Name: LC-MS/MS 診断フラグメンテーションによる自然な製品の発見: ミクロシスチン分析のためのアプリケーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 学ぶLC-MS/MS診断フラグメンテーションによる自然物質発見法。MZmineを用いて複雑な混合物から構造的に関連する新規化合物や毒素を検出し、食品安全と環境評価に貢献します。

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著者たちは、Roshon (カナダ林内藻類相文化センター、ウォータールー大学で、研究しているシアノバクテリアの文化を提供し、Sawsan Abusharkh (カールトン大学) の技術支援に感謝した。

1. 非標的液体クロマトグラフィー (LC)-MS/MS データセットの作成
注: DFF は、高分解能質量分析計を使用し、対象クラスの検体に最適化された分析方法で実行できます。MC Orbitrap 質量分析計での LC-MS/MS 条件を材料表に記載しています。
<ol><li>
ダウンロード MZmine 2(http://mzmine.github.io/) 注: サンプルデータ CPCC300 は https://drive.google.com/open?id=1HHbLdvxCMycSasyNXPRqIe5pkaSqQoS0 で見つけることができます。<ol>
<li>Raw データメソッドドロップダウンメニューで、 raw データインポートオプションを選択します。</li>
		<li>分析するデータファイルを選択します。1つまたは複数のファイルをインポートできます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>オプションMZmine でベンダーデータフォーマットがサポートされていない場合は、Proteowizard16を使用して centroided mzml データファイルを生成します。<ol>
<li>ベンダー提供の centroiding アルゴリズムを適用するには、ピークピッキングフィルターを選択します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. インポートされた DDA ファイルの診断断片化のフィルタリング
<ol><li>カーソルを使用して、メイン MZmine 画面のRaw データファイル列のデータファイルを選択して強調表示します。</li>
	<li>[ビジュアライゼーションのドロップダウン] メニューで、[診断フラグメンテーションのフィルタリング] オプションを選択します。</li>
	<li>表示される DFF ダイアログボックス (図 3) で、次のオプションを入力します。<ol>
<li>保持時間:自動範囲を使用するか、対象の検体が溶出する数分で保持時間の範囲を定義します。</li>
		<li>
前駆体m/z -オートレンジを使用するか、または適切な場合に複数の荷電化合物の可能性を含め、検体の対象クラスのm/z範囲を定義します。</li>
		<li>
m/z公差-MSinstrument の達成可能な MS/ms 質量精度を入力します。0.01 m/z または 3.0 ppm は、Orbitrap プラットフォームに適しています。診断製品イオンのみが調査される場合、入力0.0は診断ニュートラル損失値 (Da)オプションになります。逆に、診断的なニュートラル損失のみが調査される場合、入力0.0は診断製品のイオン (m/z)オプションになります。</li>
		<li>
診断製品イオン (m/z) –クラス固有の製品イオン (s) m/zを入力します。複数の製品イオンをコンマで区切ってください。 注: 複数の製品イオンを入力すると、記載されているすべての製品イオンを含むスペクトルが可視化されます。</li>
		<li>
診断ニュートラル損失値 (Da) –クラス固有のニュートラル損失 (es) を入力します。複数のニュートラル損失をカンマで区切ります。 注: 複数のニュートラル損失を入力すると、リストにあるすべてのニュートラル損失を含むスペクトルが視覚化されます。診断製品のイオンと中性の損失の両方を入力すると、すべての基準を満たすスペクトルが可視化されます。</li>
		<li>
最小診断イオン強度 (% ベースピーク) – MS/ms スペクトルのベースピークの% として、診断生成物のイオンおよび/または中性損失に対する最小強度を考慮することを規定する。</li>
		<li>
Peaklist 出力ファイル-結果を出力するためのパスとファイル名を選択します。</li>
