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Rapid-Flow 滅菌ディスポーザブルフィルターユニット、CN メンブレン付き 0.45uM</td><td>Thermo Scientific Nalgene</td><td>450-0045</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced-SerumMedium (1X), Liquid</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 Mouse Anti-Human IL-2</td><td>BD Horizon</td><td>562384</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X), Liquid</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Permeabilization Medium (Medium B)</td><td>Invitrogen</td><td>GAS002S100</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K182001</td><td></td></tr><tr><td>ピューロマイシン二塩酸塩</td><td>MP Biomedicals, Inc.</td><td></td><td></td>0210055210</tr><tr><td>QIAquick ゲル抽出キット</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗ヒト GM-CSF BV421</td><td>BD Horizon</td><td>562930</td><td></td></tr><tr><td>RoboSep-S</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>21000</td><td>全自動セルセパレーター</td></tr><tr><td>SepMate-50 (IVD)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85450</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム、5% (w/v)</td><td>Ricca Chemical</td><td>7144.8-16</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 無血清造血細胞培地</td><td>ロンザ</td><td>04-418Q</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr/cas9を使用してcar-tセルのgm-csfをノックアウト

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

キメラ抗原受容体T(CAR-T)細胞療法は、がんに対する最先端かつ潜在的に革命的な新しい治療オプションです。しかし、癌の治療におけるその広範な使用には重大な制限がある。これらの制限には、サイトカイン放出症候群(CRS)および神経毒性(NT)などのユニークな毒性の開発と、固形腫瘍における限定的な拡張、エフェクター機能、および抗腫瘍活性が含まれる。CAR-T細胞の有効性および/または制御毒性を高めるための1つの戦略は、CAR-T細胞製造中にCAR-T細胞自体のゲノムを編集することです。ここでは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)およびCas9へのガイドRNAを含むレンチウイルス構造を用いたトランスダクションによるCAR-T細胞におけるCRISPR/Cas9遺伝子編集の使用について述べた。例として、GM-CSFのCRISPR/Cas9媒介ノックアウトについて説明する。これらのGM-CSFk/o CAR-T細胞は、重要なT細胞機能を維持しながらGM-CSFを効果的に産生し、野生型CAR-T細胞と比較して生体内で抗腫瘍活性を高める結果をもたらすことを示した。

図1は、GM-CSFk/o CART19細胞におけるGM-CSFの減少を示す。T細胞のゲノムがノックアウトGM-CSFに改変されたことを確認するために、TIDEシーケンシングをGM-CSFk/o CART19細胞(図1A)で使用した。CAR-T細胞表面染色は、T細胞が生きているCD3+細胞にゲーティングすることによりインビトロでCAR表面受容体を正常に発現していることを確認する(図1B)。流量細胞メトリーによるGM-CSFの細胞内染色は、生きているCD3+細胞上でゲーティングすることによりGM-CSFk/o CART19細胞におけるGM-CSFの発現の低下を示し、ノックアウトの機能的成功を確認した(図1C)。 GM-CSFk/o CAR-T細胞は、細...

