Name: 質量分析による3つの DNA 病変の定量化と、周囲の微細粒子状物質に曝露したマウスの組織におけるそのレベルの評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: 学ぶ、質量分析を用いてマウスの肺・肝・腎組織における酸化ストレス由来DNA損傷を高感度に定量する手法。環境汚染物質PM2.5の影響評価に有用です。

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FAPESP (Fundação ・デ・アンパロà Pesquisa はメヒコ・デ・サンパウロ、2012/22190-3 および 2012/08616-8)、CNPq (Proc. 454214/2014-6 および 429184/2016-6)、ケープ、PRPUSP (Pró・デ・ Reitoria ・ダ・ Pesquisa ・デ・サンパウロ)、セアラ INCT (MCT/INAIRA/CNPQ/岬/FAPEMIG/FAPERJ/FAPESP;Proc. 573813/2008-6)、INCT Redoxoma (FAPESP/CNPq/岬;573530/2008-4)、NAP Redoxoma (PRPUSP;2011.1.9352.1.8) と CEPID Redoxoma (FAPESP;Proc. 2013/07937-8)。F. オリベイラは、FAPESP (Proc. 2012/21636-8, 2011/09891-0, 2012/08617-4) とケープ (Coordenação ・デ・ Aperfeiçoamento ・デ・ Pessoal ・デ・ Nível ・スーペリア) から奨学金を受けました。M. h. g. メデイロス、p. ディ Mascio、p. h. Saldiva、および a. p. m. Loureiro は CNPq からのフェローシップを受け取りました。
この作品に含まれるいくつかの図および表は、ブラジルのサンパウロ市からの濃縮された周囲微細粒子状物質 (PM2.5) に曝露したマウスにおけるオリベイラ A.A.F. et Al. 遺伝毒性および epigenotoxic 効果において最初に出版した。粒子および繊維毒性学。15、40 (2018)。

作者は何も開示することはありません。

HPLC 法による 8-oxodGuo 解析で見られる主要な問題は、dna 抽出の workup 手順、dna 加水分解、および dna 加水分解物22,38の濃度におけるその形成の可能な誘導である。8-oxodGuo artifactual 形成の問題を最小限に抑えるために、すべての DNA 抽出、貯蔵および加水分解溶液へのデフェロキサミンの添加、DNA 抽出におけるヨウ化ナトリウムカオトロピック法の使用およびフェノールの回避を推奨する。最終的な結果39へのスプリアスな酸化の寄与を最小限に抑えるために、加水分解手順において DNA 量が100μ g に近いものを使用することもできる。我々は、DNA 抽出のためのヨウ化ナトリウムカオトロピック法の使用を除いて、上記の推奨事項を考慮に入れました。代わりに、簡単にするために、我々は、使用前にそれらにデフェロキサミンを追加し、DNA 抽出のための商業的なソリューションを使用しました。さらに、得られた DNA 加水分解物を、通常のヌ...

