Name: EVOLVER を用いた自動、高スループット、連続細胞増殖実験の設計 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 学ぶeVOLVERを用いた自動連続培養システムの構築と運用方法。リアルタイムモニタリングと多パラメータ制御により、微生物の適応進化実験を効率的に実施できます。

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私たちは、システムの設計に彼の援助のためのハリール、Soltanianzadeh、a. Sun、s. パイプ、およびシステムの構築を支援するための Cavale に感謝します。私たちは、電子設計設備 (EDF)、エンジニアリング製品イノベーションセンター (エピック)、およびソフトウェア & アプリケーションイノベーションラボ (セイル) のサービスのために、ボストン大学・ハリリコンピューティング研究所に承認を行います。この作品は、NSF キャリア賞 (MCB-1350949 ~ A.S.K.) と、DARPA 助成 HR0011-15-C-0091 と HR0011-18-2-0014 (A.S.K.) によってサポートされました。A.S.K. はまた、NIH ディレクターの新イノベーター賞 (1DP2AI131083)、DARPA ヤング・・アワード (D16AP00142)、およびコンピューティングでの NSF 遠征 (CCF-1522074) からの資金を認めています。

1. 培地、バイアル、接種の準備
注:このプロトコルは、ユーザがすでに eVOLVER システムを較正しており、前の作業16で説明したスマートスリーブ構成を使用していることを前提としています。スマートスリーブは簡単に再設計または変更されますが、音量および制御パラメータの設定詳細は、代替構成によって異なる場合があります。
<ol><li>実験の前日に、少なくとも300に設定された振盪インキュベーター中で30° c の YPD 培地 (酵母ペプトンデキストロース) にセレビシエ BY4741 の参照菌株および変異株の 2 mL の一晩液体培養液を調製する。</li>
	<li>無菌 YPD メディアを、チューブを取り付けたオートクレーブに入れた清潔なボトルに移します。あるいは、媒体は管と事前に取り付けられたボトルに直接オートクレーブすることができる。 注:ボトルは、キャップに穴をあけ、それをコネクタで貫通して所定の位置に固定することでチューブにフィットします。資料の表を参照してください。</li>
	<li>各バイアルに攪拌バーを追加し、流入および流出ストローを備えたバイアル蓋にネジ。すべてのコンポーネントが目視検査によってクリーンであることを確認します。</li>
	<li>オートクレーブ可能ラックにバイアルを配置し、箔で覆い、20分の滅菌ステップで重力または真空サイクルでオートクレーブします。</li>
</ol>2. 実験の設定
<ol><li>3つの大きなビーカーに、10% の漂白剤の 500 mL、10% の漂白剤の 200 mL、および 70% のエタノールの 300 mL を準備します。</li>
	<li>EVOLVER デバイスのスイッチを使用して、eVOLVER の5v 電源をオンにし、5秒間待ってから、12v 電源をオンにします。</li>
	<li>同じメディア・ボトルから複数のバイアルを実行している場合は、複数のメディア入力ラインをチューブ・スプリッタで接続します。カスタムチューブスプリッタはルアーコンポーネントで構築することができます。</li>
	<li>最初の漂白ビーカーにメディア入力ラインを沈め、第2の漂白ビーカーにメディア流出ラインを浸す。メディア入力ラインの下流側の端を、流出ラインとともに2番目のビーカーに配置します。廃棄物明細行を廃棄 carboy に配置します。</li>
	<li>1-2 L の漂白剤を carboy に添加し、実験中に発生した廃棄物を滅菌します。廃棄物を適切に処理するために、安全コーディネーターに相談すること。</li>
	<li>EVOLVER 上のタッチスクリーンを使用して、セットアップセクションに移動し、10% の漂白剤で流体ラインを埋めるために 20 s のためのすべてのポンプを実行します。走行中は、すべてのラインが充填されており、ポンプが正常に動作していることを目視検査で確認してください。漂白剤は、滅菌するために少なくとも30分のラインに座ることができます。</li>
	<li>ラインが水没しなくなるまでタッチスクリーンアプリを使用してポンプを再度実行し、線を通して空気を押して、できるだけ多くの漂白剤を取り出します。</li>
	<li>メディア入力ラインをエタノールビーカーに入れ、上記のように繰り返し、エタノールで線を充填し、空気で洗い流す。 注:エタノールが早く死滅するので、滅菌のために30分待つ必要はありません。</li>
	<li>ルアー・コネクター付きのメディア・ボトルにメディア入力ラインを取り付け、媒体が完全にラインを通過するまでポンプを作動させることにより、残留エタノールをフラッシュします。</li>
	<li>部分的に eVOLVER スマートスリーブに滅菌バイアルを挿入し、ライン上のカラーコーディングに応じて、適切な位置にラインをフック。まず、短い流入わらに入力ラインを取り付け、その後、長い排水わらにラインを無駄にします。 注意:接続が緩いか、回線が正しく配線されていないかを確認することが重要です。これを怠ると、オーバーフローが発生し、スマートスリーブに損傷を与える可能性があります。</li>
	<li>すべてのポンプを10秒単位で実行して、バイアルにメディアを充填します。目視検査の流出ポンプによって確実に流出のわらによって媒体を取除くことは効果的にオーバーフローを防ぐためにである。流出のわらが効率的に機能していないように見える場合は、流体線の接続と蠕動ポンプを検査します。必要に応じて部品を修正または交換します。</li>
	<li>スマートスリーブに完全に包まれるまでバイアルを押し下げます。</li>
	<li>インタラクティブセットアップページの eVOLVER タッチスクリーンを使用して、実験パラメータの初期条件を設定します。すべてのバイアルについて、温度を30° c に設定し、攪拌して10にします。これは、タッチスクリーン上で指をドラッグしてすべてのバイアルを選択することによって、一度にすべてのバイアルに対して行うことができます。</li>
</ol>3. eVOLVER ソフトウェアの設定とアルゴリズム培養ルーチンのプログラミング
<ol><li>コンピュータの eVOLVER ダッシュボードで、[テストマネージャ] ページに移動します。実験ナビゲータパネルで基本実験を選択するか、既存の実験を開始点として選び、[新規作成] をクリックします。 注:実験定義が実験マネージャに保存されているレポに GitHub リンクを貼り付けることによって、他のグループからの実験を使用することが可能です。</li>
	<li>実験を実行する実験名と eVOLVER デバイスを指定します。ページ上でこれらのフィールドを変更して、必要なキャリブレーション設定が選択されていることを確認してください。</li>
