Name: モノマーからのαシヌクレイン予備型フィブリルの生成と生体内での使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 学ぼう、αシヌクレイン予備型フィブリルの標準化された生成プロトコルと品質管理手法。モノマーからの調製、超音波処理、ガラス針の作成、そしてパーキンソン病モデルにおける生体内検証の詳細な手順を解説します。

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本研究は、マイケル・ J ・フォックス財団、国立神経疾患・脳卒中研究所 (NS099416)、ウェストン脳研究所の助成金によって支援されました。

<ol><li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+alpha-synuclein+transmission+initiates+Parkinson-like+neurodegeneration+in+nontransgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice.</a> Science. 338, 949-953 (2012).</li>
<li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+Biological+Compatibility+with+Host+Alpha-Synuclein+Influences+Fibril+Pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Molecular and Biological Compatibility with Host Alpha-Synuclein Influences Fibril Pathogenicity.</a> Cell Reports. 16, 3373-3387 (2016).</li>
<li>Paumier, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrastriatal+injection+of+pre-formed+mouse+alpha-synuclein+fibrils+into+rats+triggers+alpha-synuclein+pathology+and+bilateral+nigrostriatal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Intrastriatal injection of pre-formed mouse alpha-synuclein fibrils into rats triggers alpha-synuclein pathology and bilateral nigrostriatal degeneration.</a> Neurobiology of Disease. 82, 185-199 (2015).</li>
<li>Abdelmotilib, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Synuclein+fibril-induced+inclusion+spread+in+rats+and+mice+correlates+with+dopaminergic+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">alpha-Synuclein fibril-induced inclusion spread in rats and mice correlates with dopaminergic Neurodegeneration.</a> Neurobiology of Disease. 105, 84-98 (2017).</li>
<li>Duffy, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lewy+body-like+alpha-synuclein+inclusions+trigger+reactive+microgliosis+prior+to+nigral+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Lewy body-like alpha-synuclein inclusions trigger reactive microgliosis prior to nigral degeneration.</a> Journal of Neuroinflammation. 15, 129(2018).</li>
<li>Duffy, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+Over+Quantity%3A+Advantages+of+Using+Alpha-Synuclein+Preformed+Fibril+Triggered+Synucleinopathy+to+Model+Idiopathic+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Quality Over Quantity: Advantages of Using Alpha-Synuclein Preformed Fibril Triggered Synucleinopathy to Model Idiopathic Parkinson's Disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 621(2018).</li>
<li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+alpha-synuclein+fibrils+seed+the+formation+of+Lewy+body-like+intracellular+inclusions+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Exogenous alpha-synuclein fibrils seed the formation of Lewy body-like intracellular inclusions in cultured cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20051-20056 (2009).</li>
<li>Volpicelli-Daley, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+alpha-synuclein+fibrils+induce+Lewy+body+pathology+leading+to+synaptic+dysfunction+and+neuron+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death.</a> Neuron. 72, 57-71 (2011).</li>
<li>Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+exogenous+alpha-synuclein+preformed+fibrils+to+primary+neuronal+cultures+to+seed+recruitment+of+endogenous+alpha-synuclein+to+Lewy+body+and+Lewy+neurite-like+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Addition of exogenous alpha-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous alpha-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates.</a> Nature Protocols. 9, 2135-2146 (2014).</li>
<li>Kuusisto, E., Salminen, A., Alafuzoff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-binding+protein+p62+is+present+in+neuronal+and+glial+inclusions+in+human+tauopathies+and+synucleinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-binding protein p62 is present in neuronal and glial inclusions in human tauopathies and synucleinopathies.</a> Neuroreport. 12, 2085-2090 (2001).</li>
<li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Misfolded+proteinase+K-resistant+hyperphosphorylated+alpha-synuclein+in+aged+transgenic+mice+with+locomotor+deterioration+and+in+human+alpha-synucleinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Misfolded proteinase K-resistant hyperphosphorylated alpha-synuclein in aged transgenic mice with locomotor deterioration and in human alpha-synucleinopathies.</a> The Journal of Clinical Investigation. 110, 1429-1439 (2002).</li>
<li>Li, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Lewy+body+pathology+in+12-+and+16-year-old+intrastriatal+mesencephalic+grafts+surviving+in+a+patient+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Movement+disorders+%3A+official+journal+of+the+Movement+Disorder+Society%22%5BJournal%5D)">Characterization of Lewy body pathology in 12- and 16-year-old intrastriatal mesencephalic grafts surviving in a patient with Parkinson's disease.</a> Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 25, 1091-1096 (2010).</li>
<li>Shimozawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+pathological+alpha-synuclein+in+marmoset+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Propagation of pathological alpha-synuclein in marmoset brain.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5, 12(2017).</li>
<li>Polinski, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+Practices+for+Generating+and+Using+Alpha-Synuclein+Pre-Formed+Fibrils+to+Model+Parkinson%27s+Disease+in+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Parkinson%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Best Practices for Generating and Using Alpha-Synuclein Pre-Formed Fibrils to Model Parkinson's Disease in Rodents.</a> Journal of Parkinson's Disease. 8, 303-322 (2018).</li>
<li>Fares, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+de+novo+alpha-synuclein+fibrillization+in+a+neuronal+model+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Induction of de novo alpha-synuclein fibrillization in a neuronal model for Parkinson's disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 912-921 (2016).</li>
<li>Fenyi, A., Coens, A., Bellande, T., Melki, R., Bousset, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+efficacy+of+different+procedures+that+remove+and+disassemble+alpha-synuclein%2C+tau+and+A-beta+fibrils+from+laboratory+material+and+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Assessment of the efficacy of different procedures that remove and disassemble alpha-synuclein, tau and A-beta fibrils from laboratory material and surfaces.</a> Scientific Reports. 8, 10788(2018).</li>
<li>Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survivable+stereotaxic+surgery+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Survivable stereotaxic surgery in rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2008).</li>
<li>Tarutani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+Fragmented+Pathogenic+alpha-Synuclein+Seeds+on+Prion-like+Propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Effect of Fragmented Pathogenic alpha-Synuclein Seeds on Prion-like Propagation.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 18675-18688 (2016).</li>
<li>Wall, N. R., De La Parra, M., Callaway, E. M., Kreitzer, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+innervation+of+direct-+and+indirect-pathway+striatal+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Differential innervation of direct- and indirect-pathway striatal projection neurons.</a> Neuron. 79, 347-360 (2013).</li>
</ol>