一部の活性酸素種 (ROS) は、DNA 塩基の炭素二重結合とデオキシリボース部分の炭素を酸化させ、酸化された塩基を生成し、DNA 鎖が1を壊すことがある。窒素と酸素原子が豊富な負の荷電分子として、DNA は、nucleophilic 部位 (窒素と酸素) と共有的に反応する electrophilic グループの標的でもあり、DNA 付加物2と呼ばれる製品を与えている。そこで、DNA 付加物および酸化 DNA 塩基は、electrophilic された物質の毒性評価のために有用なバイオマーカーである DNA 病変の例であり、生体内変換に対して反応性毒物を発生させ、または酸化ストレス1を誘導し、 2修飾された DNA 塩基は塩基切除修復 (BER または NER) によって DNA から除去されるが、dna 病変の生成と除去との間の不均衡の誘導は、DNA 残業におけるそれらのレベルの正味増加をもたらす。/c5 &gt;。結果は、DNA 突然変異率の増加、遺伝子発現の減少、およびタンパク質活性の低下 (2、4、5、6、7) と密接に関連している効果病気の開発。DNA の変異は、細胞のシグナル伝達、細胞周期、ゲノムの完全性、テロメアの安定性、エピゲノム、クロマチン構造、RNA のスプライシング、タンパク質の恒常性、代謝、アポトーシス、細胞分化などの多様な細胞機能に影響を与える可能性があります8 、9。細胞突然変異率および慢性疾患の発症を遅らせるための戦略 (例えば、癌、神経変性疾患) は、変異源の知識を通過し、それらのうち、DNA 病変およびそれらの原因に関する。
過剰に内因的に発生した ROS は、汚染物質の曝露に起因して、持続性の炎症、疾患の病態生理学 (例えば、糖尿病) など、DNA および脂質損傷1を含む生体分子損傷の重要な原因である。一例として、遷移金属イオン (Fe2o3+、Cu+) による h2o-2 から形成される高反応性ヒドロキシルラジカル (OH) は、dna 塩基の酸化、dna 糖部分および多価不飽和脂肪酸を拡散制御レート10.80はすでに酸化核酸塩基3を特徴付けられているが、最も研究したものは 8-オキソ-7, 8-dihydroguanine (8-oxoGua) または 8-オキソ-7, 8-ジヒドロ-2'-デオキシグアノシン (8-OxodGuo,図 1), GT transversions を誘導することができる病変である哺乳類細胞10、11。グアニンのモノラル電子酸化によって、または DNA1におけるグアニンのヒドロキシルラジカルまたは一重項酸素攻撃によって形成される。多価不飽和脂肪酸は、高反応性酸化剤の他の重要な標的である•OH、脂質過酸化のプロセスを開始する1,12。それは、マロンジアルデヒド、4-ヒドロキシ-2-ノネナール、2、4-decadienal、4、5-エポキシ-(2E)-decenal、ヘキセナール、アクロレイン、crotonaldehyde などの electrophilic アルデヒドおよび epoxyaldehydes に分解することができる脂肪酸ヒドロペルオキシドを生じさせるマロンジアルデヒド-、propano、または etheno 付加体1、12、13などの変異原性 exocyclic DNA 付加を形成することができる。Etheno 付加体 1,n2-etheno-2'-デオキシグアノシン (1,n2-εdGuo,図 1) および 1,n6-etheno-2'-デオキシアデノシン (1,n6-εdAdo,図1) は、炎症14,15の病態生理学における潜在的なバイオマーカーとして示唆されている。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59734/59734fig1.jpg"> 図 1.DNA 病変の化学構造は、本研究において定量化した。dR = 2 ́-デオキシリボース。この図は、オリベイラ et al.34から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59734/59734fig1large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
