Name: 哺乳類細胞におけるCRISPRベースの遺伝子スクリーンのプール (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 s
Description: 学ぶ哺乳類細胞におけるCRISPR-Cas9を用いたプール型遺伝子スクリーンの実験プロトコル。ゲノム規模の遺伝子機能解析と必須遺伝子の同定に有用な手法を解説します。

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この研究は、ゲノムカナダ、オンタリオ州研究基金、およびカナダ保健研究所(MOP-142375、PJT-148802)によって支援されました。

以下に概説する実験は、研究所の環境保健安全局のガイドラインに従うべきである。
1. プールされたCRISPR sgRNAレンチウイルスライブラリープラスミド増幅
<ol><li>既製のCRISPR sgRNAプラスミドDNAライブラリーをTEで50ng/μL(例えば、TKOv3)に希釈します。</li>
	<li>エレクトロコンピテントセルを使用してライブラリを電気ポレートします。以下に説明するように合計4つのエレクトロポレーション反応を設定する。<ol>
<li>氷上の予め冷やされたキュベット(1.0 mm)に解凍された電気有能な細胞の25 μLに50 ng/μL TKOライブラリの2 μLを追加します。</li>
		<li>製造元のプロトコルによって提案される最適な設定を使用して電気ポレートします。パルスの10s以内に、975 μLの回収媒体(またはSOC培地)をキュベットに加えます。</li>
		<li>電ポレートされた細胞を培養管に移し、回収培地の1mLを加える。37°Cで1時間250rpmで揺れるインキュベーターでチューブをインキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ライブラリを盛り上げ、変換効率を推定するために希釈プレートを設定します。<ol>
<li>回収した細胞の全8mLをプールし、よく混ぜます。プールされた細胞の10 μLを回収媒体の990 μLに移し、800倍の希釈を行い、よく混合します。</li>
		<li>予め温められた10 cm LB +カルベニシリン(100 μg/L)寒天板に希釈のプレート20 μL。これにより、変換効率の計算に使用される変換体の 40,000 倍の希釈が行われます。</li>
		<li>各プレート上の回収細胞のプレート400 μLを、合計20個の予温められた15cm LB +カルベニシリン寒天プレートにわたってにわたって行う。30°Cで14-16時間プレートをインキュベートします。 注:この低い温度での成長は長端の反復(LTR)18間の再組み換えを最小にする。</li>
		<li>変換効率を計算するには、40,000 倍の希釈プレート上のコロニーの数をカウントします (ステップ 1.3.2)。すべてのプレート上のコロニーの合計数を取得するために、40,000 でカウントされたコロニーの数を乗算します。コロニーの合計数が sgRNA あたりの最小 200x コロニーに相当するライブラリー カバレッジを表す場合に続行します (最も最適なのは 500 ~ 1000 倍)。<ol>
<li>例えば、TKOv3ライブラリー(71,090 sgRNA)の最小コロニー数は1.4 x 107であり、sgRNA当たり200倍のコロニーに相当します。コロニー表現が不十分な場合は、希釈プレート上のコロニー数に基づいてステップ1.2のエレクトロポレーションの数を増やし、最小のライブラリーカバレッジを達成します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>以下に説明するようにコロニーを収穫<ol>
<li>各15cmプレートに、LB+カルベニシリン(100μg/L)培地の7 mLを追加し、細胞拡散機でコロニーを削り取ります。10 mLピペットを使用して、スクローした細胞を無菌1L円錐フラスコまたはボトルに移します。</li>
		<li>もう一度LB +カルベニシリン培地の5 mLでプレートをすすいで、ボトルに溶液を転送します。</li>