	<li>バイアルセレクターとパラメータ定義ペインを使用して、実験条件を設定します。たとえば、バイアル0-4 の温度を30° c に設定するには、バイアルセレクターでバイアルを選択し、パラメーター定義を30に設定し、「 set」をクリックします。各バイアルの上限と下限のしきい値を設定するには、OD のこれを繰り返します。</li>
	<li>実験パラメータの定義が完了したら、[保存] をクリックして実験を保存し、[開始] をクリックして実行します。</li>
</ol>4. リアルタイムでの実験とモニタリングの開始
<ol><li>実験が進行したら、対話型ダッシュボードのリアルタイムデータパネルに移動します。各バイアルについて、OD 値がゼロで保持されていること、およびその温度がグラフを参照することによってプログラムレベルに向かって進んでいることを確認します。</li>
	<li>接種を調製するために、一晩培養物の OD を測定し、25 mL のバイアル容積を仮定して所望の倍希釈量を計算し、そしてサンプリングポートを通して試料をバイアル中にピペットの量を算出する。例えば、約0.05 の所望の開始 OD に到達するために、培養液は、OD 2.0 である一晩培養物から、625μ l の細胞を各バイアルに添加すべきである。</li>
	<li>それに応じて OD グラフが更新されていることを確認するために、ダッシュボード上のグラフを確認してください。所望の開始 OD の近くへの増加は、グラフに見られるべきです.</li>
	<li>ダッシュボードの対応するグラフを参照して、実験全体でさまざまなデータタイプ (OD、温度、成長率、世代、メディア消費など) を追跡します。これらの値は、ユーザによる実験的な決定 (例えばスケジュール timepoints) を通知したり、自動フィードバックを実行する関数で使用されることさえあります。</li>
	<li>メディアボトルの mid 実験を置き換えるには、[実験マネージャ] パネルで実験を一時停止して、ポンプイベントが発生しないようにします。すぐに空のボトルからメディアラインを緩め、新しいボトルに接続します。汚染を防ぐためにチューブの先端に触れないようにしてください。実験マネージャで実験を再開します。</li>
</ol>5. eVOLVER バイアルから酵母細胞をサンプリング
<ol><li>シクロヘキサミド溶液を調製してタンパク質合成を阻害し、酵母細胞をフローサイトメトリー分析用に修正します。15 mL の円錐形の管で、PBS の 12 mL および 20 mg/mL のシクロヘキサミドと 5 s の渦の12μ l を加えてください。</li>
	<li>マルチチャンネルピペットを使用して、アリコート100μ l を 96-ウェル丸底プレートの各ウェルに注入します。</li>
	<li>アルミホイルでプレートを巻いて光を遮断し、必要になるまで4° c で保管してください。</li>
	<li>サンプルには、延長長さ200μ l の先端を使用してバイアル蓋のサンプリングポートを介してピペット。</li>
	<li>バイアルの100μ l を固定プレートのウェルに入れ、ピペットで上下にピペッティングして 2 ~ 3 を混合し、次にホイルで回収し、プレートを4° c に戻します。</li>
</ol>6. 実験ブレークダウンとクリーンアップ
<ol><li>大きなビーカーに 10% の漂白剤と 2 500 mL DI 水溶液の 1 L を用意してください。</li>
	<li>[テストマネージャ] パネルで [stop] コマンドを送信して、実験を停止します。データは引き続きクラウド対応データベースに保存され、後でダッシュボードのリアルタイムデータパネルで表示することも、オフライン分析用にダウンロードすることもできます。</li>
	<li>スマートスリーブからバイアルを取り外し、その後のステップでオーバーフローを避けるために、オートクレーブラックに配置します。</li>
	<li>メディアの入力ラインを外し、10% の漂白剤のビーカーに入れます。EVOLVER ユーザーインターフェイスからのポンプをセットアップと同様に実行して、ラインやバイアルを滅菌します。</li>
	<li>水でバイアルと水没ラインからラインを切断します。ポンプを実行して、最初にシステムから漂白剤を取り出し、次に空気で洗い流す。</li>
	<li>EVOLVER をオフにするには、まず12v 電源をオフにし、5秒待ってから 5 V 電源をオフにします。</li>
	<li>10% の漂白剤で攪拌棒とキャップを浸し、その後、DI 水で洗い流します。各キャップの流入と流出のストローは、DI 水を通して洗い流すようにしてください。フィルムが壁に形成されている場合は、試験管ブラシを使用してバイアルをスクラブします。</li>
	<li>廃棄物を適正に処分し、廃棄物を十分に洗浄する。 注意:廃棄物の容器は、10% の漂白剤、滅菌された細胞培養廃棄物、および微量のエタノールの混合物を含みます。適切な取り扱いと廃棄については、安全コーディネータにご相談ください。</li>
</ol>7. 分数母集団のフローサイトメトリー解析を用いた適性の定量化
<ol><li>適切な蛍光チャネルと検出器16を備えたフローサイトメーターを使用して、セクション5から収集されたサンプルを分析します。</li>
	<li>サンプルごとに少なくとも1万のイベントを取得し、前方および側面の散布データを使用して、無傷のセルのゲートを確保します。</li>
	<li>ゲートは、適切な蛍光チャネル (例えば GFP) に基づいて、各母集団の小数分布を決定する。</li>
	<li>コンピュータ上で、[エクスポート] ボタンをクリックして、[テストマネージャ] ページから目的の場所にデータを保存します。</li>
	<li>EVOLVER データ・ファイルから、各バイアルの各 timepoint によって完了した世代の数を決定します。EVOLVER コードでは、世代は、最初に各希釈事象間の OD データをセグメント化することによって計算され、次に<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59652/59652eq1.jpg">各セグメントは、各セグメントに対する形態の基本的な指数に適合し、得 r、成長率16である。期間の世代数は、次の式を使用して計算されます。 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59652/59652eq2v2.jpg">
</li>
	<li>サンプルが採取された時点での上記の計算からのフローサイトメトリーのデータ対世代番号から、ラベル付きおよびラベルなしの母集団の対数比をプロットします。線形領域を特定し、次の式に従って傾きを合わせます。この傾きは、一般的に競合フィットネス18,19として定義されています。 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59652/59652eq3v2.jpg">
</li>
</ol>