ジョセフ・パターソン、ケルビン・ Luk、キャリル Sortwell は現在、マイケル j. フォックス財団との契約交渉に関与しています Proteos, Inc. 共著者ニコール・ Polinski によって生成されたα-syn 材料, マイケル・ J ・フォックスの従業員であります財団は、α-syn モノマーを製造するために Proteos、Inc. を契約しています。共同編集者ミーガン・ダフィー、ローラ・ Volpicelli ・デイリー、ニコラス・ Kanaan は何も開示することがない。

サイズを播種し、レビー小体のような介在物に導くことができるα syn の生産は、複数の要因とステップに依存しています。重要な要因は、フィブリルを生成するために使用されるモノマーが fibrilization4、9、14、15に特異的に処方される必要があることである。モノマーが fibrilization のために製剤化されていない場合、フィブリルは形成しないか、または形成するフィブリルがα-syn 病理を産生しないことがある。同様に、モノマーが有する緩衝液もまた、fibrilization に影響を及ぼす。そのため、最良の結果を得るためには、塩濃度はおよそ 100 mM NaCl で、pH は 7.0 ~ 7.3 とする必要があります。変動性を導入する最初のステップは、初期タンパク質含有量が決定される方法であり、A280 での測定はより正確な結果を生み出す可能性が高いため、好ましい方法である。タンパク質濃度の不一致は、fibrilization プロセスの有効性を低下させるだけでなく、実験で使用した仮定したプッ濃度を変更することができます。どちらも、実験間の播種効率とバッチ変動の減少につながる可能性があります。
初期の品質管理手順では、特に線維性構造 (電子顕微鏡法)、アミロイド構造 (チオフラビン T アッセイ) を含む、サイズの重要な機能を確認し、pelletable (沈降アッセイ) です。チオフラビン T アッセイの結果は、時間とともに変動し、現在存在するアミロイド構造の量を直接測定するものではないことに注意することが重要であり、むしろ、チオフラビン T アッセイは、内部におけるアミロイド構造の存在の指標としてのみ使用されるべきである。サンプル。チオフラビン T は、典型的には、上記のアッセイなどのインビトロアッセイにおいて、アミロイド構造を含むフィブリルを示すために使用される。あるいは、チオフラビン S は、図 7に示すように、組織内でアミロイド構造を検出するために使用される。沈降アッセイに関して、結果は、サイズが主として pelletable フラクション内に見出されることのみを示す。サンプルが変性条件で実行されると、約 14 kDa、α syn モノマーのサイズの単一の著名なバンドがゲル上に存在します。これは、天然または非変性ゲルが使用された場合にサイズで期待される、より高い分子量に存在する複数のバンドとは異なります。最後に、これらすべての初期品質管理手順を成功させることは、α-syn 包含播種活性を保証するものではありません。このため、細胞培養実験または外科的に注射された動物の小さなコホートを使用して、より大きな実験で使用する前にサイズの有効性を試験する必要があります。
超音波処理は、プロセスの重要なステップであり、パラメータは、使用される sonicator のモデルに応じて異なります。超音波処理パラメータは、短いプッフラグメントが生成されたことを示すために適用し、検証する必要があります。フィブリル径は播種にも影響を及ぼし、より短繊維の播種がより効率的になる。より短いフィブリル種がより効率的になるが、この効果プラトーおよび最適なプッ長さはおよそ 50 nm4、18である。また、サンプルを過度に超音波処理したり、過剰な熱にサイズを露出させたりしないことが重要であり、これにより播種効率が低下する可能性があります。これらの超音波処理可能なサイズは、より大規模な実験に使用する前に小細胞培養またはインビボ実験における有効性について試験されるべきである。異なる超音波処理セッションは、可変性を導入する可能性を持っているように、実験治療グループはそれに応じて計画する必要があります。
生体内でサイズを送達する場合、注射部位 (複数可) の局在化および使用される全量サイズは、神経変性の程度と同様に、介在物を発症するニューロンの数7、14に影響を及ぼし得る。プロトコルの座標は開始する場所を提供しますが、大規模な実験で使用する前に、目的のターゲット領域がα syn 病理を開発するようにラボ内でテストする必要があります。所望であれば、追跡染料または蛍光ビーズは、サイズを使用する前に、地域ターゲティングをテストする方法として使用することができます。インビボで使用されるサイズの量は、グループ間で異なるが、ほとんどのグループは、1、2、3、4、5のいずれかに分けて5〜20μ g のサイズの合計を使用する。,6,7,14. 注射部位の数、注射部位の位置、および注入されたサイズの量が、synucleinopathy の結果および進行に影響を与えることができるように、使用するパラメータの下流の結果は、モデルを使用する前に特徴付けられるべきである潜在的な介入をテストするか、モデルの時間的特徴を調べます。
治療や病気の進行を研究するために使用するモデルを選択するとき, 使用されるモデルは、質問に最適な答えを選択する必要があります。.すべてのモデルが PD の特定の疾患の特徴を持っている、または潜在的な介入をテストするために必要とされる時間枠を提供しません。プッモデル含むは、α syn 病理や神経変性などの PD の主な特徴を有し、適度な運動障害を引き起こす可能性があります。このモデルは、予測可能で長期にわたる時間経過を提供しており、これは神経変性の数か月前に形成されます。これにより、研究者は synucleinopathy の長引く進行を通してさまざまなフェーズを調査し、活用することができます。モデル全体の現在および将来の使用は、疾患の進行および新規治療法の開発の研究において有益であると期待されている。