ここでは、CRISPR/Cas9システムを介してCAR-T細胞を遺伝的に編集するプロトコルを提示する。

CRISPR/Cas9を使用してCAR-TセルのGM-CSFをノックアウト

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

当社のプロトコルは、CRISPR技術を介して製造中のCAR-T細胞の遺伝子改変を記述し、より効果的で毒性の低い製品を生成します。この技術の利点は、CAR-T細胞の産生と遺伝子操作の両方が効率の良い1つの細胞で起こり得る点である。この手順のデモンストレーションは、MD博士課程の学生であるロザリー・スターナー、技術者で大学院生のミシェル・コックス、私の研究室の博士研究員のレオナ・サケムラです。採取した末梢血単核細胞からT細胞を単離した後、最初にT細胞培地を調製し、0.45マイクロメートルの無菌真空フィルターを通してそれを濾過し、0.22マイクロメートルの無菌真空フィルターで殺菌することによって培養を開始する。T細胞刺激またはゼロ日の日には、刺激の前に、無菌1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに必要な量のビーズを入れ、TCMの1ミリリットルで再懸濁してCD3/CD28ビーズを洗浄します。チューブを磁石に1分間接触します。その後、TCMを吸引し、新鮮なTCMの1ミリリットルで再懸濁してビーズを再び洗浄し、合計3回の洗浄を繰り返します。そして最後に、ビーズをTCMの1ミリリットルで再中断します。T細胞を数えた後、ビーズをT細胞に3対1のビーズの比率で細胞に移す。その後、1ミリリットル当たり100万個の細胞の最終濃度に細胞を希釈し、摂氏37度、5%CO2で24時間インキュベートします。LENTiviralベクターでCART19コンストラクトを取得した後、レンチウイルスプラスミド、包装ベクター、エンベロープベクター、前錯化試薬、トランスフェクション試薬、トランスフェクション試薬、トランスフェクション培地を室温で30分間インキュベートすることによりレンチウイルス産生を行う。BSL2+の予防措置を使用してレンチウイルス作業を行い、細胞培養フード、個人用保護具、廃棄前に使用済み物質の漂白剤による消毒を行います。インキュベーション後、これらのトランスフェクション試薬を70~90%の合流度に達した293個のT細胞に加え、トランスフェクト細胞を摂氏37度および5%CO2で培養します。トランスフェクション、収穫、遠心分離機、超遠心分離によるウイルス含有上清を濾過し濃縮し、将来の使用のためにマイナス80°Cで凍結した後、24時間と48時間後に。初日、ゼロ日目に1ミリリットル当たり100万個の細胞で刺激されたT細胞を穏やかに再懸濁し、細胞のロゼットを分解する。適切なBSL2+予防策の下で、3.0の感染の多重度でシミュレートされたT細胞に新鮮または凍結収穫されたウイルスを追加する。トランスデューションされたT細胞を摂氏37度、5%CO2でインキュベートし続ける。3日目と5日目に、CAR-T細胞を数え、新鮮な事前温められたTCMを培養物に加え、1ミリリットル当たり100万個の細胞のCAR-T細胞濃度を維持する。シミュレーションの6日後、細胞を最初に採取して再懸濁させることで、トランスデューシングされたT細胞からビーズを取り除きます。50ミリリットルの円錐管で細胞を移し、1分間磁石にチューブを入れる。CAR-T細胞含有上清を回収し、ビーズを廃棄した後、培養フラスコ中の1ミリリットル当たり100万個の細胞の濃度で細胞を培養に戻す。フローサイトメトリーの細胞サンプルを使用して、CALの表面発現を評価します。残りをインキュベートして拡張を再開し、原稿に記載されているように8日目に細胞を収穫して凍結保存します。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を破壊するために、原稿に記載されているガイドRNAを利用する。トランスフェクション試薬を室温で30分間インキュベートします。インキュベーション後、70~90%の合流度に達した293個のT細胞に加え、トランスフェクション細胞を摂氏37度、5%CO2で培養し、レンチウイルスを産生する。24時間と48時間で、50ミリリットル超遠心チューブで超遠心分離することによりウイルス含有上清を収穫し濃縮し、将来の使用のためにマイナス80°Cで凍結する。そして1日目に、T細胞を穏やかに再中断してロゼットを分解します。BSL2+承認された実験室で、CAR-T細胞を生成するために、CAR19レンチウイルスおよびGMCSF標的CRISPRレンチウイルスをシミュレートされたT細胞に加える。3日目と5日目に、ピューロマイシン耐性を持つLentiCRISPR編集T細胞を正常にトランスデューシングし、1ミリリットル当たり1マイクログラムのピューロマイシンの濃度でプロマイシンジヒドロクロリドを有する細胞を治療する。潮汐シーケンシングは、生きたCD3陽性細胞にゲート付きCAR-T細胞表面染色ゲートの約71%フロープロットの破壊効率を有するGM-CSFノックアウトCART19細胞のGM-CSF減少を確認するために使用され、野生型CART19およびGM-CSFノックアウトCART19の両方が正常に、同様の方法でCAR受容体を発現することを示す。一方、フローサイトメトリーによるGM-CSFの細胞内染色は、生きたCD3陽性細胞にもゲートされ、ノックアウトの機能的な成功を確認する野生型CART19細胞と比較して、ノックアウト細胞におけるGM-CSFの発現が低下することを示している。遺伝子組み換えCAR-T細胞の開発に最も重要であるため、この手順の導入ステップ中に特に注意する必要があります。記載された方法論は、CRISPR/CAS9を介してCAR-T細胞を改変するために様々な遺伝子に適用される可能性があり、毒性が低く、より効果的な産物を生成するのに役立ちます。CRISPR/CAS9技術は、CAR-T細胞のゲノムを直接標的にして、現在の臨床欠点に対するソリューションを設計する戦略を提供します。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

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CRISPR-Cas9システムを用いたCAR-T細胞の遺伝子改変

このビデオでは、CRISPR-Cas9技術を用いてヒトT細胞の遺伝子編集を行うアッセイを実演しています。初代CD4+およびCD8+...

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CRISPR/Cas9 を使用して遺伝子変異カルレティキュリン サイトカイン依存性造血細胞での発癌性の活動を調査する編集

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