		<li>すべてのプレートが20枚のプレートから無菌ボトルに細胞をプールするために繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>集めた細胞を室温(RT)で1時間かき混ぜて混ぜて細胞塊を分解する。細胞を予め計量された遠心ボトルに移し、7,000 x gの遠心分離機をペレット細菌に移し、培体を廃棄する。</li>
	<li>湿った細胞ペレットを計量し、遠心分離機の重量を減算して、湿ったペレットの最終的な重量を決定します。各カラムが処理できる細菌ペレットの量に応じて、マキシまたはメガスケールのプラスミド精製キットを用いてプラスミドDNAを精製する。</li>
</ol>2. 大規模なCRISPR sgRNAライブラリーレンチウイルス産生
注: プロトコルのこのセクションのすべてのステップは、クラス II、タイプ A2 バイオセーフティ キャビネットの BSL2+ 機能で実行されます。
<ol><li>ウイルスの18 mLは、通常、1つの15センチメートルプレートから収穫される推定に基づいて、ウイルスの生産に必要な15センチメートルプレートの数を計算します。</li>
	<li></li><li></li><li></li><li> </li><li></li><li><li></li><li><li></li><li></ol><ol><li><ol><li><li></ol></li><li><ol><li></li><li><li><li> &lt;</li></ol></li><li>&lt;</li></ol><ol><li><li><li><li></li><li><li></li><li><li><li></ol><ol><li><ol><li></li><li></li></ol></li><li><ol><li><li><li><li> </li><li></li><li></ol></li><li><ol><li><li><li> <img alt="式: MOI=コントロールプレート内の総細胞÷スクリーニングあたりの総細胞数。実験的計算。" src="/files/ftp_upload/59780/59780eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> <img alt="フォールドカバレッジ式:(最終MOI×感染した細胞)÷sgRNAライブラリーサイズ。科学的計算。" src="/files/ftp_upload/59780/59780eq2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2"></li><li></li><li><li><li></ol></li><li><ol><li></li><li>&lt;</li><li></ol></li><li></li></ol><ol><li><ol><li><li><li><li><li><li></li><li> </li><li></li><li><li></li><li><li><li></li><li></ol></li><li><ol><li><li><li></li><li><li></li><li><li><li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li><li><li></li><li></li><li><li><li> </li></ol></li><li><ol><li><li> </li></ol></li></ol><ol><li><li> <img alt="遺伝データ解析のためのsgRNA式ごとの正規化されたリード、計算方法の説明。" src="/files/ftp_upload/59780/59780eq3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 3"></li><li>&lt;</li><li><https:><https:></https:></https:></li><li><li> </li></ol>