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著者であるブランドン・ G ・ウォンとアフマド・ S ・ハリールは、本稿で使用されている eVOLVER プラットフォームを開発する Fynch バイオサイエンス社の共同設立者です。

成長の選択は生物学に不可欠なツールであり、広く細胞集団間の表現型の違いを生成し、特徴付けるために使用されます。バッチ培養は限られた方法で成長の選択を可能にするが、連続培養技術は、これらの実験の制御および予測可能性を劇的に拡大し、選択の形態およびダイナミクスに対して正確な規則を働かせることによって、反復可能、定量結果22.継続的培養は、高多様性ライブラリーの選択を厳密に制御するために使用されています20、23、24、25、および実験に高度な適応レジームを実装するために、導かれた進化11、12、26、27。連続培養により、定量的に制御された条件の配列全体で細胞の正確な特性解析が可能になり、複合遺伝子システムをよりよく理解し、バイオプロダクション株を最適化します9,14,28
しかし、連続培養のための普遍的なプロトコルはなく、選択的条件の微妙な変化が生物学的結果4、29、30に劇的な変化をもたらす可能性がある。実験では、選択レジームを選択し、それに応じて実験プロトコルと装置を適応させる必要があります。制御パラメータ間の選択肢を提供することに加えて、このようなシステムは、理想的には、複雑で相互作用入力を解読するために必要とされる高度に並列実験で複数のパラメータを同時に管理するのに十分な洗練された生物学的システム (例えばエピスタシス)。eVOLVER は、高度に専門化された環境ニッチを指定するために、ユーザが培養条件と流体機能の間で任意のフィードバック制御を可能にすることにより、この課題に対処する。
現在の設定の制限を克服し、制御パラメータを拡張または変更するために、スマートスリーブを簡単に再設計して新しいセンサやアクチュエータを追加することができます。さらに、バイアル量を減らすことはメディアの支出を減少させ、継続的な文化において重要なことがあります。現在の設計では、温度、培養撹拌、光誘導、濁度、および送液の測定と制御が可能ですが、他のパラメータはバイアルからサンプリングすることで外部から測定する必要があります。現在の作業には、ルシフェラーゼを介して酵素活性をモニタリングし、eVOLVER 培養において溶存酸素と pH を直接調節する機能が組み込まれています。さらに、この作業では実証されていないが、eVOLVER は大規模な統合 (電子機器から発生し、マイクロ流体によって採用される) の原理に基づいて、新しい millifluidic 多重化装置16とインターフェースすることができます。安価により複雑な流体処理を可能にします (例えば多重流体入力、バイアルバイアルの転送)。これらの wetware モジュールは実験室で完全に設計され、製造することができ、ユーザーは自動化された流体ルーチンの弁の異なった組合せをプログラムで作動させることによって液体をルーティングすることを許可する。これは、ユーザーが伝統的に連続培養で使用される剛性流体設計を克服することができますが、また、より少ない数の高価な制御要素 (例えば蠕動ポンプ) で高スループットに流体能力をスケーリングする。最後に、我々は、これらの millifluidics と DIY のコンポーネントを利用する autosampling プラットフォームを組み込むことを望んでいます、サンプリング培養が煩雑になるより長い、より大きな実験の間に手動の相互作用の限界を克服します。
プラットフォームの物理的な変更に加えて、web ベースのソフトウェアは、ユーザーがカスタム eVOLVER スクリプトを作成、編集、共有できるようにすることで、新しい自由度を開き、完全に自動化されたフィードバック対応のカルチャプログラム (turbidostat など) を生成します。ユーザーは、同じ選択スキームの微妙なバリエーションのパラメータ範囲をプログラムでスイープしたり、新規の組み合わせで制御アルゴリズムを接続して、任意の数の高度な選択スキームを指定したりできます。さらに、文化をリアルタイムで簡単に監視できることが、実験の進め方を変えています。リアルタイム監視により、ユーザは 1) 実行間の整合性、バイオプロダクションアプリケーションおよびハイスループット実験のための重要な特徴、および 2) 必要に応じて実験中に介入し、発生する困難な菌株のトラブルシューティングを行うことができます。不十分な成長またはバイオフィルム形成、またはユーザのエラー (例えば、汚染) を診断する。最後に、複数のデータストリームが個々の文化ごとにリアルタイムで収集および解釈されることで、eVOLVER はデータの高密度を生成し、新しい下流解析のための機械学習アプローチを容易にします。
フィットネスの特性評価、ライブラリの選択、および実験室の進化のための実証済みの使用を超えて、我々は統合された送液と eVOLVER で実装のために熟したとして関連する分野の数を表示します。マイクロバイオームサンプルを用いた eVOLVER 実験は、制御環境 31, 32 におけるコミュニティの安定性をアッセイし、culturomics 33 技術を使用して微生物叢組成物を探索し、または動的に種を混合する植民地化または侵攻34、35の生態学的ダイナミクスを尋問する。生体分子の連続的な進行方向の進化のための多数の方法は、デバイスにも簡単に実装することができ、26,36,37、これらのシステムのアクセシビリティとスループットが大幅に向上します。動的で高スループットな性質のメディア構成、温度、ひずみなどの成長条件を最適化する機能は、産業 biomanufacturing アプリケーション9の最適化作業に役立ちます。さらに、eVOLVER とフローサイトメトリーのような他の解析技術とともに、クローズドループ方式で垂直統合することをさらに構想し、単一細胞と集団における細胞培養の成長と分析のための完全自動化システムを提供します。レベル。さらに、容器を密封してガスの内容を制御するなどのスマートスリーブにいくつかのハードウェア修正を加えて、eVOLVER は、哺乳動物細胞の懸濁液などのより広い範囲の細胞タイプの成長をサポートするように適合させることができる可能性がある。嫌気性細胞培養のための嫌気性チャンバに全体のフレームワークを配置することも可能です。.今後は、一元化されたクラウド・インフラストラクチャにソフトウェア・フレームワークを構築し、ユーザーが物理的にラボに存在することなく、データをリモートで簡単に構成、分析、共有できるようにすることを目指しています。クラウドインフラストラクチャは、データキュレーターとして機能し、実験全体にわたる大規模なメタ分析にも適しています。EVOLVER と今後の進歩により、継続的な文化の自動化とイノベーションを促進することで、成長の選択実験の範囲を大幅に拡大することが期待されます。

