哺乳類細胞におけるCRISPRベースの遺伝子スクリーンのプール

CRISPRスクリーニングされたドロップアウトスクリーンは、ゲノム全体のレベルで連鎖機能を問い合せるためのシンプルで効率的で安価な方法を研究者に提供します。CRISPRの利点は、単にガイド配列を変更することによって任意の遺伝子を編集するその柔軟性です。CRISPRガイドライブラリは、研究者が公平で体系的な方法で1つの実験で任意の生物のゲノム全体を尋問することを可能にします。

現在、CRISPRスクリーンは、何百ものヒト癌にまたがって必須遺伝子を同定し、遺伝的相互作用をマッピングするために使用されています。スクリーンはまた、薬物を包括的にプロファイリングして、薬物の作用機序を明らかにすることもできる。ここで説明するCRISPRライブラリは、ヒト細胞を標的とする。

ただし、マウスなどの他の種を対象としたガイドライブラリも利用可能であり、同様にスクリーニングすることができます。ヒト細胞でゲノムワイドスクリーンを実行することは、数千万個の細胞の取り扱いを伴い、大量のデータセットの分析を必要とするため、実際には困難な場合があります。画面を開始する前に、細胞のラインが慎重に特徴付けられていることを確認してください。

これには、細胞株の純度、倍の時間、レンチウイルスの導入効率、抗生物質選択剤に対する感受性を知ることなどが含まれます。視覚的なデモンストレーションでは、画面に必要な数百万のセルを実際に処理し、体系的に何千もの摂動を追跡する方法の画像を提供します。手順を実証するには、アンドレア・ハブシド、カマルディープ・アウラク、ライアン・クリミー、私の研究室のすべての技術者になります。

まず、既製のCRISPR sgRNAプラスミドを電気コンピテントセルに変換し、原稿の指示に従って成長させることから始めます。コロニーを収穫する準備ができたら、各プレートにカルベニシリンを含むLBの7ミリリットルを追加し、細胞スプレッダーでコロニーを削り取ります。10ミリリットルのピペットを使用して、掻き取った細胞を無菌の1リットル円錐形フラスコに移し、5ミリリットルのLBでプレートをカルベニシリンで洗い流します。

再度、リンス溶液をフラスコに移す。原稿の方向に従って細胞を遠心分離し、次いで、湿ったペレットの重量を決定する。マキシまたはメガスケールプラスミド精製キットを使用してプラスミドDNAを精製します。

293個のT細胞を播種し、一晩インキュベートしてトランスフェクション用の細胞を調製します。翌日、3つのトランスフェクションプラスミド混合物を15センチメートルプレート用に調製します。1回のトランスフェクションに必要なプラスミドの量を計算し、プレート数にプラス1を加えて、トランスフェクションするプラスミドの混合物を作ります。

次に、トランスフェクションおよびアリコート還元血清培地ごとに、トランスフェクションされるプレート数に対して個々の1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに脂質ベースのトランスフェクション試薬を調製する。トランスフェクション試薬を加え、軽く混ぜ、室温で5分間インキュベートします。インキュベーション後、トランスフェクション試薬とDNA複合体のマイクログラムに対するトランスフェクション試薬の3対1の比率で、トランスフェクション試薬にDNAを添加する。

溶液をやさしく混ぜ、室温で30分間放置します。トランスフェクション混合物を包装細胞に加え、原稿の指示に従ってインキュベートします。ウイルス収穫の日に、良好なウイルス産生の指標として異常および融合形態の細胞をチェックし、上清を収集し、滅菌遠心分離管に移すことによってレンチウイルスを収穫する。

まず、画面全体に維持されるCRISPRガイドRNAライブラリカバレッジを選択します。ライブラリのカバレッジに基づいて、ガイドRNAあたりの維持に必要な細胞数とMOI 0.3での感染に必要な細胞数を決定します。次に、感染をセットアップするために必要なプレートの数を決定し、その後、収穫し、各プレートに細胞を播種します。