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</ol>

著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。

使用の簡易性および高い準備性のために、CRISPRの技術は精密なゲノム編集のための選択の用具として広く採用されている。プールされたCRISPRスクリーニングは、単一の実験で何千もの遺伝的摂動を尋問する方法を提供する。プールされたスクリーンでは、sgRNAライブラリは分子バーコードとして機能し、各配列は一意であり、標的遺伝子にマッピングされます。細胞集団からゲノムDNAを分離することにより、目的の表現型を引き起こす遺伝子は、次世代シーケンシングによりsgRNAの存在量を定量することによって決定することができる。サンプル中のsgRNAを定量化するために非常に並列シーケンシング法が利用されるため、複数の独立した細胞集団を同じシーケンシングレーンにプールしてコストを最小限に抑えることができます。
大規模なスクリーニングプロジェクトに着手する前に、適切に特徴付けられており、技術的に最適化されたモデルを持つことが重要です。遺伝的背景、成長速度、および経発効率は、スクリーニングのために細胞株を選択する際に重要な要因です。たとえば、成長率と編集効率によって、モデルのスケーラビリティと技術的適合性が...

CRISPR-Casは、クラスター化された定期的に間隔をあけた短いパリンドロミックリピートおよびCRISPR関連ヌクレアーゼの略で、合成ガイドRNA(sgRNA)と複合体内の単一のヌクレアーゼタンパク質(例えば、Cas9)から構成される。このリボヌクレオタンパク質複合体は、Cas9酵素を標的とし、特定のゲノム遺伝子座1で二本鎖DNA破断を誘導する。二本鎖の切断は、相同性指向修復(HDR)を介して修復することができ、より一般的には、非相同エンド結合(NHEJ)を介して、遺伝子機能を頻繁に破壊する挿入および/または欠失(INDELS)をもたらすエラーが発生しやすい修復メカニズム1.CRISPRの効率性とシンプルさは、以前のゲノム編集技術(すなわち、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZNF)または転写活性化剤様エフェクターヌクレアーゼ()をはるかに上回る、これまで達成不可能なレベルのゲノムターゲティングを可能にします。TALENS)は、いずれも設計の複雑さの増大、トランスフェクション効率の低下、多重遺伝子編集2の限界に苦しんでいる。
CRISPRシングルガイドRNAベースのゲノム編集の基礎研究アプリケーションは、科学者が効率的かつ安価に個々の遺伝子の機能と遺伝的相互作用ネットワークのトポロジーを問うことを可能にしました。機能的ゲノムワイドスクリーンを実行する能力は、特にRNA干渉(RNAi)や遺伝子トラップ変異などの以前の遺伝的摂動技術と比較した場合、CRISPR-Casシステムの使用によって大幅に強化されました。特に、RNAiは高いオフターゲット効果と不完全なノックダウンに苦しんでおり、CRISPR3、4、5に比べて感度と特異性が低く、遺伝子トラップ法はハプロイドでのみ実現可能です。機能喪失画面のセルは、尋問可能なセルモデルの範囲を制限する 6.完全な遺伝子ノックアウトを生成するCRISPRの能力は、低ノイズ、最小限のオフターゲット効果と試薬5全体の一貫した活性で、変異型の現象型を調知するためのより生物学的に堅牢なシステムを提供します。ヒトゲノム全体を標的とするCRISPR-Cas9 sgRNAライブラリーが広く利用可能となり、1回の実験で何千もの遺伝子ノックアウトを同時に生成できる3、7、8、9.
トロントノックアウト(TKO)ライブラリー(Addgeneを通じて入手可能)と呼ばれる独自のCRISPR-Cas9ゲノムワイドsgRNAレンチウイルスライブラリを開発し、高解像度機能ゲノミクススクリーンを容易にするためにコンパクトでシーケンス最適化されています。最新のライブラリTKOv3は、経験データ10を使用して効率を編集するために最適化された71,090ガイドを持つ〜18,000人のヒトタンパク質コード遺伝子を対象としています。さらに、TKOv3は、単一のベクター上でCas9およびsgRNAを発現する1成分ライブラリ(LCV2:TKOv3、Addgene ID#90294)として利用可能であり、安定したCas9発現細胞を生成する必要性を緩和し、幅広いゲノムワイドノックアウトを可能にする。哺乳類細胞型。TKOv3は、Cas9(pLCKO2::TKOv3、アディジーンID#125517)を持たないベクターでも利用可能であり、Cas911を発現する細胞で利用することができる。
ゲノム全体のCRISPR-Cas9編集細胞集団は、次世代シーケンシングによって時間の経過とともに定量化されたsgRNAの豊富さと異なる増殖条件にさらされる可能性があります。摂 動。CRISPRノックアウトライブラリーは、摂動時に細胞フィットネス欠陥を引き起こし、中程度の薬物感受性(例えば、感受性または耐性遺伝子)、タンパク質発現を調節する(例えば、レポーター)、または特定の遺伝子を同定するために利用することができる。経路機能および細胞状態12、13、14。例えば、癌細胞株における差動適合性スクリーンは、腫瘍遺伝子および濃縮の枯渇または減少または腫瘍抑制遺伝子3、14、15の増加の両方を同定することができる。同様に、治療薬の中間用量を使用すると、薬剤耐性および感量遺伝子16、17の両方を明らかにすることができる。
ここでは、ライブラリー生成からデータ解析までの哺乳類細胞におけるトロントノックアウトライブラリー(TKOv1またはv3)を用いてゲノムスケールCRISPR-Cas9の機能喪失スクリーニングのための詳細なスクリーニングプロトコルを提供します。このプロトコルは、トロントノックアウトライブラリを使用してスクリーニング用に最適化されていますが、適用でき、すべてのCRISPR sgRNAプールライブラリにスケーラブルにすることができます。