1980年代初頭に実施された研究は、電気化学的検出 (HPLC ECD) に結合した高性能液体クロマトグラフィーによる 8-oxodGuo の高感度検出を可能にした。いくつかの生物学的システムにおける HPLC − oxodGuo の定量化は酸化条件に供され、DNA1,16における酸化的誘発塩基損傷のバイオマーカーとしての8− oxodGuo の認識につながった。堅牢で、低 fmol 範囲17で 8-oxodGuo の定量化を可能にするが、HPLC ECD 測定は検体同定のための検体保持時間の精度と、干渉を避けるためのクロマトグラフィー分解能に依存します。他のサンプル成分。電気化学検出では、移動相において塩 (例えば、リン酸カリウム、酢酸ナトリウム) を使用する必要があるため、適切な分析条件の維持には、ルーチンカラムおよび機器の洗浄時間が必要です。
あるいは、formamidopyrimidine DNA glycosylase (FPG) およびその後、ヒト 8-oxoguanine glycosylase 1 (hOGG1) の細菌 DNA 修復酵素の使用は、DNA からの 8-oxoGua の検出および除去のための、DNA アルカリ不安定の誘導のための方法として浮上したサイト。アルカリ不安定部位は、DNA 鎖切断に変換され、アルカリ単細胞ゲル電気泳動 (「彗星アッセイ」) による 8-oxoGua の非常に高感度な間接定量を可能にします。細胞 DNA の抽出の必要性のない高い感受性そして分析の達成はこのタイプの試金の主な利点である。これは、DNA において 8-oxoGua の最低定常状態レベルを与え、典型的には、HPLC に基づくシステム法によって得られたレベルよりも低い7-10 倍である。しかし、それは 8-oxoGua の間接測定であり、いくつかの欠点は、1,16,18使用される修復酵素の特異性または未知の効率の欠如である。
免疫アッセイは、1、n6-茶道および1、n2-dGuo12のような 8-oxoGua1および exocyclic DNA 付加物の検出のために使用される方法の他のセットである。感受性にもかかわらず、dna 病変の検出のための抗体の使用の欠点は、正常な dna 塩基1,12を含む生物学的試料の他の成分に対する交差反応性による特異性の欠如である。Exocyclic DNA 付加体としては、1、n6-茶道および 1,n2-dGuo を含む、高感度の32P − postlabeling アッセイ12によって検出および定量することもできる。32P-postlabeling の高感度は、1010通常塩基あたり約1付加体の検出のための非常に少量の DNA (例えば、10μ g) の使用を可能にします。しかし、ラジオ-化学物質の使用は、化学的特異性および低精度の欠如は、いくつかの欠点19,20である。
上記で引用した方法の共有制限は、所望の分子の検出のための低い選択性または特異性である。このシナリオで、エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法 (HPLC-ESI-MS/MS および HPLC-ms3) に結合された hplc は、DNA、尿、血漿および唾液のような生物学的マトリクスにおける修飾ヌクレオシドの定量化のための金本位として進化した1,19,20. HPLC − MS/ms 法の利点は、感度 (典型的には低 fmol 範囲) と i によって提供される特異性が高いことである) クロマトグラフ分離、ii) 質量内部の分子断片化の特徴と既知のパターン分光器衝突チャンバ、および iii) は、多重反応監視モード1,19において選択された質量を電荷比 (m/z) で正確に測定する。同位体ラベルの内部標準を使用することにより、DNA 加水分解および検体濃縮ステップにおける分子損失の補正、およびサンプル間の分析種イオン化の違いによる利点が加わります。また、1、12、19、20の複数のピークが存在する場合に、正しいクロマトグラフィーピークの同定にも役立ちます。
さまざまな生物学的サンプルから抽出された DNA において、oxodGuo、1、N6-茶道および 1,n2-dGuo の定量には、HPLC − ms/ms に基づくいくつかの方法が用いられる12,15,20 、21、22、23、24、25、26、27、28、29 日.微粒子 (PM2.5) は、多環芳香族炭化水素 (PAHs)、ニトロ-PAHs、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、キノリン、金属、水溶性イオンなどの有機および無機化学物質を運び、炎症を誘発する可能性があり酸化ストレスは、生体分子損傷および疾患の発生を優先する条件30、31、32、33である。ここでは、oxodGuo、1、n6-茶道および 1,2-dGuo の肺、肝臓および腎臓 DNA における定量化のために首尾よく適用された検証済みの HPLC ESI/ms 法を提示します。アンビエント PM2.5暴露34の影響