連続細胞培養技術は、最初に約70年前1,2に開発され、最近のリバイバル3,4を楽しんでいます。これは、要因の合流によるものです。まず、大量の遺伝子型5,6を読み出して生成することを可能にした高スループット・オミクス技術の開発により、実験技術の同時需要が生み出され、十分に制御された細胞増殖およびみつかり。この目的のために、連続培養は、創発的なゲノム進化を生かすための力強い実験的アプローチを表している。正確に制御された (および動的な) 環境条件下で細胞集団に対する成長選択/実験を促進することにより、連続培養は、遺伝子型を表現型7,8に厳密にマッピングする手段を提供し、定量的に解析された菌株および生物9を特徴付け、そして実験室進化研究における適応的な遺伝的変化を追跡する10、11、12。
次に、付加製造やオープンソースのハードウェアおよびソフトウェア要素などの、アクセス可能なプロトタイピング技術の最近の登場により、より幅広いユーザーが、独自の費用対効果の高い形態の連続培養システムを設計および構築できるようになりました。実験室で直接。これらのすべては、ケモスタット13、turbidostat14、または morbidostat15のような連続した文化機能を実行する、それ自身 (DIY) デバイスの刺激的な配列につながっています。残念ながら、設計された特定の (ニッチな) 問題に対処することに成功していますが、これらのアドホックソリューションは一般にスループットや実験的設計の複雑さを拡張する能力を欠いています。
EVOLVER システムは連続的な文化の成長の実験の必要性を収容し、創発するゲノム技術の速度そしてスケールに一致できる単一のプラットホームを作成することを目標に設計されていた (図 1a)。eVOLVER の設計では、標準化されたフットプリント、モジュラー・コンポーネント、オープン・ソース設計原則など17の他の専門分野から高度にスケーラブルなテクノロジーの基盤となる共通の教義を実装しています。したがって、新しいニッチなアプリケーションのためのソリューションは、システムに大きな変更を加えることなく設計することができます。高度にモジュラーでオープンソースの wetware、ハードウェア、電子機器、および web ベースのソフトウェアで構成され、eVOLVER は、コスト効率が高く、事実上あらゆるタイプのものを実行するために容易に再構成することができる最初の自動連続培養システムですハイスループット成長実験個々の文化を制御するために必要なすべてのセンサーおよびアクチュエーターを収容するモジュラーおよびプログラマブルなスマートな袖を通して、eVOLVER は独特に文化条件の両方の効率そして個々の制御のスケーリングを可能にする。さらに、web ベースのプラットフォームとして、eVOLVER はデータと情報をリモートコンピュータとリアルタイムで交換し、何百もの個々の文化の同時監視と、任意に定義された制御による自動的な文化の摂動を許可します。アルゴリズム。
前作16において、eVOLVER のロバストな性能は、数百時間の手術での長期実験で実証され、大腸菌とs. セレビシエから飼い馴らされ 微生物。一連の異なる成長選択実験が行われ、プログラム的に定義された多次元選択勾配が個々の培養条件の配列全体に適用されるとともに、結果として得られた細胞フィットネスランドスケープが定量化。ここでの目的は、システムをどのように設計し、これらのタイプの実験を使用するかについての説明を eVOLVER ユーザーに提供することである。例示的な例として、温度および浸透圧ストレスで構成される2次元の環境勾配を横切ってセレビシエ変異体のフィットネスランドスケープを定量化する方法が示されている。このプロトコルは、この実験のための eVOLVER フレームワークをプログラム的に構成することにより、16の平行連続培養のそれぞれに対してカスタマイズされた濁度および温度制御ルーチンを設定するソフトウェアを使用して、物理的に、送液レイアウトを介して、異なる塩濃度の媒体を適切にルーティングする。このプロトコルは、多様な研究と規律のために様々な自動化された連続培養実験を実行する eVOLVER を構成するための一般的なルーブリックとして機能すべきである。