		<li>[ OK ] ボタンをクリックして、DFF 解析を開始します。上記の手順を正常に完了すると、DFF プロットが表示されます 注: 2 つの .csv データファイルが生成されます。{Peaklist 出力ファイル}. csvには、スキャンの前駆体m/z、スキャン番号、保持時間が含まれています。これは、 生データ方式 > ピーク検出 > 目標ピーク検出などの既存の MZmine モジュールで使用して、定義された DFF 基準を満たす前駆体の抽出イオンクロマトグラムを生成することができます。{Peaklist 出力ファイル} _dataには、前駆体m/z、製品イオンm/z 、保持時間が含まれており、MZmine の外側に DFF プロットを生成することができます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ミクロシスチン分析に DFF の使用例
<ol><li>
サンプル調製
	<ol>
<li>滅菌 MA 培地17またはその他のシアノバクテリアの成長培地 (BG-11) の三角を含む 250 mL の滅菌フラスコを、発泡ストッパーを装着して殺菌する。</li>
		<li>無菌状態の下で約5× 105細胞の mL-1に、シアノバクテリアの培養で滅菌された成長培地を接種する。血球計数器でセル密度を監視します。この例では、CPCC300 photoautotrophically 27 ° c で、12 h の光を使用して、涼しい白色の蛍光灯 (30μE M-2 s-1) で照らされています。 12 h 暗レジーム1日1回、旋回します。</li>
		<li>47 mm 径 GF/C ガラスマイクロファイバーフィルターペーパーを使用して、真空濾過によって26日後に培養培地から細胞を分離します。</li>
		<li>14 mL 試験管で採取した細胞に 80% メタノール(aq) 3 ml を加えます。</li>
		<li>渦とその後超音波処理は、それぞれ 30 s のシアノバクテリア細胞を含む試験管 (s) を測定します。試験管を-20 ° c で1時間保管します。試験管を室温に戻し、サンプルを15分間解凍します。</li>
		<li>セルを効果的に溶解するために、さらに2回3.1.5 手順を繰り返します。</li>
		<li>得られたシアノバクテリア細胞抽出物を0.22 μ m PTFE シリンジフィルター (s) を通して濾過する。</li>
		<li>穏やかな窒素ガスの流れを使用して、30° c の温度で蒸発器を有する乾燥エキス (s)。抽出液を-20 ° c の状態で LC-MS/MS 分析まで保存します。</li>
		<li>乾燥した残渣を500μ l の 90% メタノール(aq)で再構成し、分析前にアンバー HPLC バイアルで30秒間渦流する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>高分解能質量分析計における DDA の取得方法を用いて、シアノバクテリアの抽出物を分析します。 注: ここで使用する MC 分析のために最適化された LC-MS 条件は、「材料表」に記載しています。</li>
	<li>DDA の MZmine を準備し、次のステップ1.1 および1.2 にインポートします。</li>
	<li>データファイルを選択し、手順2.1 から2.2 に従って DFF モジュールを開始してください。</li>
	<li>MC 解析では、DFF モジュール内の以下の設定を使用します (図 3)。<ol>
<li>
保持時間– 2.00の範囲を6.00分に入力します。</li>
		<li>
前駆体m/z - 430.00のm/z範囲を1200.00に入力します。</li>
		<li>
m/z公差- 0.01 m/z または3.0 ppm のm/z 公差を適用します。</li>
		<li>
診断製品イオン (m/z) –診断製品のイオンとしての135.0803、163.1114の入力m/z </li>
		<li>
診断中立損失値 (Da) –診断中立損失が使用されていないことを定義するための入力0.0 。</li>
		<li>
最小診断イオン強度 (% ベースピーク) –最小強度閾値として15.00を使用</li>
		<li>
Peaklist 出力ファイル-出力ファイルをputative_MCsとして定義します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>[ OK ] ボタンをクリックして、DFF 解析を開始します。上記の手順を正常に完了すると、DFF プロット (図 4) が表示されます</li>
</ol>