<table><tbody><tr><td>[15N5]-2'-デオキシアデノシン</td><td>ケンブリッジ同位体研究所</td><td>NLM-3895-25</td><td></td></tr><tr><td>[15N5]-2'-デオキシグアノシン</td><td>ケンブリッジ同位体研究所</td><td>NLM-3899-CA-10</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>カルロエルバ アルカリ</td><td>412413000</td><td></td>試薬</tr><tr><td>ウシ腸粘膜由来のホスファターゼ</td><td>Sigma</td><td>P5521</td><td></td></tr><tr><td>酢酸アンモニウム</td><td>メルク</td><td>101116</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胸腺 DNA</td><td>Sigma</td><td>D1501</td><td></td></tr><tr><td>細胞溶解液</td><td>QIAGEN</td><td>158908</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>カルロエルバ</td><td>デ</td>フェロキサミン Σ D9533 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>412653試薬デオキシリボヌクレアーゼ I (DNase I)</td><td>Bio Basic Inc</td><td>DD0649</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>カルロ エルバ ギ</td>酸<td>414542</td><td></td>試薬</tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-ESI-MS/MS システム</td><td>HPLC: Agilent 1200 シリーズ&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments</td><td>HPLC: バイナリーポンプ (G1312B)、アイソクラティックポンプ (G1310A)、カラム切替バルブ付きカラムオーブン (G1316B)、ダイオードアレイ検出器 (G1315C)、オートサンプラー (G1367C)。&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;ESI-MS/MS:リニア四重極イオントラップ質量分析計、Model 4000 QTRAP。</td><td></td></tr><tr>島<td>津</td>製作所 <td>HPLC/DADシステム</td><td>ポンプ2台(LC-20AT)、フォトダイオードアレイ検出器(DAD-20AV)、オートインジェクター(Proeminence SIL-20AC)、カラムオーブン(CTO-10AS/VP)</td><td></td></tr><tr><td>HPLCカラム(内径2.0mm×50mm、2.5μ;m, C18)</td><td>Phenomenex</td><td>00B-4446-B0</td><td></td></tr><tr><td>HPLC カラム (150 x 2.0 mm i.d., 3.0 &micro;m, C18)</td><td>Phenomenex</td><td>00F-4251-B0</td><td></td></tr><tr><td>HPLC カラム (250 x 4.6 mm i.d., 5.0 &micro;m, C18)</td><td>Phenomenex</td><td>00G-4252-E0</td><td></td></tr><tr><td>HPLC C18 警備員カートリッジ (4.0 x 3.0 mm 内径)</td><td>Phenomenex</td><td>AJO-4287</td><td></td></tr><tr><td>イソアミルアルコール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32658</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール(イソプロパノール)</td><td>カルロエルバ ケ</td>タミン<td>A412790010</td><td></td></tr>試薬 <tr><td></td><td>セバ</td><td>商品名:ドパレン</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>カルロエルバ</td><td>349377</td><td></td>塩化</tr><tr><td>マグネシウム</td> シ<td>グマ</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>カルロ・エルバ 試薬</td><td>L022909K7</td><td></td></tr><tr><td>ホスホジエステラーゼ I Crotalus atrox</td><td>Sigma</td><td>P4506</td><td></td></tr><tr><td>タンパク質沈殿液</td><td>QIAGEN</td><td>158912</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>リボヌクレアーゼ A</td><td>Σ</td><td>R5000</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウム塩化物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>SPE-C18 (Strata-X)</td> <td>Phenomenex</td><td>8B-S100-TAK</td><td></td></tr><tr><td>トリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン</td><td>カルロエルバ キシ</td><td></td>ラジン489983<td></td></tr>試薬 <tr><td></td><td>Syntec do Brasil</td><td>商品名:Xilazin</td><td></td></tr></tbody></table>