パーキンソン病 (PD) は、主に、2つの主要な病理学的特徴である、広範で進行性のα-シヌクレイン (α-syn) 病理、および nigrostriatal 変性を特徴とする。野生型マウスまたはラットへの注入に続いて、α− syn 予備化フィブリル (サイズ) は、病理学的α− syn の進行性の蓄積を誘導し、これは、黒質パルスの長期変性をもたらす可能性があるや (SNpc) ドーパミンニューロンの多くの過程でヶ月、sensorimotor 赤字1、2、3、4、5、6。ニューロンは、直接脳内注射を介して、または培養ニューロンの培地に添加することによって、α-syn 線維に曝露される。サイズがニューロンに取り込まれると、サイズは、テンプレートを介して介在物の形成を「シード」し、リン酸化介在物1、7、8に内因性α-syn の蓄積を行う。 9.含まれるものは、レビー小体と同様の特性を持ちます: セリン 129 (pSyn)、ユビキチン、p62 でのα-syn リン酸化を含む。ポジティブなチオフラビン染色で示されているように、アミロイドの第四紀構造を有する。そしてプロテイナーゼ K の消化力1、3、5、7、8、9、10、11に対して抵抗がある、 12です。プッ曝露は、培養中の一次および一部の不死化ニューロンにおけるα− syn 含有形成につながり、ならびにマウス、ラット、およびインビボでの非ヒト霊長類1、2、3、4、 5、6、7、8、9、13。サイズはすべての細胞培養モデルにおいてα-syn 含有形成につながらず、一部の培養ニューロンは他のものよりも優れた種子であることに注意することが重要です。
In vivo α-syn プッモデルのもう一つの重要な特徴は、数ヶ月にわたって出現する別個の逐次病理学的段階である。げっ歯類では、intrastriatal 注射に続いて、α− syn 封入形成は、一般に、1-2 ヶ月以内に SNpc および多くの皮質領域内でピークになる。この凝集ピークに続く nigrostriatal 変性≈2-4 ヶ月後1,3,5.これらの異なる病理学的段階は、1) α-syn 凝集を減少させ、2) すでに形成したα-syn 介在物、および/または 3) 後続の神経変性を防止する戦略を研究し開発するプラットフォームを研究者に提供する。プッモデルは、neurotoxicant、トランスジェニック、およびウイルスベクター媒介α− syn 過剰発現モデルと比較して、以前に確認された6のような明確な利点および欠点を提供する。どのモデルまたはどのアプローチを取るかの選択は、調査者が尋ねている質問に最も適したモデルによって決定されるべきです。
プッモデルは多くの実験室によって首尾よく利用されたが、まだグループが生成フィブリルとの矛盾を経験し、一貫したα-syn 病理学14を作り出す。サイズからの不整合の例としては、α syn 病理をほとんどまたはまったく生成しない、バッチシード効率にバッチ処理する、さらには形成するフィブリルの障害が挙げられる。したがって、新しい治療介入の影響に関する正確な解釈を可能にするためには、α-syn プッ生成およびインビボアプリケーションの標準化が重要である。以下のプロトコルは、α syn モノマーからのサイズの生成に必要なステップを概説し、一旦形成されたサイズのインビトロ品質制御、使用前のサイズの超音波処理および測定、およびインビボ注入の成功を促進するための提案ラットまたはマウスにサイズ。