<table><tbody><tr><td>キャップ付き5ガロンプラスチックHedpack</td><td>中西部の醸造とワイン造りの供給品</td><td>45-56Y8-E2FR</td><td>廃棄物収集</td></tr><tr><td>用AD(+)-グルコース</td><td>Chem-Impex</td><td>00805</td><td>YPD中型</td></tr><tr><td>Attune NxTオートサンプラー</td><td>用 サーモフィッシャー</td><td></td>は<td>、フローサイトメーターが96ウェルプレートからサンプルを実行することを可能にします</td></tr><tr><td>Attune NxTフローサイトメーター</td><td>サーモフィッシャー</td><td></td><td>YPD</td></tr>中型<tr><td>カルベニシリン</td><td>フィッシャー科学</td><td>BP2648250</td><td>YPD中</td>型カルベニシリンフィッシャー科学</tr>、1/8インチチューブID、250&deg用、単一細胞蛍光バ<tr><td>クトペプトン</td><td>フィッシャーサイエンティ</td>フィック<td>DF0118-07-0</td><td></td></tr>を介して集団画分を決定するために使用されます<tr><td>。F 最高温度</td><td>McMaster- Carr</td><td>5121K731</td><td>メディア入力分岐用</td></tr><tr><td>クロラムフェニコール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP904-100</td><td>YPD用</td></tr><tr><td>中型 クロロックス 殺菌性漂白剤 8.25</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>50371500</td><td>流体ラインの滅菌用</td></tr><tr><td>カスタムeVOLVERバイアル蓋</td><td>FynchBio</td><td></td><td>蓋には、サンプリングと流体入出力</td></tr><tr><td>用のポートがありますシクロヘキシミド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>ICN10018301</td><td>フローサイトメトリーサンプリングプレート用</td></tr><tr><td>エタノール、無水(組織学的)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>A405P-4</td><td>流体ラインの滅菌用</td></tr><tr><td>eVOLVERユニット</td><td>FynchBio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド 延長長チップ(リフトオフラック; 1 〜 200 ul)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-681-420</td><td>バイアルサンプリング用</td></tr><tr><td>フィッシャーブランドオクタゴンスピンバー磁気攪拌バー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-513-57</td><td>直径:4.5ミリメートル、長さ、12ミリメートル</td></tr>キャップ<tr><td>付きフィッシャーブランド再利用可能なガラスメディアボトル</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>FB8002000</td>チューブを<td>装着する必要があります</td></tr>高温<tr><td>シリコーンゴムチューブセミクリアホワイト、デュロメーター70A、1/8インチID、1/4インチOD</td><td>マクマスターカー51135K73</td><td></td><td>メディアボトルMac用</td></tr><tr><td>ミニ</td><td>アップル</td><td></td><td>実験の実行/データ収集用</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP243820</td>フロー<td>サイトメトリー用サンプリングプレート</td></tr><tr><td>ピペット</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラスチッククイックターンチューブカップリング、プラグ、1/16インチ有刺鉄線チューブID用、ポリプロピレン</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K141</td><td>メディアボトル用</td></tr><tr><td>プラスチッククイックターンチューブカップリング、プラグ、5/32インチ有刺鉄線チューブID用、ポリプロピレン</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K144</td><td>メディアボトル用</td></tr><tr><td>プラスチッククイックターンチューブカップリング、ソケット、1/16インチ有刺鉄線チューブID用、ポリプロピレン</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K291</td><td>メディアボトル用</td></tr><tr><td>プラスチッククイックターンチューブカップリング、ソケット、5/32インチ有刺鉄線チューブID用、ポリプロピレン</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K294</td><td>メディア用ボトルスクリュー</td></tr><tr><td>キャップ、オープントップ、PTFE対応シリコンセプタム、ラボパック、セプタム。ネジ山サイズ:24-400、GREEN</td><td>Chemglass</td><td>CG-4910-04</td><td>培養バイアル</td></tr> 塩化<tr><td>ナトリウム(NaCl)</td><td>Fsher Scientific</td><td>S271-3</td><td>YPD中</td></tr><tr><td>型SpectraMax M5マルチモードマイクロプレートリーダー</td><td>分子デバイス</td><td></td><td>一晩の細胞培養のOD600を測定するため</td></tr><tr><td>バイアルのみ、サンプル、40 mL、透明、28 mm x95 mm、GPI 24-400</td><td>Chemglass</td><td>CG-4902-08</td><td>培養バイアル</td></tr><tr><td>YPD媒体のための</td><td>イーストのエキス</td><td>のフィッシャー科学</td><td>BP1422-500</td></tr></tbody></table>

evolver を用いた自動、高スループット、連続細胞増殖実験の設計

Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER

継続的培養法は、細胞を定量的に制御された環境条件下で増殖することができるため、フィットネスの表現型の測定や、遺伝遺伝子が選択によってどのように形成されるかの理解を向上させるために広く有用である。ニッチな連続培養デバイスの開発と適用のための最近の幅広い取り組みにより、新しい形態の細胞培養制御を行うメリットが明らかになりました。これには、カスタム選択圧力の定義と、長期的な実験的進化からゲノム全体のライブラリー選択、合成遺伝子回路の特性評価までの研究のスループットの向上が含まれます。EVOLVER プラットフォームは最近、高度な拡張性、柔軟性、自動化を備えた連続培養プラットフォームとして、このような需要の増大に対応するために開発されました。eVOLVER は、多くの異なる種類のハイスループットまたは多次元の成長選択実験を実行するための最小限の労力で (再) 構成およびスケーリングできる単一の標準化プラットフォームを提供します。ここでは、カスタムの大規模な連続成長実験を実施するためのシステムを構成するための説明を eVOLVER フレームワークのユーザに提供するためのプロトコルが提示されている。具体的には、このプロトコルは、サッカロミセスセレビシエ変異体のフィットネスランドスケープを定量化するために、多くの eVOLVER バイアルにおいて、2つの選択圧力—温度およびオスモル濃度—をファインにプログラムする方法をユーザーにガイドします。解像 度。このデバイスをプログラム的に、オープンソースの web ベースのソフトウェアを通じて、また物理的に、流体とハードウェアのレイアウトを配置することによって、どのように構成できるかを示します。デバイスの物理的なセットアップ、カルチャールーチンのプログラミング、インターネット上でのリアルタイムでの実験の監視と対話、その後のオフライン分析用のバイアルのサンプリング、実験データ分析のポストなどのプロセスを詳細に説明します。これは、生物学的システムを研究し操作するために、多様な分野の研究者が、独自の複雑で高スループットの細胞増殖実験の設計に eVOLVER を適用するための出発点として役立ちます。