質量分析による3つの dna 病変の定量化と、周囲の微細粒子状物質に曝露したマウスの組織におけるそのレベルの評価

Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

Dna 付加物および酸化 DNA 塩基は、electrophilic された物質の毒性評価のために有用なバイオマーカーである DNA 病変の例であり、生体内変換時に反応性毒物を発生させ、または酸化ストレスを誘導する。酸化核酸塩基のうち、最も研究されたものは 8-オキソ-7、8-dihydroguanine (8-oxoGua) または 8-オキソ-7, 8-ジヒドロ-2'-デオキシグアノシン (8-oxodGuo) であり、DNA における酸化的誘発塩基損傷のバイオマーカーである。脂質過酸化プロセスに起因するアルデヒドおよび epoxyaldehydes は、etheno 付加体1、n2-etheno-2' のような変異原性 exocyclic DNA 付加体を形成することができる electrophilic 分子である (1,n2-εdGuo) および 1,n6-etheno-2'-デオキシアデノシン (1,n6-εdAdo) は、炎症の病態生理学における潜在的なバイオマーカーとして示唆されている。DNA における選択的で高感度な方法は、細胞の突然変異率や慢性疾患 (例えば、がん、神経変性疾患) の発症を遅らせる予防戦略の開発に必要である。その検出のために利用可能な高感度の方法の中でも (電気化学的またはタンデム質量分析検出器に結合された高性能液体クロマトグラフィー、彗星アッセイ、イムノアッセイ、 32P-postlabeling)、最も選択的なものであるタンデム質量分析 (HPLC ESI-MS/MS) に結合された高性能液体クロマトグラフィー。複雑な生体試料や、DNA、尿、血漿、唾液などの生物学的マトリックス中の修飾ヌクレオシドを定量化するためのゴールドスタンダードとして進化した HPLC-MS/MS は、選択性が重要な利点です。同位体ラベルの内部標準を使用することにより、DNA 加水分解および検体濃縮ステップにおける分子損失の補正、およびサンプル間の分析種イオン化の違いによる利点が加わります。また、複数のピークが存在する場合に、正しいクロマトグラフィーピークの識別にも役立ちます。
ここでは、A/J マウスの肺、肝臓および腎臓 DNA における 8-oxodGuo、1、n6-茶道および 1,2-dGuo の定量化に首尾よく適用された、高感度、正確かつ正確な HPLC − ms/ms 法を提示する。アンビエント PM2.5暴露の影響の評価。

マウスの肝臓から得られた平均 DNA 濃度 (± SD)、0.2 肺 (~ 1g の組織) と腎臓 (~ 0.4 g の組織) は、それぞれ5068± 2615, 4369 ± 1021, 3223 ±723μ g/mL の最終的な容量を200μ l とした。精製 DNA の HPLC −パパによって得られた代表的なクロマトグラムを図 3に示す。4つの 2 '-deoxynucleosides の存在は、対応する 2 '-deoxynucleosides の直前に溶出する RNA ribonucleosides から遊離し、DNA 純度を実証する。
マウス組織 DNA サンプル中の 8-oxodGuo、1、N6-ΕdAdo および 1,n2-εdGuo の定量に対する HPLC − ms/ms 分析からの代表的なク...

ここでは、病変の高感度かつ正確な定量のための方法 8-オキソ-7, 8-ジヒドロ-2'-デオキシグアノシン (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2'-デオキシアデノシン (1,n6-茶道) および 1,n2-etheno-2'-デオキシグアノシン (1,N2-dGuo) DNA で.この方法は、曝露された A/J マウスの組織 (肺、肝臓および腎臓) における周囲微細粒子状物質 (PM2.5) の影響の評価に適用した。

質量分析による3つの DNA 病変の定量化と、周囲の微細粒子状物質に曝露したマウスの組織におけるそのレベルの評価

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are ...