<table><tbody><tr><td>1xダルベッコ'リン酸緩衝生理食塩水</td><td>サーモフィッシャー(Gibco)</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>抗α-シヌクレイン(セリン129でリン酸化)抗体</td><td>アブカム</td><td>AB184674</td><td></td></tr><tr><td>抗α-シヌクレイン抗体</td><td>アブカム</td><td>AB15530</td><td></td></tr><tr><td>ビシンコン酸</td><td>サーモフィッシャー(ピアス)</td><td>PI23228</td><td></td></tr><tr><td>クリアメディカルシュリンクチューブ(内径0.036インチ)</td><td>ノードソンメディカル</td><td>103-0143</td><td></td></tr><tr><td>クリア メディカル シュリンク チューブ (内径 0.044インチ)</td><td>ノードソン メディカル</td><td>103-0296</td><td></td></tr><tr><td>硫酸銅</td><td>サーモフィッシャー (ピアス)</td><td>PI23224</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ サーモミキサー C</td><td>エッペンドルフ</td><td>2231000574</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ サーモトップ 加熱蓋</td><td>エッペンドルフ</td><td>5308000003</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/カーボンコーティング電子顕微鏡グリッド</td><td>Eletron Microscopy Sciences</td><td>FCF300-Cu</td><td></td></tr><tr><td>ガラス毛細管(外径0.53mm、内径0.09mm、長さ54mm)</td><td>ドラモンド</td><td>22-326223</td><td></td></tr><tr><td>ガラス針引き機</td><td>成重</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>ハミルトンシリンジ</td><td>ハミルトン</td><td>80000</td><td></td></tr><tr><td>予め形成されたフィブリルを生成するためのヒトα-シヌクレインモノマー</td><td>Proteos</td><td>RP-003</td><td></td></tr><tr><td>マウス α-シヌクレイン モノマーで予め形成された原線維を生成</td><td>Proteos</td><td>RP-009</td><td></td></tr><tr><td>オレンジ メディカル シュリンク チューブ (内径 0.021インチ)</td><td>Nordson Medical</td><td>103-0152</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7543</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Invitrogen</td><td>25530015</td><td></td></tr><tr><td>Qsonica 3.2 mm チップ</td><td>Qsonica</td><td>4422</td><td></td></tr><tr><td>Qsonica Q125 sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Q125</td><td></td></tr><tr><td>Thioflavin S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1892</td><td></td></tr><tr><td>Thioflavin T</td><td>EMD Millipore</td><td>596200</td><td></td></tr><tr><td>ToxinSensor Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit</td><td>Genscript</td><td>L00350C</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl acetate</td><td>Eletron Microscopy Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

モノマーからのαシヌクレイン予備型フィブリルの生成と生体内での使用

Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo

Synucleinopathy の in vivo α-シヌクレイン予備型フィブリル (α-syn プッ) モデルの使用は、パーキンソン病 synucleinopathy および nigrostriatal 変性のモデル化を目指す研究者の間で人気を集めている。Α-syn プッ生成および in vivo アプリケーションの標準化は、一貫性のある堅牢なα syn 病理を確保するために重要です。ここでは、単量体α-syn、fibrilization 後の品質管理手順、およびラットまたはマウスへのα-syn サイズの脳神経外科注射の成功のためのパラメータを示唆する詳細なプロトコルを紹介します。単量体α syn から始めて、fibrilization は、最適なバッファー条件、濃度、および温度で振とうしながら7日間のインキュベーション期間にわたって発生します。Fibrilization の品質管理は、沈降アッセイによる pelletable 細線維の存在、チオフラビン T アッセイによるフィブリル内のアミロイド立体構造の形成、および線維の電子顕微鏡可視化によって評価される。これらのアッセイを用いて成功した検証は成功のために必要であるのに対し、各プッバッチの凝集活性は細胞培養またはパイロット動物コホートにおいてテストされるべきであることを保証するには十分ではないサイズ。使用する前に、サイズは正確に標準化された条件下で超音波処理する必要があり、次に電子顕微鏡または動的光散乱を用いた検査によって、フィブリル長が最適なサイズ範囲内にあり、平均長さが 50 nm であることを確認します。サイズは、細胞培養培地に添加したり、動物に使用することができます。リン酸化α− syn (psyn; セリン 129) について免疫染色によって検出可能な病理は、それぞれ細胞培養およびげっ歯類モデルにおいて数日後に明らかである。