<table><tbody><tr><td>0.22ミクロンフィルター30</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>°C;Cプレートインキュベーター37</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&deg;C振盪インキュベーター37</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>°C;C、5% CO2インキュベーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Promega</td><td>V4221</td><td></td></tr><tr><td>50X TAE buffer</td><td>BioShop</td><td>TAE222.4</td><td></td></tr><tr><td>6 N 塩酸溶液</td><td>BioShop</td><td>HCL666.500</td><td></td></tr><tr><td>95% エタノール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アラマーブルー</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>DAL1025</td><td></td></tr><tr><td>ブルーライトトランスイルミネーター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン、ヒートショックアイソレーション、フラクションV.最小98%、バイオテクノロジーグレード</td><td>バイオショップ</td><td>ALB001.250</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのイーグルス修正 ミディアム</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 11995-065</td><td>セル培養培地</td></tr><tr><td>エレクトロポレーションキュベット</td><td>BTX</td><td>45-0134</td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポ</td><td>レーターBTX</td><td>45-0651</td><td></td></tr><tr><td>Enduraエレクトロコンピテントセル</td><td>Lucigen</td><td>90293</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>GIBCO</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T包装細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>推奨通過番号 <15</td></tr><tr><td>臭化ヘキサジメトリン(ポリブレン)</td><td>シグマ</td><td>H9268</td>形<td>質導入効率を高めるカチオン性ポリマー</td></tr><tr><td>臭化ヘキサジメトリン(ポリブレン)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>カルベニシリン</td><td></td><td></td><td></td>入りLB寒天プレート</tr><tr><td>カルベニシリン</td><td></td><td></td><td></td>入りLB培地</tr><tr><td>低分子量DNAラダー</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>N3233S</td><td></td></tr><tr><td>ナノドロップ分光光度計</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Q5 マスターミックス</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0544L</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td>還元血清培地</td></tr><tr><td>プラスミド マキシ精製キット</td><td>Qiagen</td><td>12963</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G (エンベローププラスミド)</td> <td>Addgene</td><td>プラスミド#12259</td><td>レンチウイルスシステム</td></tr><tr><td>psPAX2 (パッケージングプラスミド)</td><td>Addgene</td><td>プラスミド #12260</td><td>レンチウイルスシステム</td></tr><tr><td>ピューロマイシン</td><td>Wisent</td><td>400-160-UG</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick ゲル抽出キット</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR アッセイ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32853</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 蛍光光度計</td><td></td><td>Q33226</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>Invitrogen</td><td>12091021</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C 回収培地</td><td>Invitrogen</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>SYRB Safe DNA gel stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - Cas9 included</td><td>Addgene</td><td>Addgene ID #90203</td><td>Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA</td></tr><tr><td>Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - non-cas9</td><td>Addgene</td><td>Addgene ID #125517</td><td>Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA</td></tr><tr><td>Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure agarose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Wizard genomic DNA purification kit</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent</td><td>Roche</td><td>06 365 809 001</td><td>脂質ベースのトランスフェクション試薬</td></tr></tbody></table>

哺乳類細胞におけるcrisprベースの遺伝子スクリーンのプール

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

CRISPR-Casシステムを用いてゲノム編集を行い、様々な生物のゲノムを精密に編集する能力を大幅に向上させています。哺乳類細胞の文脈では、この技術は、機能的ゲノミクス研究のためのゲノム全体の遺伝的スクリーンを実行するための新しい手段を表す。すべての開いた読み取りフレームを標的とするガイドRNA(sgRNA)のライブラリは、遺伝子機能および細胞プロセスを含む特定の表現型をスクリーニングすることができる細胞の単一プール内の何千もの遺伝的摂動の顔の生成を可能にする公平で体系的な方法。CRISPR-Casスクリーンは、細胞の型示体の遺伝的青写真を明らかにするために、簡単で効率的で安価な方法を研究者に提供します。さらに、様々な細胞株や異なるがんタイプから行われるスクリーンの微分解析により、腫瘍細胞に文脈的に不可欠な遺伝子を同定し、特定の抗癌治療の潜在的な標的を明らかにすることができます。ヒト細胞でゲノム全体のスクリーンを実行することは、数千万個の細胞の処理を伴い、大規模なデータセットの分析を必要とするので、困難な場合があります。セルラインの特性認識、CRISPR ライブラリの考慮事項、解析中の CRISPR テクノロジの制限と機能の理解など、これらの画面の詳細は見落とされることがよくあります。ここでは、プールされたゲノム全体のCRISPR-Cas9ベースの画面の正常なパフォーマンスのための詳細なプロトコルを提供します。

ゲノムスケールCRISPRスクリーニングワークフローの概要
図1は、単一の統合イベントと適切なライブラリ表現(通常200~1000)を確保するために、低MOIでCRISPRライブラリーレンチウイルスを持つ標的細胞の感染から始まる、プールされたCRISPRスクリーニング作業フローの概要を示しています。-フォールド)。感染後、細胞は抗生物質ピューロマイシンで処理され、トランスプリケートされた細胞を選択する。選択後、ベースラインT0細胞ペレットを収集し、スクリーニング開始時のライブラリー分布を評価します。遺伝的摂動の不均一な集団で構成される残りの細胞は、遺伝子編集と結果の効果が現れるように、15〜20倍の3〜4日ごとに所望のライブラリー表現で通過する。薬物治療を伴うスクリーンは、通常、細胞がウイルス感染およびピューロマイシン選択から回復した後、T3またはT6で追加さ...

