EVOLVER を用いた自動、高スループット、連続細胞増殖実験の設計

eVOLVERは、研究者に実験的な自由を与え、複数のパラメータに対する自動フィードバックを用いて独自の培養成長実験を定義し、必要なサイズに拡張することができます。eVOLVER は他のデバイスよりも柔軟性があります。ユーザーは、各カルチャのセンサーを保持するスマート スリーブを変更することで、Python のソフトウェアとハードウェアを簡単にカスタマイズできます。

システムは、一見複数のコンポーネントと接続で複雑に見える可能性があります。ビジュアルガイドは、初めてのユーザーが自分で実験を実行することに自信を与えます。適切なセットアップが重要です。

各コンポーネントの動作を理解してください。したがって、彼らが動作していることを確認することができます。すべてが正しくルーティングされ、しっかりと接続されていることを確認します。

様々な条件で細菌や酵母の好気培養のために設計されている間, eVOLVERはまた、嫌気性発酵のために、または懸濁中の哺乳類細胞を維持するために変更することができます.このビデオでは、eVOLVER プラットフォームを使用して、高スループット連続カルチャ実験をセットアップ、初期化、実行する方法を説明します。実験の前日に、原稿に従ってメディア、バイアル、接種を準備します。

3つの大きなビーカーで、10%漂白剤のビーカーを2つと70%エタノールのビーカーを1つずつ調製します。eVOLVERデバイスのスイッチを使用して、eVOLVERの5ボルト電源をオンにして5秒間待ってから、12ボルトの電源をオンにします。同じメディア・ボトルから複数のバイアルを実行している場合は、複数のメディア入力ラインをチューブスプリッターで接続します。

カスタムチューブスプリッターは、より低いコンポーネントで構築することができます。第1漂白剤ビーカーのメディア入力ラインと、2番目の漂白ビーカーのメディア流れ線を水没させる。メディア入力ラインの下流端を、2 番目のビーカーにエフラックスラインで接続します。

廃棄物のカーボイに廃棄物ラインを配置します。実験中に発生した廃棄物を殺菌するために、廃棄物のカーボイに漂白剤の1〜2リットルを追加します。eVOLVER のタッチスクリーンを使用して、セットアップ セクションに移動し、すべてのポンプを 20 秒間実行して、流体ラインを 10%漂白剤で満たします。

漂白剤を少なくとも30分間ラインに座って殺菌します。ラインが水没しなくなるまでタッチスクリーンを使用して再びポンプを実行し、ラインを通して空気を押し抜いてできるだけ多くの漂白剤を取り出します。エタノールビーカーにメディア入力ラインを入れ、エタノールでラインを満たし、空気でそれらを洗い流します。

次に、メディア入力ラインを下のコネクタでメディアボトルに取り付け、残留エタノールをフラッシュするラインを完全にメディアが通過するまでポンプを実行します。部分的にeVOLVERスマートスリーブに殺菌されたバイアルを挿入し、色分けに従って短い流入わらと廃棄物ラインに入力ラインをフックアップ。eVOLVERタッチスクリーンを調整して、バイアルをメディアで満たすために10秒単位ですべてのポンプを実行します。

目視検査により、流出ポンプは流出を防ぐために、流出ストローを通して媒体を効率的に除去します。その後、バイアルをスマートスリーブに完全に包むまで押し下げろ。eVOLVERタッチスクリーンインタラクティブセットアップページで、タッチスクリーンを横切って指をドラッグするか、[すべて選択]ボタンを押してバイアルをすべて選択し、温度の初期条件を摂氏30度に設定し、攪拌を10度に設定します。

コンピューターで、実験を実行する eVOLVER デバイスを指定します。必要なキャリブレーション設定が選択されていることを確認します。eVOLVER ダッシュボードを開き、[実験マネージャー] ページに移動します。

実験ナビゲータパネルでベース実験を選択するか、既存の実験を開始点として選択し、「クローン」をクリックします。[実験エディター] ページに移動します。バイアルセレクターとパラメータ定義パネルを使用して温度を摂氏30度に調整し、実験計画に従って各バイアルのODの上下の閾値を設定します。

[保存] をクリックして、実験を保存します。次に、矢印をクリックして実験マネージャページに戻り、[再生]ボタンをクリックして実行します。実験が進行したら、インタラクティブダッシュボードのリアルタイムデータパネルに移動します。

各バイアルについて、OD 値がゼロに保持されていることを確認します。温度グラフを参照して、温度が摂氏 30 度に達しているか、または 30°C に向かって進行していることを確認します。接種を調製するために、まず一晩培養物のODを測定し、25ミリリットルのバイアル量と約0.05の所望の開始ODを仮定して、一晩培養のための所望の完全希釈を計算する。

サンプリングポートを介して、接種物またはイノキュラの混合物の計算された体積をピペット。ダッシュボードのグラフをチェックして、OD が 0.05 に増加していることを確認します。細胞の成長とバイアルの状態は、実験が進行中である間、リアルタイムで監視することができ、研究者は何らかの問題が発生した場合に介入することができます。

eVOLVER は、培養条件の複数パラメータ制御を可能にする自動化された連続培養プラットフォームです。eVOLVER成長率データから補間された世代に対して対数比をプロットした場合、野生型、温度感受性、塩感受性基の間に定性的な違いが示された。色は選択温度を示し、ダッシュは塩濃度を区別します。

傾斜角は、最低 3 点を使用して各プロットの線形部分を通してフィットし、バリアント歪みが参照歪みと競合する方法を記述する定量的適合値を生成します。負のフィットネス値は、バリアント歪が参照歪みによって競合していることを示します。すべてのポンプが効率的に動作していること、および流体ラインが下駄を取り除かっていることを常に確認してください。

オーバーフローは実験を台無しにし、スマートスリーブを損傷する可能性があります。eVOLVERから採取したサンプルは、実験の結果としてゲノム変化をチェックするために、その後の順序付けが可能です。この情報は、新しい系統やシステムの設計に使用できます。

ラボの進化やライブラリの選択を使用する研究者にとっては、各eVOLVER実験で独自の選択圧力を適用することは容易です。フィードバック制御と動的環境も非常にアクセス可能になりました。廃棄物のカーボイは、実験後に少量の漂白剤とエタノールを含みます。

廃棄物の適切な処理については、ラボの安全コーディネーターに相談してください。