<ol><li>Mayer, P. M., Poon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanisms+of+collisional+activation+of+ions+in+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">The mechanisms of collisional activation of ions in mass spectrometry.</a> Mass Spectrometry Reviews. 28 (4), 608-639 (2009).</li>
<li>Fisch, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+natural+products+by+microbial+iterative+hybrid+PKS%E2%80%93NRPS%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of natural products by microbial iterative hybrid PKS–NRPS.</a> RSC Advances. 3 (40), 18228-18247 (2013).</li>
<li>Kelman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+six+new+Alternaria+sulfoconjugated+metabolites+by+high-resolution+neutral+loss+filtering%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Identification of six new Alternaria sulfoconjugated metabolites by high-resolution neutral loss filtering.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (19), 1805-1810 (2015).</li>
<li>Renaud, J. B., Kelman, M. J., Qi, T. F., Seifert, K. A., Sumarah, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product+ion+filtering+with+rapid+polarity+switching+for+the+detection+of+all+fumonisins+and+AAL-toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Product ion filtering with rapid polarity switching for the detection of all fumonisins and AAL-toxins.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (22), 2131-2139 (2015).</li>
<li>Renaud, J. B., Kelman, M. J., McMullin, D. R., Yeung, K. K. -C., Sumarah, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+C8+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+enniatins+and+bassianolides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Application of C8 liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the analysis of enniatins and bassianolides.</a> Journal of Chromatography A. 1508, 65-72 (2017).</li>
<li>Walsh, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+Fragmentation+Filtering+for+the+Discovery+of+New+Chaetoglobosins+and+Cytochalasins%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Diagnostic Fragmentation Filtering for the Discovery of New Chaetoglobosins and Cytochalasins.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. , (2018).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sharing+and+community+curation+of+mass+spectrometry+data+with+Global+Natural+Products+Social+Molecular+Networking%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking.</a> Nature biotechnology. 34 (8), 828(2016).</li>
<li>Bartók, T., Szécsi, Á, Szekeres, A., Mesterházy, Á, Bartók, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+new+fumonisin+mycotoxins+and+fumonisin-like+compounds+by+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography%2Felectrospray+ionization+ion+trap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%3A+An+International+Journal+Devoted+to+the+Rapid+Dissemination+of+Up-to-the-Minute+Research+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Detection of new fumonisin mycotoxins and fumonisin-like compounds by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization ion trap mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry: An International Journal Devoted to the Rapid Dissemination of Up-to-the-Minute Research in Mass Spectrometry. 20 (16), 2447-2462 (2006).</li>
<li>Bartók, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+characterization+of+twenty-eight+isomers+of+fumonisin+B1+%28FB1%29+mycotoxin+in+a+solid+rice+culture+infected+with+Fusarium+verticillioides+by+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography%2Felectrospray+ionization+time-of-flight+and+ion+trap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Detection and characterization of twenty-eight isomers of fumonisin B1 (FB1) mycotoxin in a solid rice culture infected with Fusarium verticillioides by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight and ion trap mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (1), 35-42 (2010).</li>
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</ol>

著者は何も開示することはありません

DFF は、化合物のクラス全体を検出するための簡単で迅速な戦略で、特に天然物の化合物の発見に関連しています。DFF の最も重要な側面は、対象となる化合物クラスの特定の MS/MS フラグメンテーションの基準を定義することです。この代表例では、DFF は、 m. 膿菌細胞抽出物中に存在する MCs を含むすべての Adda 残基を検出するために使用した。MCs の大半は Adda 残留物を含んでいるが、この位置にある他の残基は知られているが、特にデメチル-および acetyldemethyl-Adda 変異体19である。これらの残基を持つ MCs は、定義された基準を使用して検出されません。ただし、DFF は取得後のアプローチであるため、ここで概説されている簡単なステップバイステッププロトコルを使用して、同じデータセットで追加の診断フラグメントを簡単に調査できます。また、これにより、診断製品のイオンおよび/または中性損失を変化させる架空の修飾を含む化合物を検出することができます。
付加およびソース断片はまた、DFF 基...