すべてのプレートにヘキサジメトリン臭化物を加え、スクリーニングに必要な量のウイルスを加え、2つのプレートを制御します。ウイルスを制御するウイルスを追加しないでください。そのボリュームをメディアに置き換えます。

プレートを傾けて十分に混ぜ、プレートをインキュベーターに入れ、レベルを確認します。原稿の方向に従って感染した細胞を収穫し、ゲノムDNA抽出のためにプールされた細胞から細胞ペレットの3つの複製を収集する。500回gで5分間遠心分離し、PBSで洗浄します。

チューブにラベルを付け、セルペレットをマイナス80°Cで凍結乾燥させます。感染した細胞のプールを 3 つのレプリケート グループに分割し、各レプリケート内でライブラリのカバレッジを維持します。細胞を拡大するときに通常使用される密度でセルをシードします。

各レプリケートに同じ数のセルを使用し、レプリケートの間に同じセルの合計数を使用します。細胞を通過し続け、最大15〜20細胞の倍増のためにプールされた感染細胞の各複製から細胞ペレットの3つの複製を収穫する。各通路で、それぞれのすべてのプレートから細胞を収穫し、互いに複製する。

各ペレットに時間をラベル付けし、指定を複製します。50マイクロリットル反応あたり3.5マイクログラムのゲノムDNAで合計100マイクログラムのゲノムDNAを持つ原稿の指示に従ってPCR1を設定し、望ましいカバレッジを達成するために同一の50マイクロリットル反応を設定します。原稿の方向に従って1つのPCRチューブ反応を設定します。

プールされた PCR1 製品の 5 マイクロリットルをテンプレートとして使用し、各サンプルに固有のインデックスプライマーの組み合わせを使用して、シーケンシング ライブラリ サンプルのプーリングを可能にします。PCRを完了した後、1〜1時間半の低電圧で2%アガロースゲルでPCRチューブ製品を実行します。青いライトのトランイルミニューターで製品を視覚化し、200ベースのペアバンドを物品化します。

分光光度計と蛍光計の両方でDNAを浄化し、その量と品質を測定します。理想的なガイドRNAライブラリは、同様の量で表されるすべての単一のガイドRNAを持っている必要があります。次世代シーケンシングを使用して、ライブラリにガイドRNAの密な分布があることを確認できます。

精密リコール分析を使用して、画面のパフォーマンスを評価できます。高性能スクリーンは、6より大きい基本因子で多数の必須遺伝子を回収し、5%未満の誤検出率を持つ必要があります精密リコール曲線は、鋭い肘と終点への直線を持っている必要があります。ベイズ因子は、遺伝子ノックアウトがフィットネスの欠陥をもたらすという信頼度測定を表します。

高いスコアは自信の向上を示し、低スコアは遺伝子ノックアウトが成長優位性を提供することを示唆している。ゲノムワイドノックアウトプールは、抑制性遺伝子を探すために過剰な薬剤の存在下で培養することができる。チミジンブロックのサプレッサーに対して正の選択画面を実行するために、T0における全ガイドRNAの正規化読み取りカウントは、チミジン処理サンプルの平均正規化読み取りカウントに対してプロットされる。

CRISPRスクリーンを正常に実行するための重要な詳細は、プラスミドのトランスフェクションから細胞の導入まで、各ガイドRNAの良好な分布を維持することです。これは、ガイドRNA表現を歪め、偽陽性または否定的な結果につながるランダムな効果の可能性を最小限に抑えます.画面検証の後、プライマリ画面では潜在的なヒットしか識別されないため、ヒットを確認するための実験を行う必要があります。

ヒットの生物学に応じて、様々な方法が使用できます。CRISPR編集は、次世代シーケンシングと組み合わせることで、多様なヒトモデルシステムにおける機能画面のゲノムスケールの損失を可能にしました。CRISPRのシンプルさのために、これらのタイプのスクリーンは現在、すべての研究者に広くアクセス可能であり、より多くの科学者が生物学的プロセスおよび疾患を研究するために機能的な遺伝的方法を利用することを可能にする。