CRISPR-Cas9技術は、あらゆる細胞型の哺乳類ゲノムを正確に編集する効率的な方法を提供し、ゲノム全体の遺伝スクリーンを実行する新しい手段を表します。プールされたゲノム全体のCRISPR-Cas9スクリーンのパフォーマンスを成功させるには必要な手順を説明する詳細なプロトコルをここで提供します。

哺乳類細胞におけるCRISPRベースの遺伝子スクリーンのプール

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

CRISPRスクリーニングされたドロップアウトスクリーンは、ゲノム全体のレベルで連鎖機能を問い合せるためのシンプルで効率的で安価な方法を研究者に提供します。CRISPRの利点は、単にガイド配列を変更することによって任意の遺伝子を編集するその柔軟性です。CRISPRガイドライブラリは、研究者が公平で体系的な方法で1つの実験で任意の生物のゲノム全体を尋問することを可能にします。現在、CRISPRスクリーンは、何百ものヒト癌にまたがって必須遺伝子を同定し、遺伝的相互作用をマッピングするために使用されています。スクリーンはまた、薬物を包括的にプロファイリングして、薬物の作用機序を明らかにすることもできる。ここで説明するCRISPRライブラリは、ヒト細胞を標的とする。ただし、マウスなどの他の種を対象としたガイドライブラリも利用可能であり、同様にスクリーニングすることができます。ヒト細胞でゲノムワイドスクリーンを実行することは、数千万個の細胞の取り扱いを伴い、大量のデータセットの分析を必要とするため、実際には困難な場合があります。画面を開始する前に、細胞のラインが慎重に特徴付けられていることを確認してください。これには、細胞株の純度、倍の時間、レンチウイルスの導入効率、抗生物質選択剤に対する感受性を知ることなどが含まれます。視覚的なデモンストレーションでは、画面に必要な数百万のセルを実際に処理し、体系的に何千もの摂動を追跡する方法の画像を提供します。手順を実証するには、アンドレア・ハブシド、カマルディープ・アウラク、ライアン・クリミー、私の研究室のすべての技術者になります。まず、既製のCRISPR sgRNAプラスミドを電気コンピテントセルに変換し、原稿の指示に従って成長させることから始めます。コロニーを収穫する準備ができたら、各プレートにカルベニシリンを含むLBの7ミリリットルを追加し、細胞スプレッダーでコロニーを削り取ります。10ミリリットルのピペットを使用して、掻き取った細胞を無菌の1リットル円錐形フラスコに移し、5ミリリットルのLBでプレートをカルベニシリンで洗い流します。再度、リンス溶液をフラスコに移す。原稿の方向に従って細胞を遠心分離し、次いで、湿ったペレットの重量を決定する。マキシまたはメガスケールプラスミド精製キットを使用してプラスミドDNAを精製します。293個のT細胞を播種し、一晩インキュベートしてトランスフェクション用の細胞を調製します。翌日、3つのトランスフェクションプラスミド混合物を15センチメートルプレート用に調製します。1回のトランスフェクションに必要なプラスミドの量を計算し、プレート数にプラス1を加えて、トランスフェクションするプラスミドの混合物を作ります。次に、トランスフェクションおよびアリコート還元血清培地ごとに、トランスフェクションされるプレート数に対して個々の1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに脂質ベースのトランスフェクション試薬を調製する。トランスフェクション試薬を加え、軽く混ぜ、室温で5分間インキュベートします。インキュベーション後、トランスフェクション試薬とDNA複合体のマイクログラムに対するトランスフェクション試薬の3対1の比率で、トランスフェクション試薬にDNAを添加する。溶液をやさしく混ぜ、室温で30分間放置します。トランスフェクション混合物を包装細胞に加え、原稿の指示に従ってインキュベートします。ウイルス収穫の日に、良好なウイルス産生の指標として異常および融合形態の細胞をチェックし、上清を収集し、滅菌遠心分離管に移すことによってレンチウイルスを収穫する。まず、画面全体に維持されるCRISPRガイドRNAライブラリカバレッジを選択します。ライブラリのカバレッジに基づいて、ガイドRNAあたりの維持に必要な細胞数とMOI 0.3での感染に必要な細胞数を決定します。