Α− syn モノマーからのフィブリルの生成は、モノマーの濃度を決定することから始まる。BCA アッセイと 280 nm (A280) での吸光度測定はどちらもタンパク質含有量の測定に使用できます。しかし、BCA アッセイの結果は、A280 法よりも高い濃度であることが示唆された。マウスα-syn モノマー由来のサイズは、BCA 値が14.05 ±0.22、A280 が8.05 ±0.03 μ l であった (図 1)。同様に、ヒトα-syn モノマーに由来するサイズも、12.95 ±0.38 の BCA 値および7.83 ±0.05 μ g/μ l の A280 で、より高濃度であるように見えた (図 1)。A280 の測定値は、消光係数を含めることに基づいてα syn に固有であり、これらの結果は、7日間のインキュベーションの前にモノマーを希釈するために使用されました。
インキュベーションに先立って、α− syn モノマーを含む液体は明らかであったが、フィブリル形成後に濁って現れるはずである。透過型電子顕微鏡による検査では、長いフィブリルの存在を確認し、10-20 の幅を測定した (図 4)。比較して、α-syn モノマーはほとんど認識できない形状で見えました (図 4)。フィブリル状構造の目視確認により、フィブリルのアミロイド立体構造は、チオフラビン T アッセイを用いて確認すべきサイズの次の特徴である。チオフラビン T は、アミロイドへの結合時に蛍光を増強する。したがって、サンプルからの蛍光シグナルの増加は、アミロイドの存在を示す。一例として、dPBS におけるチオフラビンは、3287±580の相対蛍光単位 (RFU) の信号を生成し、マウスα− syn モノマーは4174± 158 RFU のシグナルを生成し、マウスサイズは59754± 6224 RFU のシグナルを生成した (図 5)。これと比較して、ヒトα-syn モノマーは、マウスモノマーに対して4158± 105 RFU の同様のシグナルを生成し、ヒトサイズはマウスサイズと比較して1235967± 113747 RFU の高いシグナルを生成した (図 5)。Pelletable 細線維の存在を評価するために、沈降アッセイを行った。フィブリルは遠心分離でペレットになる。マウスとヒトのプッ試料の両方において、上清分は、上清よりもペレット中により多くのタンパク質を有するべきである (図 6)。対照的に、マウスおよびヒトモノマーからのタンパク質の大部分は、上清中に存在し、ペレット中にはほとんど存在しない (図 6)。電子顕微鏡によって目に見えて存在するサイズでは、アミロイド構造が存在し、フィブリルが pelletable、サイズはすべてのインビトロ品質管理ステップを通過した。
マウスとヒトのサイズの両方を超音波処理して、α-syn 介在物4,18に播種するための適切な長さのサイズを生成した。サイズを4μ g/μ l の所望の濃度に希釈し、超音波処理した。手術直前に、25個の代表的なフィブリルを電子顕微鏡によって画像化し、そのフィブリルサイズをスポットチェックするように測定した。超音波処理されたマウスサイズは48.8 ± 3.1 nm を測定したが、人間のサイズは52.1 ± 4.4 nm の長さを測定した。従って両方の種のサイズは、播種活性を誘導するのに適切な長さ (50 nm 以下) であった。約500の細線維のより包括的な検査は、超音波処理されたマウスフィブリルの平均長さおよび長さ分布を明らかにした。平均の長さは44.4 ± 0.6 nm であり、86.6% のサイズは 60 nm 以下を測定した (図 4)。比較して、ヒトサイズ平均55.9 ± 1.1 nm の 69.6% のサイズを 60 nm 以下で測定した (図 4)。
超音波処理したマウスサイズの intrastriatal 注射の後、先に述べたようにラットを3、5、手術後2ヶ月で加工した一連の組織切片を、ニューロンを含む封入数がピークすることが知られている。SNpc を、リン酸化α− syn 介在物5の確認のために。PSyn (物質表中の抗体) に対する免疫組織化学的染色によって示されている封入軸受ニューロンは、SNpc (図 7) 内に存在しており、線条体を innervate する脳全体の他の領域 (前方嗅覚核、運動、帯状、piriform、prelimbic、つかさどる、entorhinal、および島皮質、扁桃体、線条体)1、3、4、5、19。これらの介在物は、免疫組織化学的染色 (抗体とプロテイナーゼ K の材料表) によって示されるように、チオフラビン S の結合、総α-syn の抵抗、プロテイナーゼ K (図 7) などのレビー小体と類似した特性を共有します。.脳内での播種の確認は、インビボでの品質管理が合格したことを示し、そして以前に凍結し、同じバッチから保存されたサイズのアリコートは、同一のパラメータの下で超音波処理することができ、長さは、より大きな実験で検証した。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig1.jpg"> 図 1.Α− syn 線維の生成のための方法。Α-syn モノマーからフィブリルを製造するために必要な工程の概略モノマーは10分間遠心分離されます (15000 x g、4° c で)。