タンデム質量分析法 (MS/MS) は、前駆体イオンを単離し、衝突誘導解離 (CID) のような活性化エネルギーの適用を介して断片化を誘導することを含む、広く使用されている質量分析方法です。イオンフラグメントがその分子構造と密接に結びついている方法。天然物は、多くの場合、単一のユニークな化学物質2としてではなく、構造的に類似した化合物の混合物として生合成。そのため、同じ生合成クラスの一部である構造的に関連する化合物は、共通の製品イオンおよび/または中性損失を含む重要な MS/MS フラグメンテーション特性を共有することが多い。クラス固有の製品イオンおよび/または中性損失を有する化合物のための複雑なサンプルをスクリーニングする能力は、化合物のクラス全体を検出する強力な戦略であり、潜在的に新しい天然産物の発見につながる3、4,5,6.何十年もの間、低分解能の測定器で実行される中性損失スキャンや前駆体イオンスキャニングなどの質量分析法により、同じ中性損失または製品イオンによるイオンの検出が可能になりました。しかし、実験を行う前に特定のイオンまたは遷移を定義する必要があった。研究室では高分解能の質量分析計が普及しているため、複雑なサンプルは、対象外のデータ依存型集録 (DDA) メソッドを使用して一般的に選別されています。従来の中性損失および前駆体イオン走査とは対照的に、構造的に関連する化合物は、捕捉後分析7によって同定することができる。本研究では、複雑な行列内の化合物の全クラスを検出するための、診断断片化フィルタリング (DFF)5,6と呼ばれる、簡単でわかりやすい方法を開発した戦略を示します。この DFF モジュールは、オープンソースの MZmine 2 プラットフォームに実装されており、MZmine 2.38 またはそれ以降のリリースをダウンロードすることで利用できます。DFF により、ユーザーは、化合物のクラス全体の診断である製品イオン (複数可) および/または中性損失 (es) を含む MS/MS スペクトルの DDA データセットを効率的にスクリーニングすることができます。DFF の制限は、化合物のクラスのための特徴的な製品イオンおよび/または中性損失がアナリストによって定義されなければならない。
例えば、60以上の異なるフモニシンマイコトキシンのそれぞれが8、9が tricarballylic 側鎖を有していることを識別し、その上にm/z 157.0142 (C6H5-5-) 積イオンを発生する[M-H]-イオン4の断片化。したがって、サンプル中のすべての推定 fumonisins は、著名なm/z 157.0142 製品イオンを含む DDA データセット内のすべての MS/ms スペクトルをスクリーニングすることにより、DFF を使用して検出することができます。同様に、硫酸化化合物は、79.9574 Da (SO3)3の診断中立損失を含む ms/MS スペクトルのための DDA データセットをスクリーニングすることによって検出することができる。このアプローチは、新しい環状ペプチド5およびトリプトファンまたはフェニルアラニン残基6を含む天然産物の検出にも首尾よく適用されている。
MZmine プラットフォーム10内での DFF の有効性とその使いやすさを実証するために、ミクロシスチン (MCs) の分析にこのアプローチを適用しました。淡水シアノバクテリア11、12、13によって生成された240以上の構造的に関連する毒素のクラス。
最も一般的に報告されるシアノトキシンは MCs であり、MC-LR (ロイシン [L]/arginine [R]) コンジナー最もよく研究されている (図 1)。MCs は、効果非リボソーム heptapeptides、 Microcystis、アナベナ、ネンジュモ属、およびPlanktothrix12,13を含む複数のシアノバクテリア属によって生合成。MCs は、L-アミノ酸によって占められている5つの共通残基と二つの可変位置からなる。ほぼ全ての Mc は、位置 511に特徴的なβ-アミノ酸 3-アミノ-9-メトキシ-2, 6, 8-トリメチル-10-phenyldeca-4, 6-dienoic 酸 (Adda) 残基を有する。 MCs の ms/ms フラグメンテーション経路はよく説明されています14,15;Adda 残基は、著名な ms/ms 製品イオン、 m/z 135.0803+ (c9H11O+) だけでなく、 m/z 163.1114+ (c11h 15 を含む他の製品のイオンを担当していますO+) (図 2)。Microcystis 膿菌の非標的 DDA データセット細胞抽出物は、これらの診断イオンを使用して存在するすべてのミクロシスチンについてスクリーニングすることができ、ミクロシスチンは Adda 残基を有することが認められる。