次に、感染をセットアップするために必要なプレートの数を決定し、その後、収穫し、各プレートに細胞を播種します。すべてのプレートにヘキサジメトリン臭化物を加え、スクリーニングに必要な量のウイルスを加え、2つのプレートを制御します。ウイルスを制御するウイルスを追加しないでください。そのボリュームをメディアに置き換えます。プレートを傾けて十分に混ぜ、プレートをインキュベーターに入れ、レベルを確認します。原稿の方向に従って感染した細胞を収穫し、ゲノムDNA抽出のためにプールされた細胞から細胞ペレットの3つの複製を収集する。500回gで5分間遠心分離し、PBSで洗浄します。チューブにラベルを付け、セルペレットをマイナス80°Cで凍結乾燥させます。感染した細胞のプールを 3 つのレプリケート グループに分割し、各レプリケート内でライブラリのカバレッジを維持します。細胞を拡大するときに通常使用される密度でセルをシードします。各レプリケートに同じ数のセルを使用し、レプリケートの間に同じセルの合計数を使用します。細胞を通過し続け、最大15〜20細胞の倍増のためにプールされた感染細胞の各複製から細胞ペレットの3つの複製を収穫する。各通路で、それぞれのすべてのプレートから細胞を収穫し、互いに複製する。各ペレットに時間をラベル付けし、指定を複製します。50マイクロリットル反応あたり3.5マイクログラムのゲノムDNAで合計100マイクログラムのゲノムDNAを持つ原稿の指示に従ってPCR1を設定し、望ましいカバレッジを達成するために同一の50マイクロリットル反応を設定します。原稿の方向に従って1つのPCRチューブ反応を設定します。プールされた PCR1 製品の 5 マイクロリットルをテンプレートとして使用し、各サンプルに固有のインデックスプライマーの組み合わせを使用して、シーケンシング ライブラリ サンプルのプーリングを可能にします。PCRを完了した後、1〜1時間半の低電圧で2%アガロースゲルでPCRチューブ製品を実行します。青いライトのトランイルミニューターで製品を視覚化し、200ベースのペアバンドを物品化します。分光光度計と蛍光計の両方でDNAを浄化し、その量と品質を測定します。理想的なガイドRNAライブラリは、同様の量で表されるすべての単一のガイドRNAを持っている必要があります。次世代シーケンシングを使用して、ライブラリにガイドRNAの密な分布があることを確認できます。精密リコール分析を使用して、画面のパフォーマンスを評価できます。高性能スクリーンは、6より大きい基本因子で多数の必須遺伝子を回収し、5%未満の誤検出率を持つ必要があります精密リコール曲線は、鋭い肘と終点への直線を持っている必要があります。ベイズ因子は、遺伝子ノックアウトがフィットネスの欠陥をもたらすという信頼度測定を表します。高いスコアは自信の向上を示し、低スコアは遺伝子ノックアウトが成長優位性を提供することを示唆している。ゲノムワイドノックアウトプールは、抑制性遺伝子を探すために過剰な薬剤の存在下で培養することができる。チミジンブロックのサプレッサーに対して正の選択画面を実行するために、T0における全ガイドRNAの正規化読み取りカウントは、チミジン処理サンプルの平均正規化読み取りカウントに対してプロットされる。CRISPRスクリーンを正常に実行するための重要な詳細は、プラスミドのトランスフェクションから細胞の導入まで、各ガイドRNAの良好な分布を維持することです。これは、ガイドRNA表現を歪め、偽陽性または否定的な結果につながるランダムな効果の可能性を最小限に抑えます.画面検証の後、プライマリ画面では潜在的なヒットしか識別されないため、ヒットを確認するための実験を行う必要があります。ヒットの生物学に応じて、様々な方法が使用できます。CRISPR編集は、次世代シーケンシングと組み合わせることで、多様なヒトモデルシステムにおける機能画面のゲノムスケールの損失を可能にしました。CRISPRのシンプルさのために、これらのタイプのスクリーンは現在、すべての研究者に広くアクセス可能であり、より多くの科学者が生物学的プロセスおよび疾患を研究するために機能的な遺伝的方法を利用することを可能にする。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