ここで提示される方法は、酸化ストレスによって誘導されるDNA病変の定量化を可能にし、疾患の予防および治療の標的となり得る病態生理学的メカニズムの理解に寄与する。選択性と感度が主な利点です。選択性は、複雑な生物学的サンプルを扱う場合に不可欠な利点です。HPLCは、この種の生物学的マトリックスを用いた定量のゴールドスタンダードとして、タンデム質量分析法に結合して進化しました。酸化ストレスは、異なる病態生理学的プロセスに共通する事象である。炎症性疾患患者の組織または尿中に、エテノ内転差の増加レベルが検出された。DNA病変はまた、汚染物質への暴露によって引き起こされる内因性事象に関する情報を提供する。DNA病変が増加した場合、例えば、暴露は癌発症のリスクを高めるレベルであってもよい。病変は、任意の細胞系からのDNAで定量することができ、代わりにサンプル調製における適応を伴う尿、血漿、唾液培養培地で。まず、氷の上に置かれた培養プレートをベースにして、メスで組織の一部を切断します。即時使用のために各50ミリリットルのキャップチューブの組織の1グラムを量る。残りの組織をドライアイスに入れ、マイナス80度で保存してください。各チューブに、0.5ミリモルのデフェオキサミンを含む市販の細胞溶解溶液を10ミリリットル加え、氷の上に置きます。組織ホモジナイザーを60~90rpm前後の低速に設定します。溶液が組織断片がなくなるまで、氷上の組織を数分間均質化する。次に、150マイクロリットルのプロテイナーゼK溶液を各均質化サンプルに加えます。チューブを反転して振り、一晩室温に保ちます。朝、40マイクロリットルのリボヌクレアーゼA溶液を加え、反転して振り、チューブを室温で2時間保ちます。5ミリリットルの市販タンパク質沈殿液を、渦を激しく加え、遠心分離機を2,000倍、摂氏4度で10分間加えます。冷たいイソプロパノールの10ミリリットルを含む50ミリリットルのキャップチューブに上清を移します。沈殿したDNAを観察するまで、チューブを数回やさしく反転します。最後に閉じたパスツールピペットを使用して、沈殿したDNAを収集します。採取したDNAを、pH 7で4ミリリットルの10ミリモルトリスバッファーと1ミリモルデフェポキサミンを含むチューブに移して溶解する。DNAがチューブに完全に溶解した後、4%イソアミルアルコールを含むクロロホルム溶液の4ミリリットルを各チューブに加える。チューブを均質化のために10回反転し、遠心分離機を2,000回g、摂氏4度で10分間反転し、上相を新しいチューブに移します。クロロホルム溶液で上相の洗浄を2回繰り返します。その後、8ミリリットルの絶対エタノールと0.4ミリリットルの5モル塩化ナトリウム溶液を加え、DNAを沈殿させます。再度、沈殿したDNAを回収し、70%エタノールの3ミリリットルに移す。70%エタノールで洗浄をもう一度繰り返します。エタノール溶液を注意して捨て、吸収性紙に沈殿したDNAを含むチューブを反転して余分な溶液を除去する。15N5同位体規格1のDNA加水分解サンプルを調製した後、N6-エテノ-デオキシアデノシンおよび15N5同位体標準1、N2-エテノ-デオキシグアノシンを原稿に従い、各サンプルの10マイクロリットルをチューブに移し、HPLC-UVによって正常なデオキシヌロシドを定量化する。残存体積を固相抽出対象とします。HPLCを実行するには、最初に0.1%ギ酸およびメタノールの勾配を有するC18 SecurityGuardカートリッジに取り付けられたC18カラムを溶出する。0 ~25分から25分まで、メタノール18~0%で25~27分、27分から37分まで0%メタノール(1分あたり1ミリリットル、摂氏30度)で0%メタノールを使用して、勾配プログラムを設定します。その後、通常のデオキシヌクレオシド定量のために予約された各サンプルに対して2〜6マイクロリットルの間の体積を注入する。デオキシグアノシンとデオキシアデノシンのピークの統合のために260ナノメートルにDAD検出器を設定します。1、N6-エテノ-デオキシアデノシンおよび1、N2-エテノ-デオキシグアノシンの分析のための固相抽出を行うために、最初に1ミリリットルの体積で一連の溶液でカートリッジをロードする。100%メタノール、脱イオン水、加水分解されたDNAサンプル、脱イオン水、10%メタノール、15%メタノール、および最後に100%メタノールを回収する。その後、原稿に従って進めます。