LC-MS/MS 診断フラグメンテーションによる自然な製品の発見: ミクロシスチン分析のためのアプリケーション
May 31st, 2019
MZmine に実装された診断フラグメンテーションフィルタリングは、既知および未知の天然製品のクラス全体について、LC-MS/MS データセットをスクリーニングするための、エレガントで取得後のアプローチです。このツールは、分析者が化合物クラス全体の診断として定義した製品イオンおよび/または中性損失の MS/MS スペクトルを検索します。
天然物は、多くの場合、化合物のクラスとして生合成され、単一の製品としてではありません。診断フラグメンテーション フィルタリングは、複雑な混合物内のすべての構造的に関連する化合物を検出するための簡単なアプローチです。MZmineソフトウェア内で実装された診断断片化フィルタリングにより、アナリストは、見逃される可能性のある新しい天然物の質量分析データセットを探索することができます。
これには、新しいバイオ製品、および新しい毒素が含まれます。食物および水を汚染する毒素クラスに適用される診断断片化フィルタリングは、暴露評価を知らせることができる。微生物や植物抽出物に適用すると、新しい化合物の発見につながる可能性があります。
診断フラグメント化フィルタリングを使用するには、化学クラスを定義する主要なタンデム質量分析機能を理解する必要があります。これは、構造的に類似した化合物が特徴的なイオンを生成することを意味します。私の名前はショーン・フーグストラです。
私は私たちのセンターで研究技術者とソフトウェア開発者であり、私は手順をデモンストレーションします。ミクロシスチン分析用の試料を調製するために、無菌シアノバクテリア増殖培地の30ミリリットルを1ミリリットル当たり約5倍の10〜5番目の細胞に接種し、無菌状態下、250ミリリットルのエルレンマイヤーフラスコで、血球計で細胞密度をモニタリングする。26日間の光オートトローフ培養後、12時間のライトダークレジームを摂氏27度で用いたクールホワイト蛍光灯で照らし、1日1回旋回し、直径47ミリリットルのGF/Cガラスマイクロファイバーフィルターペーパーを使用して、真空濾過によって細胞を培地から分離する。
14ミリリットルの試験管で収穫された細胞に80%メタノールの3ミリリットルを加え、渦を加え、その後30秒間各管を超音波処理します。超音波処理の後、3つの連続した1時間、マイナス20°C凍結、および15分間の室温融解サイクルでサンプルを分解し、個々の0.22マイクロメートルポリテトラフルオロエチレンシリンフィルターを介して各得られるシアノバクテリア細胞抽出物を濾過します。窒素ガスの穏やかな流れを使用して、30°Cでエバポレーターで抽出物を乾燥させ、マイナス20度で乾燥した抽出物を保存します。
液体クロマトグラフィータンデム質量分析の場合、分析する乾燥残渣を90%メタノールの500マイクロリットルで再構成し、30秒間ボルテックスサンプルを再生する。琥珀色の高圧液体クロマトグラフィーバイアルに移します。次に、標準的なプロトコルに従って、高分解能質量分析計でデータ依存的な取得方法を用いてシアノバクテリア抽出物を分析します。
ほとんどのマイクロシスチンは、タンデム質量分析、MからZ 135.0803、および163.1114の2つの診断産物イオンを生成するATA残基を含んでいます。非ターゲット液体クロマトグラフィータンデム質量分析データセットの準備の場合は、MZmine 2を開き、未処理データメソッドの下の「生データインポート」を選択します。.ドロップダウンメニュー。次に、マイクロシスチン分析からデータ ファイルを選択し、ピーク ピッキング フィルターを選択して、ベンダー提供の送心アルゴリズムを適用します。
インポートされたデータ依存取得ファイルの診断フラグメンテーション フィルタリング(DFF)の場合は、カーソルを使用してデータ ファイルを強調表示し、[視覚化] ドロップダウン メニューを開いて DFF オプションを選択します。表示される DFF ダイアログ ボックスで、対象とする検地クラスが溶出する保持時間と分の範囲を入力し、適切な場合に複数の荷電化合物の可能性を含む、標的クラスの検数の質量対充電比範囲を求めます。質量分析装置の達成可能なタンデム質量分析質量精度を入力し、質量電荷比のクラス特異的な生成物イオンを入力します。
クラス固有の中性損失を入力し、タンデム質量分析スペクトルの基本ピークに対する割合として考慮される診断製品イオンおよび/または中性損失の最小強度を定義します。次に、結果を出力するパスとファイル名を選択し、「OK」をクリックしてDFFを開始します。セットアップが正常に完了すると、DFF プロットが表示されます。
解析者は、化合物クラス内の既知の化合物のタンデム質量スペクトルを解釈して、化合物のクラス全体の診断である生成イオンおよび/または中性損失を特定する必要があります。このDFFプロットは、M.aeruginosa CPCC 300の分析に続いて生成された。X軸は、定義されたDFF基準を満たす前駆体イオンの質量電荷比を表し、y軸はマイクロシスチンタンデム質量分析スペクトル内のすべての生成イオンの質量電荷比を示します。
この分析では、ミクロシスチン検出の基準には、質量電荷比400~1、200、および2〜6分間の保持時間内の前駆体イオンが含まれていました。最も重要なことは、これらのタンデム質量分析スペクトルは、定義された15%ベースピーク強度閾値を超える質量電荷比の両方を含んでいた。分析中に取得した4、116タンデム質量分析スペクトルのうち、26はDFF基準を満たし、M.aeruginosa CPCC 300抽出物で検出した。
検出された主要なマイクロシスチンは、自信を持ってマイクロシスチンロイシンアルギニンおよび脱メチル化アスパラギン酸ミクロシスチンロイシンアルギニンとして割り当てることができました.診断フラグメント化フィルタリングを使用して新しい化合物が発見されると、NMRによる化合物の分離と特性評価のために生物を大規模に増殖させることができます。マイクロシスチンに適用すると、診断断片化フィルタリングにより、従来の標的スクリーニング方法がサンプル内に存在する主要な毒素を検出しているかどうかを判断できます。
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概要
診断的フラグメンテーションフィルタリングは、複雑な混合物内で構造的に関連する天然物質を検出する方法です。MZmineで実装されたこのアプローチにより、通常見過ごされがちな新しい化合物の質量分析データセットの探索が可能になります。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 天然物
- 質量分析
- 分析化学
背景
- 天然物はしばしば化合物クラスとして合成されます。
- 複雑な混合物は個々の製品の検出を妨げる可能性があります。
- 診断的フラグメンテーションフィルタリングは関連化合物の同定を強化します。
- この方法は食品安全性やバイオ製品の発見など、様々な文脈に適用できます。
研究目的
- 複雑な混合物から新しい天然物質を同定する。
- 食品や水を汚染する可能性のある毒素を検出する。
- 毒素に関連する暴露評価を提供する。
使用された方法
- MZmineソフトウェアでの診断的フラグメンテーションフィルタリングの実装。
- 質量分析データセットの分析。
- 生成イオンと中性損失の検索。
- 微生物および植物抽出物の探索。
主要な結果
- 新しいバイオ製品と毒素の同定。
- 構造的に関連する化合物の検出強化。
- 食品や水の汚染物質に関する暴露評価の改善。
- 様々な天然源からの新しい化合物の発見。
結論
- 診断的フラグメンテーションフィルタリングは天然物発見の貴重なツールです。
- この方法は複雑な混合物の分析を大幅に改善できます。
- 環境安全性とバイオ製品開発の両方に影響を与えます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Diagnostic fragmentation filtering (DFF) enables biopharma R&D teams to detect structurally related natural product classes in complex extracts, supporting early discovery of bioactive compounds and toxins. By leveraging class-specific MS/MS signatures, DFF improves target validation confidence and reduces the risk of overlooking novel scaffolds in microbial or plant-derived libraries. This approach enhances predictive value in lead identification workflows where structural similarity complicates traditional targeted screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by detecting all members of a natural product class, clarifying biosynthetic potential and functional relevance.