ここで説明したプロトコルは、温度と塩分濃度の2次元応力勾配にわたって、 s. セレビシエの遺伝的変異のためのフィットネスマップを構築するために使用されました。具体的には、各変異株について、eVOLVER を用いて、蛍光標識された参照株 (セレビシエ株 BY4741 と一体化した構成的 mNeonGreen レポーターを有する) に対してペアワイズ競争実験を行い、16種類の異なるこれらの応力の組み合わせ (図 1)。バリアントの場合、応力条件軸の1つに感応すると予測される2つのノックアウト系統が選択されています: 高温でのフィットネス欠陥があると報告しているΔPRX1と高レベルでのフィットネス欠陥がΔPBS2塩濃度21.対照変異体として、標識されていない野生型 BY4741 株を用い、参照株と同様に行うことが期待される。合計では、これらの 3 72 時間の競争実験はすべて単一のコンピュータから実行される3つの eVOLVER (16 バイアル) デバイス間で48バイアルで同時に行われました。
EVOLVER 対話型ダッシュボードは、各実験中に生成される大量のデータをナビゲートするために使用されます (図 2a)。単一の eVOLVER 装置の全16個のバイアルにまたがる代表的な OD トレースを図 2bに示す。各トレースは、turbidostat 制御アルゴリズムから特徴的なノコギリパターンを表示し、OD のフィードバックを使用して希釈濃度をトリガーし、狭い範囲の培養を維持します (この場合は 0.2 ~ 0.3)。OD および温度データは連続的に測定され、クラウド対応データベースにストリーミングし、eVOLVER インタラクティブダッシュボードでリアルタイムで更新します。連続ストリーミングデータから、高次メトリック (例えば成長率、累積世代) を計算し、ダッシュボードにプロットし (図 2c)、異なる選択スキーム (例えば、morbidostat) でフィードバックパラメータとして使用することもできます。
フィットネスマップを生成するために、フローサイトメトリー測定と eVOLVER 成長データの両方を組み込むことにより、参照ひずみがバリアント株に outcompetes 率を測定します。具体的には、母集団画分は、各 timepoint サンプルからのフローサイトメトリーデータを用いた参照株に対する変異株の対数比として計算される。それぞれの培養および時間点について、各希釈期間の eVOLVER 成長率データから世代の経過数が補間される。世代に対する対数比をプロットすると、条件間の定性的な差異が出現し始めます (図 3a)。フィットネスを計算するには、スロープは各プロット18,19の直線部分を通って適合し、バリアント株が参照ひずみに対してどのように競合するかを記述する定量的な適性値 (両方の符号と率を持つ) を生成します (図 3B)。この実験では、負のフィットネス値は、バリアント株が参照株によって outcompeted されていることを示しています。すべてのフィットネス計算からヒートマップを構築することで、2次元のフィットネスランドスケープを可視化し、歪みと条件の間のパフォーマンスの微妙な量的差異を明らかにすることができます (図 3c)。
フィットネスヒートマップから、各バリアント株がさまざまな方法で現れるフィットネス欠陥を示すことがわかります。ΔPRX1は、主に高温に敏感であるが、塩ストレスは、フィットネスの欠陥を増加させ、添加効果を持っているように見えます。逆に、 ΔPBS2は、主に温度軸に沿った最小の差で、高い塩濃度に応答してフィットネス欠陥を示します。これらの結果は、特に、相加的、相乗的、または epistatic 効果を持つことができる複数の環境ストレスの相互作用を解読するための高分解能選択実験の有用性を強調している。
最後に、場合によっては、特に重度のストレス条件では、フィットネス計算が誇張または歪んだ結果につながる可能性があることに注意することが重要です。たとえば、 ΔPBS2は、参照ひずみに対して39° c/1 M NaCl 条件で急な正の傾きを示しているように見えます (図 3a)。これは、野生型データに反映され、この条件では、この特定のメトリックの有用性を制限する両方の株の貧弱な成長に起因する。世代数が不十分な場合、1) 傾斜フィッティングを妨げる timepoints の分離が乏しく、2) ラグ期から発生する確率的効果に対する感度が低下します。我々はこの研究でそうすることを選択しませんでしたが、実験中に eVOLVER によって収集されたリアルタイムの成長データは、実験を拡張し、この条件のために追加の timepoints を収集するという決定を、少しの努力で知らせるために使用することができました。追跡実験では、開始比率を変調して、彩度が発生する前に線形領域の長さを延長することもできます。