<table><tbody><tr><td>シアノバクテリア<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>em>Microcystis aeruginosaCPCC300</td><td>CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE</td><td></td><td>CPCC300</td></tr> <tr><td>https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/Software</strong</td>><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteowizard (software)</td><td></td><td>software</td><td>http://proteowizard.sourceforge.net/</td></tr> <tr><td>Mzmine 2</td><td></td><td>ソフトウェア</td><td>http://mzmine.github.io/</td></tr><tr><td>LC-MS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-Exactive Orbitrap</td><td>サーモ</td><td></td><td>-HESI イオン源搭載</td></tr><tr><td>1290 UHPLC</td><td>Agilent</td><td></td><td>バイナリポンプ、オートサンプラー、カラムコンパートメント</td></tr><tr><td>C18 カラム</td><td>搭載Agilent</td><td>959757-902</td><td>Eclipse Plus C18 RRHD カラム (2.1 &times; 100 mm, 1.8 &mu;m)</td></tr><tr><td>Solvents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima LC-MS グレード メタ</td><td>ノールフィッシャー</td><td>A456-4</td><td></td></tr><tr><td>OptimaLC-MS グレード アセトニトリル</td><td>フィッシャー</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>OptimaLC-MS グレード ウォーター</td><td>フィッシャー</td><td>W6-4</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS グレード ギ酸</td><td>フィッシャー</td><td>A11710X1-AMP</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>サイエンティフィック・インダストリーズ</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機 ソルバル・マイクロ 21</td><td>サーモ・サイエンティフィック</td><td>75-772-436</td><td></td></tr><tr><td>Other</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amber HPLC vials 2 mL/caps</td><td>Agilent</td><td>5182-0716/5182-0717</td><td></td></tr><tr><td>0.2-&mu;m PTFEシリンジフィルター</td><td>ポール株式会社</td><td>4521</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 47mm GF/A ガラス マイクロファイバー フィルター</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA1820047</td><td></td></tr><tr><td>Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MA メディア (pH 8.6) (量 / L)</td><td></td><td></td><td>Watanabe, M. F. &大石 S. 培養条件下でのシアノバクテリア (Microcystis aeruginosa) の毒性に対する環境要因の影響.応用微生物学および環境微生物学。49(5)、1342-1344(1985)。</td></tr><tr><td>Ca(NO3)&middot;4H2O、50mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2786</td><td></td></tr><tr><td>KNO3、100 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8291</td><td></td></tr><tr><td>NaNO3、50 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5022</td><td></td></tr><tr><td>Na2SO4、40 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5640</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot;6H20、50 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>グリセロリン酸ナトリウム、100 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>H3BO3、20 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Bicine、500 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES1151B-B7</td><td></td></tr><tr><td></td><td>P(IV) 金属溶液、5 mL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaEDTA&middot;2HO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6635</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3 &middot;6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>236489</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2&middot;4H2O</td><td>Baker</td><td>2540</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z0152</td><td></td></tr><tr><td>CoCl2&middot;6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8661</td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4&middot;2H2O</td><td>Baker</td><td>3764</td><td></td></tr><tr><td>シアノバクテリア BG-11 50X 淡水溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3061-500mL</td><td></td></tr></tbody></table>

lc-ms/ms 診断フラグメンテーションによる自然な製品の発見: ミクロシスチン分析のためのアプリケーション

Natural Product Discovery with LC-MS/MS Diagnostic Fragmentation Filtering: Application for Microcystin Analysis