上清は、清潔なチューブに移し、タンパク質濃度は、280 nm での吸光度、または BCA アッセイによって決定される。グラフはヒトおよびマウスα− syn モノマーからの濃度を示す。列はグループ平均を示し、誤差バーは平均の±1標準誤差を表します。タンパク質濃度が決定された後、α− syn モノマーを希釈し、37° c のために簡単にボルテックスしして7日間インキュベートし、1000 RPM で設定された軌道ミキサ上で振盪した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig1large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig2.jpg"> 図 2.透過型電子顕微鏡の染色方法。電子顕微鏡検査のための陰性染色の図。A)電子顕微鏡標本の格子を描写するイメージ。グリッドは、鈍いまたは明るい側面と光沢のあるまたは暗い側面を持っています。光沢のある/暗い側面は formvar/カーボンサポートフィルムによって塗られる。B)染色手順の図。グリッドは、1分間 ddH の最初のドロップで光沢のある/暗い側面を下に浮かべており、過剰は、フィルタ紙で離れて邪悪です。このプロセスは、ddH の2番目のドロップで繰り返され、サイズまたはモノマーの希釈、酢酸ウラニルの2滴、および ddH2O の2つの追加の滴が、画像化されるまでグリッドボックスに格納され得る。スケールバー = 3 mm<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig3.jpg"> 図 3.カスタムガラス針シリンジの組み立て。ガラス針付属シリンジを組み立てるために必要な工程の図。シリコン処理ガラスの毛管管は引っ張られ、ガラス針を作り出すために中間で切られる。シュリンクラップチューブは、金属製の針を準備し、ガラスの針が金属の針にスライドしたときに内側のシールを形成するために使用されます。ガラスの針と金属の針の基部に重なるシュリンクラップチューブの2つの追加の層を連続して添加し、熱を加えてガラスの針を固定し、水の詰まったシールを形成します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig3large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig4.jpg"> 図 4.透過型電子顕微鏡によるα syn モノマーおよびα-syn 線維の可視化Α-syn モノマーおよびフィブリルの代表的な顕微鏡写真。トップパネル: マウスとヒトα-syn モノマー。ミドルパネル: 全長マウスとヒトα-syn サイズパネル: 超音波処理後のマウスとヒトα-syn サイズ。ボトムグラフ: 超音波処理したマウスおよびヒトα-syn プッの分布。スケールバー = 500 nm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig4large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig5.jpg"> 図 5.チオフラビン T アッセイによるアミロイド構造の確認マウスおよびヒトα-syn モノマーおよびプッサンプルからの蛍光シグナルの測定左: マウスα-syn モノマーとα-syn サイズからの結果。右: ヒトα syn モノマーおよびα-syn サイズの結果DPBS ネガティブコントロールが各グラフに表示されます。すべての測定値は、相対蛍光単位 (RFU) で表されます。列はグループ平均を示し、誤差バーは平均の±1標準誤差を表します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig5large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig6.jpg"> 図 6.Pelletable α-synの沈降アッセイ。クマシー染色されたゲルからの画像.示されているバンドは蛋白質の梯子に基づいておよそ 14 kDa にある。左: マウスのモノマーとサイズ。右: ヒトモノマーおよびサイズ。すべてのモノマーおよびプッ試料について、再懸濁ペレット (P) および上清 (S) が示されている。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig6large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig7.jpg"> 図 7.Α-syn 病理を確認するラットモデルにおける介在物の特徴黒質の顕微鏡写真の代表者は、注射後2ヶ月でやした。左: pSyn と対比染色を含むニューロンクレシルバイオレットバイオレット.中央: チオフラビン S 陽性ニューロン.右: プロテイナーゼの K. スケールバーに対して抵抗力がある (α) syn を含んでいる介在物 = 50 μ m。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig7large.jpg" target="_blank">こちらをクリックして、この図の大規模なバージョンをご覧ください。</a>