ここでは、細胞の生存を促進する遺伝子標的を同定するために人間のLentiPlexプールされたライブラリと伝統的なシーケンシングメソッドを使用します。我々はセットアップとdeconvolute...

ミッションLentiPlexは、哺乳動物細胞ではshRNAライブラリースクリーニングをプールされた

CRISPR/Cas9は、遺伝子と遺伝的要素の破壊を生み出す堅牢なシステムです。ここでは、CRISPR/Cas9を使用して哺乳類細胞株のゲノム欠失を効率的に作成するためのプロトコルについて説明します。...

CRISPR / Cas9経由哺乳動物細胞株におけるゲノム欠失の生成

体細胞株を遺伝子操作する能力の最近の進歩は、基礎研究および応用研究の大きな可能性を秘めている。ここでは、選択マーカーを使用した場合と使用しない場合の、哺乳類細胞株におけるCRISP / Cas9生成ノックアウト産生およびスクリーニングのための2つのアプローチを提示する。...

哺乳類細胞におけるCRISPR / Cas9媒介遺伝子ノックアウトの選択依存性および独立した世代

小さいヘアピン RNA (shRNA) とホタルのルシフェラーゼとマウス細胞における x 染色体不活性化のレギュレータを識別するの次世代シーケンス ベースのプロトコルについて報告して、メチル CpG 結合蛋白質 2 (hygromycin 抵抗性遺伝子融合MeCP2)不活性 X...

プールされた shRNA MeCP2 再アクティブ化非アクティブ X 染色体上の画面

ここで我々 はプロトコルを記述する腫瘍溶解性ウイルス治療を高めるために操作することができますホスト ターゲットを明らかにするハイスループット RNAi スクリーニングを採用するため特に rhabodvirus ワクシニア...

腫瘍溶解性ウイルス治療を調節するホストの要因を識別するために全ゲノム RNAi スクリーニング

本稿では、細胞外受容体とリガンドの相互作用を同定するためのゲノムスケール細胞ベースのスクリーニングアプローチについて述べる。...

ゲノムスケールCRISPR/Cas9遺伝子スクリーンを用いた細胞表面受容体同定

ここでは、子宮胚性レンチウイルス注射で超音波誘導を使用した迅速かつ直接的なin vivo...

In Vivo CRISPR/Cas9スクリーニングによるマウス皮膚と口腔の遺伝子機能の同時評価

レンチウイルスshRNAのプールを用いたハイスループットRNA干渉(RNAi)スクリーニングは、悪性腫瘍における治療上重要な合成致死的標的を検出するためのツールとなり得る。我々は、急性骨髄性白血病(AML)におけるエピジェネティックなエフェクターを調査するために、プールされたshRNAスクリーニングアプローチを提供する。...

薬物耐性表現型を調節する因子を同定するためのプールされたshRNAライブラリースクリーニング

ゲノムワイドなCRISPR/Cas9スクリーニング法の適用により、放射線耐性および感受性遺伝子を選択するために、細心の注意を払った構造化されたアプローチが与えられています。このプロトコルは、臨床投与された化学薬品に対する耐性のメカニズムを調査する他の研究努力のための汎用性の高いフレームワークとしても役立つ可能性を秘めています。...

放射線感受性および放射線耐性遺伝子を明らかにするためのゲノムワイドCRISPRスクリーニング

本プロトコルは、マウス乳腺における並行 したin vivo...

マウス乳腺における遺伝子ノックアウトと活性化の並行 生体内 スクリーニング

学ぶ哺乳類細胞におけるCRISPR-Cas9を用いたプール型遺伝子スクリーンの実験プロトコル。ゲノム規模の遺伝子機能解析と必須遺伝子の同定に有用な手法を解説します。

哺乳類細胞におけるCRISPRベースの遺伝子スクリーンのプール

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