8-オキソオコ-デオキシグアノシンのDNA加水分解サンプル15N5同位体規格を調製した後、HPLC-ESI-MS/MSシステムで分析するために、各サンプルの80マイクロリットルをバイアルに移します。以前に行われたように、HPLC-UV上のデオキシグアノシンの定量のために残りの20マイクロリットルを予約してください。HPLC-ESI-MS/MS上の8-oxo-deoxyguanineの分析のために、C18カラムAを溶媒AとBの勾配を伴うC18 SecurityGuardカートリッジに、毎分150マイクロリットル、摂氏25度の流量で溶出します。最初の25分間は溶媒Bの0~15%、溶媒Bの15~80%を25~28分、溶媒Bの80%を28分から31分、溶媒Bの80~0%を31分から33分、溶媒Bを0%33~46分で実行します。列Aの最初の16分を廃棄物に向けます。条件列Bは、1分あたり150マイクロリットルの流量で0.1%のギ酸を含む水中に15%メタノールの溶液を有するイソクラティックポンプによる。6分後、クロマトグラムをチェックして、列A.16〜32分間隔で8-オキソ・デオキシグアノシン標準エルトを確認し、カラムAとB.列B.32分でバルブを閉じて2列目から8-オキソ・デオキシグアノシンを溶出させて、鋭いクロマグラフィーピークを得る。1、N6-エテノデオキシアデノシンおよび1、N2-エテノ-デオキシグアノシンの分析のために、C18カラムを溶媒AとBの勾配を持つC18 SecurityGuardカートリッジに、毎分130マイクロリットル、摂氏25度の流量で結びつきます。最初の10分間は溶媒Bの0%、10~39分間は溶媒Bの0~20%、溶媒Bの20~75%は39~41分、溶媒Bの75%は41分から46分、溶媒Bは46分から47分、Bは47分から47分まで0%の溶媒で、溶媒は0%を実行します。切り替えバルブを使用して溶出液の最初の35分を廃棄物に、35〜42分の分数をESIソースに向けます。設定された間隔で、縦棒の基準が列から離れないようにしてください。8-オキソ-デオキシグアノシンのピークを統合します 15N5 8-オキソ-デオキシグアノシンの同位体標準, 1、N6-エテノ-デオキシアデノシン、15N5同位体標準1、N6-エテノデオキシアデノシン、1、N2-エテノデオキシグアノシン、および15N5同位体標準1、N2-エテノデオキシグアノシンからH-ESI-MS分析。キャリブレーションカーブとサンプルの面積比を計算します。キャリブレーション曲線を確立し、注入された各サンプルの病変量を計算します。HPLC-UV分析からデオキシグアノシンとデオキシアデノシンのピークを統合.調整曲線を確立するために領域を使用し、各注入されたサンプルの動物のデオキシグアノシンおよびデオキシアデノシンの量を計算します。デオキシグアノシン上の8-オキソ-デオキシグアノシンのモル分率を計算します, 1, デオキシアデノシンの上にN6-エテノデオキシアデノシン, 1, デオキシグアノシンの上にN2-エテノデオキシグアノシン, 100万個あたりの病変の数を与えます.HPLC-UVにより得られた精製DNAの代表的なクロマトグラムは、RNAリボヌクレオシドから解放された4つの正常なデオキシヌクレオシドの存在を示し、DNA純度を示す。8-オキソ-デオキシグアノシンのHPLC-ESI-MS/MSからの代表的なクロマトグラム、1、N6-エテノデオキシアデノシン、および1、N2-エテノ-デオキシグアノシンをマウス組織のDNAサンプルに示す。UV検出で得られたクロマトグラムは、第1カラムから約10分間まで溶出する4つの正常なデオキシヌクレオシドを示し、8-オキソ・デオキシグアノシンから良好に分離して、望ましくない干渉を排除する。正確な定量化のために覚えておかなければならない重要なことは、キャリブレーションカーブとサンプルの注入量に常に同じ量の内部標準を持つということです。ここで提示される方法は、他の修飾デオキシヌクレオシドの定量化に適合され得る。修飾されたデオキシヌクレオシドのバンドを拡大することは、基礎となる病態生理学的メカニズムのより良い理解を可能にする。異種生物への暴露、糖尿病、細胞悪性転換など、さまざまな状況における酸化的損傷の役割を調べ、予防および治療戦略の開発を支援することができます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