本稿の目的は、単量体α-シヌクレインからのフィブリルの生成に必要なステップ、その後の品質管理、およびインビボで予備成形されたフィブリルの使用について概説することである。

Use of the in vivo alpha-synuclein preformed fibril (&#945;-syn PFF) model of synucleinopathy is gaining popularity among researchers aiming to model ...

アルファ-シヌクレイン前形成フィブリルモデルは、シヌクレノパチーを研究するために世界中の研究室で使用されています。このモデルは多くの研究室でうまく使用されていますが、一部のグループではフィブリルを生成し、一貫したα-シヌクレイン病理を産生する矛盾を経験しています。我々は、α-シヌクレイン単量体からのフィブリルの生成と生体内での事前形成されたフィブリルの使用を詳述するこのプロトコルが、研究者がモデルの使用に関して持っている質問に答えることができることを願っている。Α-シヌクレイン前形成フィブリルモデルは、α-シヌクレイン病理および神経変性などのパーキンソン病の主要な特徴を再現する。そして、それはいくつかの動物モデルで控えめな運動障害につながることを示されています。リン酸化α-シヌクレインおよび神経変性に向けた長引く時間経過を含む封入物の形成は、研究者にシヌクレノパシーの進行を通じて異なる段階を提供し、潜在的な治療介入の研究および標的となる。カスタムガラス針の準備を実証する、私たちのラボ技術者、クリストファー・ケンプです。この手順を開始するには、氷の上にアルファシヌクレインモノマーを解凍します。チューブを軽くフリックして解凍したモノマーを再びサスペンしました。そして、15,000gと摂氏4度で10分間遠心分離機。次いで、上清をクリーンな1.5mLマイクロ遠心管に移し、移された量を記録する。1x dPBSでモノマーを希釈し、1mL当たり5mgの最終濃度にします。短く渦を混合し、かつ簡単に遠心分離機をチューブの底にある液体のすべてを収集する。次に、粘着フィルムを用いてマイクロ遠心チューブ蓋を密閉する。1,000 rpmで振りながら、37°Cで7日間蓋をした軌道サーモミキサーにチューブを入れます。7日間の終わりに、チューブの内容物は濁って見えるはずです。まず、手袋、ラボコート、フェイスシールドなど、必要な個人用保護具をすべて着用してください。次に、細胞培養フードに、直径3.2mmのプローブをコンバーターに取り付けます。超音波処理器の振幅を30%に設定し、パルスを1秒、1秒オフ、時間を1分に設定します。常温でフィブリルを解凍し、培養フードに残っている間に、滅菌dPBSでフィブリルを希釈する。次に、70%エタノールでラボ組織を湿らせた後、これを使用して超音波処理器のプローブを拭いてきれいにします。プローブの先端を二重の歪んだ水に沈め、パルスを10回にしてプローブをさらに洗浄します。この後、プローブをラボ組織で拭き取ります。洗浄したプローブチップを希釈したフィブリルのチューブに入れ、先端をチューブの底に置きます。液体中のすべてのフィブリルが超音波処理されるように、各パルスの間にプローブを上下に動かしながら、以前に設定されたパラメータを使用して希釈されたフィブリルを超音波処理します。超音波処理の後、チューブの側面からすべての液体を収集するために2,000 gで1秒間の短い遠心分離。プローブチップを1%SDSに沈め、パルスを10回パルスしてプローブを洗浄します。その後、SDSから先端を取り出し、二重蒸留水に沈め、10回パルスします。70%エタノールで湿らせたラボ組織でプローブを拭き、乾燥したラボ組織で乾燥させて拭きます。プローブをコンバーターからデタッチし、ストアを保管します。この後、フード内のすべての表面を1%SDSで拭き取り、その後に70%エタノールを使用します。まず、シリコンガラスキャピラリーチューブをガラス針の引き手に入れます。発熱体をオンにし、取り付けた重みを加熱したガラスキャピラリーチューブに伸ばします。次に、はさみを使用して、中央の最も薄いポイントで引っ張られたガラスの毛細管チューブを切断し、ガラス針の引き手からガラス針を取り除きます。その後、はさみを使用してシュリンクラップチューブの長さを約40mmにカットします。10マイクロリットルのベベリングシリンジの金属針の上にシュリンクラップをスライドさせます。開いた炎を使用して、針にシュリンクラップを加熱し、加熱を均等に適用するために針を回転させます。引っ張られたガラスの針の大きな端をシリンジの金属針の上に注意深くスライドさせます。その後、シュリンクラップチューブの長さを約40mmにカットし、ガラス針の上に慎重にスライドさせて、ガラス針のベースとシリンジの金属針を重ね合わせています。開いた炎を使用してシュリンクラップを加熱し、ガラス針を金属針に固定します。さらに針を固定し、潜在的な漏れを防ぐために、約40mmにシュリンクラップチューブの追加の長さをカットし、慎重にガラス針の上にスライドさせて、ガラス針のベースとシリンジの金属針を重ね合わせて下さい。開いた炎を使用してシュリンクラップを加熱し、ガラス針を金属針に固定します。その後、はさみを使用して、先端の長さを約8mmになるようにガラス針をトリミングします。針をテストするには、1 mLの注射器に26ゲージの針を取り付けて蒸留水を充填します。カスタムガラス針の注射器から金属プランジャーを取り外し、水で満たされた注射器の針をカスタムシリンジのベースに挿入します。ガラス針と金属針の界面に漏れがないか調べ、安定した水の流れを確認します。次に、マイクロ遠心管に蒸留水を充填します。カスタムガラス針注射器を使用して、蒸留水を引きます。針を点検して、液体が注射器に取り込まれ、泡がないことを確認します。気泡がある場合、または水が針に引き込まれていない場合は、針をトリミングすると圧力を軽減することができます。この後、慎重に手術に必要なまで、付属のガラス針で注射器をシリンジボックスに保管してください。透過電子顕微鏡による検査は、長いフィブリルの存在を確認する。それに比べて、α-シヌクレインモノマーは目に見える大麦であり、識別可能な形状を有しない。次に、フィブリルのアナロイド確認がチオフラビンTアッセイを使用して確認されます。代表的なアッセイは、dPBSおよびマウスモノマーがマウスPfFFsと比較して相対的な小麦粉単位で低い信号を生成することを示す。人間のPfFは同様にモノマーよりも高い信号を生成するが。ペリチブルフィブリルの存在をアセシングするために、沈積アッセイが行われる。マウスとヒトの両方のPFFサンプルにおいて、上清よりも多くのタンパク質がペレットに含まれる必要があります。対照的に、マウスおよびヒトモノマーからのタンパク質の大部分は、ペレット中にほとんど存在しない上清に存在する。マウスとヒトのFPFの両方が超音波処理され、αシヌクレインインを播種するための適切な長さのPfFFを生成します。約500個のフィブリルを総合的に調べると、マウスの線維の平均長さは約44ナノメートルである。60ナノメートル以下のPPFの86.6%を有する。しかし、ヒトPfFの平均長さは約55.9ナノメートルで、Pffの69.6%は60ナノメートル以下です。PFF有効性のインビボ検査は免疫ヒストケミストリーを用いて確認される。実質的なニグラに形成された含入物は、リン酸化アルファシヌクレインを含み、アミロイド構造を含み、チオフラビンSで染色し、プロテイナーゼK消化に耐性があるという点で、レビー体と同様の特性を共有する。超音波処理は、エアロゾル化された前形成フィブリルに個々の超音波処理を公開することができます。したがって、適切な安全服装を着用し、露出のリスクを最小限に抑えるためにフードで超音波処理を行う必要があります。