 <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59652/59652fig1v3.jpg"> 図 1: eVOLVER フレームワークの概要と実験計画(A) eVOLVER は、培養条件のマルチパラメーター制御を可能にする自動化された連続培養プラットフォームです。プラットフォームは、文化条件を制御するためのセンサとアクチュエータを収容するスマートスリーブ、メディアを流すための蠕動ポンプアレイ、および培養物の中および外での廃棄、デバイスとの手動操作用タッチスクリーン、およびコンピュータから構成されていますプラットフォームからのデータがストリーミングされるクラウドインフラストラクチャとの対話に使用されます。(B) eVOLVER は、複数の方法で設定することができます: 物理的に, セルとメディアの入力を介して, プログラムによって、スマートスリーブの培養バイアルモジュールを制御するアルゴリズムを調整することによって.これは、定義した時点で物理的に収集されたセルと培養データのリアルタイムストリーミングで構成される出力を用いて、多次元選択/環境勾配を高解像度でプログラムするために利用することができる。(C) 温度と浸透圧で構成された2次元の選択勾配を横切って成長適性実験を行うために eVOLVER を構成する。eVOLVER 培養バイアルは、基準および変異酵母株の等しい割合で播種された。Turbidostat ルーチンは、定義された OD ウィンドウ (OD 0.2-0.3) の指数フェーズですべてのカルチャを維持するようにプログラムしました。温度とメディアの条件は、スマートスリーブの配列全体にわたって変化し、2つの独立した応力勾配を形成しました。ベース培地は、細菌汚染に対する予防措置として、YPD (2% グルコース) + 100 μ g/mL カルベニシリン + 25 μ g/mL クロラムフェニコールで構成された。媒体の組成物は、補足 NaCl を 0 M、0.6 M、0.8 M、または 1.0 M に添加することによって変化させた。ガラスの温度は、30° c、35° c、37° c、または39° c の4つの値のいずれかにプログラムされました。(D) 3 つの試験状態からの培養 OD および母集団フラクションに対する生出力の例。競技実験は 72 h で維持し, 24 時間でサンプリングし, その後12時間ごとに実験を終了する。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59652/59652fig1v3large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59652/59652fig2.jpg"> 図 2: eVOLVER リアルタイムデータ分析ダッシュボード。(A) eVOLVER データは、クラウドベースのソフトウェアを介してインタラクティブなダッシュボードにリアルタイムで処理およびストリーミングされます。ダッシュボードを通じて、ユーザーは、接続された eVOLVER に独自の培養ルーチンを定義して開始し、すべての eVOLVER ユニットで現在実行中の実験を監視し、必要に応じて個々のバイアルまたはバイアルのセットに実験条件を手動で変更することができます。(B) 実験期間全体について試験された条件のマトリックスを横切る各バイアルの OD トレース。トレースはリアルタイムで見ることができ、実験が望ましいように実行されていることを確認し、さらなる分析のために実験後に使用されます。(C) 成長率および細胞の生成は実験の進歩を追跡するためにその場の OD の跡から計算することができる。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59652/59652fig2large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59652/59652fig3.jpg"> 図 3:フィットネス面の構築。(A) 細胞集団画分は、細胞生成に対してプロットされた自然対数 (変異株/参照株) である。色は選択温度を示し、破線は塩濃度を区別する。(B) 参照株に対する変異体の相対的適合性を定量化するために、フィットネス指標は、細胞集団画分が世代を超えて変化する速度に由来する。この指標は、最小3点を使用して、細胞画分プロットの線形領域から計算されます。(C) 相対フィットネスメトリックは、環境ストレス勾配の上にフィットネスサーフェスを構築するためにヒートマップに表示されます。野生型およびΔPBS2の右上隅の状態 (39 ° c/1.0 M NaCl) は、培養が不十分な世代を通過したため、この解析には含まれません (代表結果を参照)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59652/59652fig3large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