天然物は、多くの場合、単一の化合物ではなく、構造的に類似した化合物の混合物として生合成。共通の構造的特徴のために、同じクラス内の多くの化合物は、同様の MS/MS 断片化を受け、いくつかの同一の製品イオンおよび/または中性損失を有する。診断フラグメンテーションフィルタリング (DFF) の目的は、クラス固有の製品イオンおよび/または中性損失を含む MS/MS スペクトルの非ターゲット LC-ms/MS データセットをスクリーニングすることにより、複雑な抽出で特定のクラスのすべての化合物を効率的に検出することです。この方法は、四重極 Orbitrap または四重極のタイムオブフライト質量などの高分解能質量分析計でのデータ依存型集録によって分析されるサンプル抽出を必要とするオープンソース MZmine プラットフォーム内に実装した DFF モジュールに基づいています。アナライザー。このアプローチの主な制限は、アナリストは、天然物の対象となるクラスに固有の製品のイオンおよび/またはニュートラルな損失を最初に定義する必要があります。DFF は、新しい化合物を含む複雑なサンプル内のすべての関連する天然物のその後の発見を可能にします。本研究では、藍藻の原因となるMicrocystis 膿菌の抽出物を、ミクロシスチンの産生に対してスクリーニングすることにより、DFF の有効性を実証する。

CPCC300 の分析に従って生成された DFF プロットを図 4に示します。このプロットのx軸は、定義された DFF 基準を満たした前駆体イオンのm/zであり、 y軸は MCs MS/MS スペクトル内の全製品イオンのm/zを示しています。この分析では、MC 検出のための基準には、440-1200 のm/z範囲内の前駆体イオンが含まれ、保存時間は2.00 〜6.00 分であった。最も重要なこととして、これらの MS/MS スペクトルには、定義された 15% の basepeak 強度閾値を超えるm/z 135.0803 と 163.1114 (± 3 ppm) の両方が含まれています。これらの条件下で、LC-MS/MS DDA の分析中に合計4116の MS/MS スペクトルが取得されました。それらのうち、DFF 基準を満足した26個のスペクトルが、CPCC300 抽出...

MZmine に実装された診断フラグメンテーションフィルタリングは、既知および未知の天然製品のクラス全体について、LC-MS/MS データセットをスクリーニングするための、エレガントで取得後のアプローチです。このツールは、分析者が化合物クラス全体の診断として定義した製品イオンおよび/または中性損失の MS/MS スペクトルを検索します。

LC-MS/MS 診断フラグメンテーションによる自然な製品の発見: ミクロシスチン分析のためのアプリケーション

Natural products are often biosynthesized as mixtures of structurally similar compounds, rather than a single compound. Due to their common structural ...