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このビデオは、α-シヌクレインフィブリルをマウスに注入して神経炎症を誘発する方法を示しています。このフィブリルは、変異したα-シヌクレインタンパク質を発現するトランスジェニックマウスに腹腔内に注入されます。中枢神経系に到達すると、原線維はニューロンに入り、変異したタンパク質の凝集を誘導します。凝集体は、隣接するニューロン、ミクログリア、およびアストロサイトに広がります。凝集体の認識は、ミクログリアが神経炎症を誘発し、ニューロンを損傷する引き金となります。...

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タンパク質は、天然構造を採用するか、不溶性アミロイドに誤って折り畳まれる可能性があります。ミスフォールディング経路に有利な条件は、さまざまな種類のアミロイド線維の形成につながります。ここで説明する方法は、in...

天然のタンパク質からアミロイドの迅速な生成<em&gt;インビトロ</em

ELISAが新しい定量的アプローチを提供することが説明されています。それは、シヌクレイノパシーのマウスモデル（M83）において、Ser129リン酸化されたα-シヌクレイン（αSD）またはタンパク質のC末端部分に対する抗体を用いて、疾患に関連するα-シヌクレインを特異的に検出します。...

人間A53T変異αシヌクレインを過剰発現するトランスジェニックマウスの脳における強化ELISAによる疾患関連αシヌクレインの検出

ここでは、死後のヒト脳組織からますます不溶性/凝集したα-シヌクレイン（α-syn）を単離するためのプロトコルを提示します。界面活性剤強度が増大するバッファーと高速超遠心分離技術の利用により、疾患組織および非疾患組織におけるα-syn凝集の変動特性を調べることができます。...

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α-シヌクレイン線維の末梢接種後のトランスジェニックマウスにおける神経炎症の生物発光イメージング

このプロトコルの目的は、生体内でα-シヌクレインの形成を複製するセルベースのシステムを集約を提供することです。細胞内の α-シヌクレイン介在物は一次ニューロンに内面化することによって播かれ、伝搬の外因性投与罹患 α-シヌクレイン遺伝子組換えマウスから隔離されたネイティブのミクロソームによる...

線維形成の強力な細胞モデルとして α-シヌクレインのミクロソーム関連付けられた集計一次ニューロンの外因性投与

ここでは、一次マウスドーパミンニューロンにおけるニューロンα-シヌクレイン蓄積を研究するための詳細なプロトコルを提示する。リン酸化されたα-シヌクレイン凝集体は、ニューロン内で、あらかじめ形成されたα-シヌクレイン線維で誘導される。免疫蛍光標識細胞の自動イメージングと偏りのない画像解析により、この堅牢なプロトコルは、α-シヌクレイン蓄積を阻害する薬剤の中~高スループットスクリーニングに適しています。...

原発性胚マウス中脳ドーパミンニューロンにおける前形成線維誘導α-シヌクレイン蓄積の研究

パーキンソン病の病態を研究・理解するためには、α-シヌクレインの in vivo...

ヒト化酵母モデルを用いたα-シヌクレインの毒性と凝集の研究法

本プロトコルは、α−シヌクレイン凝集体の鼻腔内投与の方法を記載している。この手法は、パーキンソン病における嗅粘膜から嗅球へのα-シヌクレインの伝播に関する知見を提供します。...

α-Synuclein凝集体の鼻腔内投与技術

学ぼう、αシヌクレイン予備型フィブリルの標準化された生成プロトコルと品質管理手法。モノマーからの調製、超音波処理、ガラス針の作成、そしてパーキンソン病モデルにおける生体内検証の詳細な手順を解説します。

モノマーからのαシヌクレイン予備型フィブリルの生成と生体内での使用

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