EVOLVER フレームワークは、高い分解能と実験パラメータの動的制御により、高スループットの連続微生物培養を可能にします。このプロトコルは、複雑なフィットネス実験を実行するためにシステムを適用する方法を示し、多くの個々の文化に対して自動制御をプログラミングすること、測定、収集、および実験データをリアルタイムで操作することをユーザーに案内します。

EVOLVER を用いた自動、高スループット、連続細胞増殖実験の設計

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring ...

eVOLVERは、研究者に実験的な自由を与え、複数のパラメータに対する自動フィードバックを用いて独自の培養成長実験を定義し、必要なサイズに拡張することができます。eVOLVER は他のデバイスよりも柔軟性があります。ユーザーは、各カルチャのセンサーを保持するスマート スリーブを変更することで、Python のソフトウェアとハードウェアを簡単にカスタマイズできます。システムは、一見複数のコンポーネントと接続で複雑に見える可能性があります。ビジュアルガイドは、初めてのユーザーが自分で実験を実行することに自信を与えます。適切なセットアップが重要です。各コンポーネントの動作を理解してください。したがって、彼らが動作していることを確認することができます。すべてが正しくルーティングされ、しっかりと接続されていることを確認します。様々な条件で細菌や酵母の好気培養のために設計されている間, eVOLVERはまた、嫌気性発酵のために、または懸濁中の哺乳類細胞を維持するために変更することができます.このビデオでは、eVOLVER プラットフォームを使用して、高スループット連続カルチャ実験をセットアップ、初期化、実行する方法を説明します。実験の前日に、原稿に従ってメディア、バイアル、接種を準備します。3つの大きなビーカーで、10%漂白剤のビーカーを2つと70%エタノールのビーカーを1つずつ調製します。eVOLVERデバイスのスイッチを使用して、eVOLVERの5ボルト電源をオンにして5秒間待ってから、12ボルトの電源をオンにします。同じメディア・ボトルから複数のバイアルを実行している場合は、複数のメディア入力ラインをチューブスプリッターで接続します。カスタムチューブスプリッターは、より低いコンポーネントで構築することができます。第1漂白剤ビーカーのメディア入力ラインと、2番目の漂白ビーカーのメディア流れ線を水没させる。メディア入力ラインの下流端を、2 番目のビーカーにエフラックスラインで接続します。廃棄物のカーボイに廃棄物ラインを配置します。実験中に発生した廃棄物を殺菌するために、廃棄物のカーボイに漂白剤の1〜2リットルを追加します。eVOLVER のタッチスクリーンを使用して、セットアップ セクションに移動し、すべてのポンプを 20 秒間実行して、流体ラインを 10%漂白剤で満たします。漂白剤を少なくとも30分間ラインに座って殺菌します。ラインが水没しなくなるまでタッチスクリーンを使用して再びポンプを実行し、ラインを通して空気を押し抜いてできるだけ多くの漂白剤を取り出します。エタノールビーカーにメディア入力ラインを入れ、エタノールでラインを満たし、空気でそれらを洗い流します。次に、メディア入力ラインを下のコネクタでメディアボトルに取り付け、残留エタノールをフラッシュするラインを完全にメディアが通過するまでポンプを実行します。部分的にeVOLVERスマートスリーブに殺菌されたバイアルを挿入し、色分けに従って短い流入わらと廃棄物ラインに入力ラインをフックアップ。eVOLVERタッチスクリーンを調整して、バイアルをメディアで満たすために10秒単位ですべてのポンプを実行します。目視検査により、流出ポンプは流出を防ぐために、流出ストローを通して媒体を効率的に除去します。その後、バイアルをスマートスリーブに完全に包むまで押し下げろ。eVOLVERタッチスクリーンインタラクティブセットアップページで、タッチスクリーンを横切って指をドラッグするか、[すべて選択]ボタンを押してバイアルをすべて選択し、温度の初期条件を摂氏30度に設定し、攪拌を10度に設定します。コンピューターで、実験を実行する eVOLVER デバイスを指定します。必要なキャリブレーション設定が選択されていることを確認します。eVOLVER ダッシュボードを開き、[実験マネージャー] ページに移動します。実験ナビゲータパネルでベース実験を選択するか、既存の実験を開始点として選択し、「クローン」をクリックします。[実験エディター] ページに移動します。バイアルセレクターとパラメータ定義パネルを使用して温度を摂氏30度に調整し、実験計画に従って各バイアルのODの上下の閾値を設定します。[保存] をクリックして、実験を保存します。次に、矢印をクリックして実験マネージャページに戻り、[再生]ボタンをクリックして実行します。実験が進行したら、インタラクティブダッシュボードのリアルタイムデータパネルに移動します。各バイアルについて、OD 値がゼロに保持されていることを確認します。温度グラフを参照して、温度が摂氏 30 度に達しているか、または 30°C に向かって進行していることを確認します。接種を調製するために、まず一晩培養物のODを測定し、25ミリリットルのバイアル量と約0.05の所望の開始ODを仮定して、一晩培養のための所望の完全希釈を計算する。サンプリングポートを介して、接種物またはイノキュラの混合物の計算された体積をピペット。ダッシュボードのグラフをチェックして、OD が 0.05 に増加していることを確認します。細胞の成長とバイアルの状態は、実験が進行中である間、リアルタイムで監視することができ、研究者は何らかの問題が発生した場合に介入することができます。eVOLVER は、培養条件の複数パラメータ制御を可能にする自動化された連続培養プラットフォームです。eVOLVER成長率データから補間された世代に対して対数比をプロットした場合、野生型、温度感受性、塩感受性基の間に定性的な違いが示された。色は選択温度を示し、ダッシュは塩濃度を区別します。傾斜角は、最低 3 点を使用して各プロットの線形部分を通してフィットし、バリアント歪みが参照歪みと競合する方法を記述する定量的適合値を生成します。負のフィットネス値は、バリアント歪が参照歪みによって競合していることを示します。すべてのポンプが効率的に動作していること、および流体ラインが下駄を取り除かっていることを常に確認してください。オーバーフローは実験を台無しにし、スマートスリーブを損傷する可能性があります。eVOLVERから採取したサンプルは、実験の結果としてゲノム変化をチェックするために、その後の順序付けが可能です。この情報は、新しい系統やシステムの設計に使用できます。ラボの進化やライブラリの選択を使用する研究者にとっては、各eVOLVER実験で独自の選択圧力を適用することは容易です。フィードバック制御と動的環境も非常にアクセス可能になりました。廃棄物のカーボイは、実験後に少量の漂白剤とエタノールを含みます。廃棄物の適切な処理については、ラボの安全コーディネーターに相談してください。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

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ファージおよびロボット工学支援による近連続進化(PRANCE)は、迅速で頑健なタンパク質進化のための技術です。ロボティクスは、実験の並列化、リアルタイムモニタリング、フィードバック制御を可能にします。...

ファージとロボット工学によるほぼ連続的な進化の実践ガイド

ここでは、低コストでエネルギー効率の高いベンチトップサーモミキサーをインキュベーターとして利用し、好熱菌に適応するための実験的進化プロトコルを紹介します。この技術は、最適な成長温度が75°Cの古細菌である Sulfolobus...

生命の極限状態での適応:極限環境微生物アーキオンSulfolobus acidocaldariusによる実験的進化

このプロトコルは、自動化支援による遺伝子ライブラリの生成と評価を通じて、遺伝的にコードされたバイオセンサーの体系的なグローバル最適化のための方法を提供します。これは、実験を合理化し、特定の設計結果に合わせてバイオセンサーを調整するための遺伝的成分の選択を可能にする実験計画法と組み合わされます。...

実験計画法と自動化ワークフローで実現された遺伝子コード化されたバイオセンサー設計空間の効率的なサンプリング

学ぶeVOLVERを用いた自動連続培養システムの構築と運用方法。リアルタイムモニタリングと多パラメータ制御により、微生物の適応進化実験を効率的に実施できます。

EVOLVER を用いた自動、高スループット、連続細胞増殖実験の設計

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