γH2AX巣に基づいてDNA二本鎖切断の定量は、組織の放射線感受性と放射線修正する化合物の作用の評価に、特に放射線の生物学では、非常に貴重なツールとなっています。ここでは、組織サンプルにおけるγH2AX病巣の定量のための免疫蛍光アッセイの使用方法を示しています。...

組織サンプルのγH2AX病巣の定量

肺上皮細胞は、マウスの気道から分離し、差別化された呼吸上皮のモデルとしての気液界面で培養することができます。プロトコルは、分離培養し、この環境毒素への分子応答を研究するために、たばこの主流煙にこれらの細胞を露出させるための記述されています。...

エアー液界面におけるマウスの呼吸器上皮細胞と実験たばこの煙への暴露の分離

このプロトコルの目標は、COPDのマウスモデルにおける慢性肺の病状を定量化する自動化された方法を提供することです。このプロトコルには、マウスをタバコの煙(CS)にさらすこと、肺機能の測定、肺を膨らませること、および形態測定法を使用してマウスの肺気腫と小さな気道リモデリングを測定することが含まれます。...

肺気腫とタバコ煙曝露マウスにおける末梢気道リモデリングの自動測定

マウス脾臓リンパ球への慢性的なin vivo低線量照射によって誘発される可能性のあるDNA損傷レベルとDNA修復能力の変化を評価するためのプロトコルが、フローサイトメトリーを使用してDNA二本鎖切断のマーカーであるリン酸化ヒストンH2AXを測定することによって提示されます。...

慢性後のマウス脾細胞におけるDNA損傷と修復の測定<em&gt;インビボ</em&gt;β-およびγ-放射線の非常に低い用量への暴露

このプロトコルは、周囲の空気の粒子状物質で処理した後、RAW264.7マウスマクロファージにおけるin vitroで染色体異常の定量および特徴付けのための手法について説明します。...

使用周囲粒子状物質によって誘発される染色体異常の解析<em&gt;インビトロ</em&gt;システム

本研究では、オゾンの高濃度にマウスを繰り返しさらすことによって新しい慢性閉塞性肺疾患 (COPD)...

繰り返しオゾン暴露によるマウスの慢性閉塞性肺疾患モデルの生成

本稿の目的は、二重チャンバー容積脈波による意識下マウスにおける呼吸機能を評価するための推奨される手順の詳細な説明を提供するためにです。...

ダブル室容積脈波による意識下マウスにおける呼吸機能の評価

高性能液体クロマトグラフィー-電気化学検出器 (HPLC-ECD) を使用して空気サンプラー プリフィルターからカット 6 mm ラウンド...

3-ニトロチロシン大気環境を介して高性能液体クロマトグラフィー-電気化学検出器システムの検出

この記事では、個々の粒子状物質曝露レベルでの内部被ばく線量を評価することを目的として、気道マクロファージの炭素含有量を測定するための詳細な実験プロトコルについて説明します。...

炭素含有粒子状物質に曝露された気道マクロファージの炭素含有量の測定

本研究では、透過型電子顕微鏡と負染色法のためのマイクロ波アシスト植物試料調製の組み合わせを使用して約半日での植物ウイルス病の迅速かつ明確な診断を可能にする方法を説明します。...

マイクロ波は、透過型電子顕微鏡による植物ウイルス病の迅速診断をアシスト

学ぶ、質量分析を用いてマウスの肺・肝・腎組織における酸化ストレス由来DNA損傷を高感度に定量する手法。環境汚染物質PM2.5の影響評価に有用です。

質量分析による3つの DNA 病変の定量化と、周囲の微細粒子状物質に曝露したマウスの組織におけるそのレベルの評価

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