天然物は、多くの場合、化合物のクラスとして生合成され、単一の製品としてではありません。診断フラグメンテーション フィルタリングは、複雑な混合物内のすべての構造的に関連する化合物を検出するための簡単なアプローチです。MZmineソフトウェア内で実装された診断断片化フィルタリングにより、アナリストは、見逃される可能性のある新しい天然物の質量分析データセットを探索することができます。これには、新しいバイオ製品、および新しい毒素が含まれます。食物および水を汚染する毒素クラスに適用される診断断片化フィルタリングは、暴露評価を知らせることができる。微生物や植物抽出物に適用すると、新しい化合物の発見につながる可能性があります。診断フラグメント化フィルタリングを使用するには、化学クラスを定義する主要なタンデム質量分析機能を理解する必要があります。これは、構造的に類似した化合物が特徴的なイオンを生成することを意味します。私の名前はショーン・フーグストラです。私は私たちのセンターで研究技術者とソフトウェア開発者であり、私は手順をデモンストレーションします。ミクロシスチン分析用の試料を調製するために、無菌シアノバクテリア増殖培地の30ミリリットルを1ミリリットル当たり約5倍の10〜5番目の細胞に接種し、無菌状態下、250ミリリットルのエルレンマイヤーフラスコで、血球計で細胞密度をモニタリングする。26日間の光オートトローフ培養後、12時間のライトダークレジームを摂氏27度で用いたクールホワイト蛍光灯で照らし、1日1回旋回し、直径47ミリリットルのGF/Cガラスマイクロファイバーフィルターペーパーを使用して、真空濾過によって細胞を培地から分離する。14ミリリットルの試験管で収穫された細胞に80%メタノールの3ミリリットルを加え、渦を加え、その後30秒間各管を超音波処理します。超音波処理の後、3つの連続した1時間、マイナス20°C凍結、および15分間の室温融解サイクルでサンプルを分解し、個々の0.22マイクロメートルポリテトラフルオロエチレンシリンフィルターを介して各得られるシアノバクテリア細胞抽出物を濾過します。窒素ガスの穏やかな流れを使用して、30°Cでエバポレーターで抽出物を乾燥させ、マイナス20度で乾燥した抽出物を保存します。液体クロマトグラフィータンデム質量分析の場合、分析する乾燥残渣を90%メタノールの500マイクロリットルで再構成し、30秒間ボルテックスサンプルを再生する。琥珀色の高圧液体クロマトグラフィーバイアルに移します。次に、標準的なプロトコルに従って、高分解能質量分析計でデータ依存的な取得方法を用いてシアノバクテリア抽出物を分析します。ほとんどのマイクロシスチンは、タンデム質量分析、MからZ 135.0803、および163.1114の2つの診断産物イオンを生成するATA残基を含んでいます。非ターゲット液体クロマトグラフィータンデム質量分析データセットの準備の場合は、MZmine 2を開き、未処理データメソッドの下の「生データインポート」を選択します。.ドロップダウンメニュー。次に、マイクロシスチン分析からデータ ファイルを選択し、ピーク ピッキング フィルターを選択して、ベンダー提供の送心アルゴリズムを適用します。インポートされたデータ依存取得ファイルの診断フラグメンテーション フィルタリング(DFF)の場合は、カーソルを使用してデータ ファイルを強調表示し、[視覚化] ドロップダウン メニューを開いて DFF オプションを選択します。表示される DFF ダイアログ ボックスで、対象とする検地クラスが溶出する保持時間と分の範囲を入力し、適切な場合に複数の荷電化合物の可能性を含む、標的クラスの検数の質量対充電比範囲を求めます。質量分析装置の達成可能なタンデム質量分析質量精度を入力し、質量電荷比のクラス特異的な生成物イオンを入力します。クラス固有の中性損失を入力し、タンデム質量分析スペクトルの基本ピークに対する割合として考慮される診断製品イオンおよび/または中性損失の最小強度を定義します。次に、結果を出力するパスとファイル名を選択し、「OK」をクリックしてDFFを開始します。セットアップが正常に完了すると、DFF プロットが表示されます。解析者は、化合物クラス内の既知の化合物のタンデム質量スペクトルを解釈して、化合物のクラス全体の診断である生成イオンおよび/または中性損失を特定する必要があります。このDFFプロットは、M.aeruginosa CPCC 300の分析に続いて生成された。X軸は、定義されたDFF基準を満たす前駆体イオンの質量電荷比を表し、y軸はマイクロシスチンタンデム質量分析スペクトル内のすべての生成イオンの質量電荷比を示します。この分析では、ミクロシスチン検出の基準には、質量電荷比400~1、200、および2〜6分間の保持時間内の前駆体イオンが含まれていました。最も重要なことは、これらのタンデム質量分析スペクトルは、定義された15%ベースピーク強度閾値を超える質量電荷比の両方を含んでいた。分析中に取得した4、116タンデム質量分析スペクトルのうち、26はDFF基準を満たし、M.aeruginosa CPCC 300抽出物で検出した。検出された主要なマイクロシスチンは、自信を持ってマイクロシスチンロイシンアルギニンおよび脱メチル化アスパラギン酸ミクロシスチンロイシンアルギニンとして割り当てることができました.診断フラグメント化フィルタリングを使用して新しい化合物が発見されると、NMRによる化合物の分離と特性評価のために生物を大規模に増殖させることができます。マイクロシスチンに適用すると、診断断片化フィルタリングにより、従来の標的スクリーニング方法がサンプル内に存在する主要な毒素を検出しているかどうかを判断できます。

natural-product-discovery-with-lc-msms-diagnostic-fragmentation

Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

将来の臨床応用のための唾液採取を考慮して、ロリポップのような限外濾過（LLUF）プローブは、ヒトの口腔内に収まるように作製した。ナノLC-LTQ質量分析法による消化唾液の直接分析は、大規模なタンパク質や高濃度タンパク質を除去し、低豊富なペプチドは多くの検出可能なようにするLLUFプローブの能力を実証した。...