- Operational Value: Supports biological de-risking through comprehensive profiling of compound classes, reducing false negatives in early-stage screening.
- Predictive Value: Increases confidence in target engagement by identifying structurally related analogs that may share pharmacological activity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by ensuring detection of class-specific markers in complex matrices.
- Operational Value: Enhances assay standardization and reproducibility through consistent application of diagnostic ion filters across datasets.
- Scalability: Enables platform reuse for multiple natural product classes once class-specific fragments are defined.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant systems by identifying toxin variants or metabolites that may influence pathophysiological outcomes.
- Operational Value: Promotes translational continuity from discovery to preclinical evaluation by providing comprehensive compound class coverage.
- Risk Mitigation: Informs risk-adjusted advancement decisions by revealing hidden analogs that could affect safety or efficacy profiles.
Pipeline & Workflow Integration
DFF fits within the discovery continuum from early biology to lead identification, particularly when structural families require comprehensive interrogation before prioritization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by detecting all compounds sharing class-specific fragmentation patterns.
- Screening: Enhances assay readiness and quantitative output reliability by filtering for diagnostic product ions and neutral losses.
- Analytics: Delivers measurable readouts (e.g., precursor ion m/z, product ion matches) that enable cross-condition comparison and hit confirmation.
- Translational Research: Connects to preclinical work by ensuring toxin or metabolite classes are fully characterized before safety assessment.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable analytical capability across projects once class-specific DFF parameters are established.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity from undetected analogs.
- Operational Value: Increases reproducibility and scalability of natural product screening through standardized MS/MS filtering.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by uncovering hidden chemical space, reducing late-stage attrition from unexpected biological activity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through comprehensive class-level detection, improving lead selection efficiency.
Implementation Considerations
- Requires expertise in natural product chemistry and tandem mass spectrometry interpretation to define diagnostic fragments.
- Dependent on high-resolution mass spectrometry instrumentation capable of data-dependent acquisition.
- Necessitates cross-team standardization of DFF parameters (e.g., retention time windows, ion thresholds) for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when applying the method to new compound classes with varying fragmentation behaviors.
- Limited by the need for prior knowledge of class-specific product ions or neutral losses, which must be empirically determined.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:04
Diagnostic Fragmentation Filtering (DFF) for Microcystin (MC) Analysis
3:37
Non-Targeted Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) Dataset Preparation
5:25
Results: Representative DFF Plot for MC Analysis of M. aeruginosa Cellular Extract
6:45
Conclusion