ロリポップライク限外プローブを用いたヒト先住民唾液ペプチドーをサンプリング：臨床質量分析のためのペプチドの検出を簡素化し、強化

超高速液体クロマトグラフィーと質量分析(UPLC-MS)を組み合わせたノンターゲット代謝物プロファイリングは、代謝を調査するための強力な技術です。...

超高速液体クロマトグラフィー - 質量分析（UPLC-MS）による血清中の大規模非標的メタボロームプロファイリング

このプロトコルは、海水から採取された微生物バイオマスからのタンパク質とDNAの抽出と濃縮、その後のタンデム質量分析に基づくプロテオミクス分析に適したトリプシンペプチドの生成のためのものです。...

水生微生物Metaproteomicsワークフロー：細胞からのトリプシンペプチドのタンデム質量分析ベースの分析に適し

エレクトロスプレーイオン化(ESI)質量分析計と組み合わせた社内構築のフロースルートリプシンマイクロリアクターによるタンパク質分解の迅速なプロトコルが提示されます。マイクロリアクターの作製、実験装置、データ取得プロセスについて説明します。...

フロースルーマイクロリアクターとMS検出のためのタンパク質の高速酵素処理

ここでは、質量分析法による逐次対象数量と水中のフッ素化合物の非ターゲット分析のためのプロトコルを提案する.この方法は知られているフッ素系化合物の定量的なレベルを提供し、豊かさの半定量的な見積もり関連試料中の未知の化学物質を識別します。...

あたりを識別する-ポリフルオロ化学種の結合対象・非対象と検診高分解能質量分析ワークフロー

このプロトコルは、液体クロマトグラフィー質量分析と高度な特徴抽出およびバイオインフォマティクス分析ソフトウェアを組み合わせたペプチドグリカン組成の詳細な分析をカバーしています。...

液体クロマトグラフィー質量分析とバイオインフォマティクスによるペプチドグリカンの半定量分析

シアノバクテリアの花と関連するシアノトキシンの早期発見のための高速-学際的な戦略がここに記載されています。これにより、水サンプルおよび二枚貝サンプルなどの有機マトリックス中のシアノバクテリアおよび関連するシアノトキシンを24時間で検出できます。...

高速検出戦略を用いたシアノバクテリアブルームと関連サイアノトキシンの早期発見

プロトコルは、複雑な溶解物ベースの無細胞系における代謝反応を研究するための屈折率または質量分析検出に結合された高速液体クロマトグラフィー法を記述する。...

リセートベースの無細胞システムにおける代謝物プロファイリングのためのリキッドクロマトグラフィー結合と屈折率または質量分析法検出

トロパンアルカロイドの迅速な質量分析(MS)/質量分析(MS)ベースのアノテーションと分類の方法を提示し、トロパン含有サンプルの予備的な再現性の除去と単離のための新規アルカロイドの発見の両方に役立ちます。...

天然物研究における液体クロマトグラフィータンデム質量分析の応用:ケーススタディとしてのトロパンアルカロイド

繰り返しのHPLC分離を自動化するために、統合型オートサンプラーおよびフラクションコレクター(LC-mate)が開発されました。アナログ信号を出力するHPLC検出器と互換性があり、LC-mateは手動操作システムの性能を向上させ、高性能液体クロマトグラフィーに依存する研究ワークフローを加速させます。...

LC-mateを用いた自動HPLC分離:マイクロスケール精製のための統合反復オートサンプラーおよびフラクションコレクター

ここでは、多段階質量分析木と火翔正奇経口液体に基づく断片化プロセスを組み合わせた標準プロトコルを示します。...

線形イオントラップ質量分析法に基づく、ホオシャン正奇口腔液体中の未知化合物の構造解析の技術的アプローチ

学ぶLC-MS/MS診断フラグメンテーションによる自然物質発見法。MZmineを用いて複雑な混合物から構造的に関連する新規化合物や毒素を検出し、食品安全と環境評価に貢献します。

LC-MS/MS 診断フラグメンテーションによる自然な製品の発見: ミクロシスチン分析のためのアプリケーション

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