Name: ビオチン標識を用いてタンパク質核酸相互作用を研究するインビトロ生化学アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 学ぶビオチン標識を用いたタンパク質核酸相互作用のインビトロ生化学アッセイ。MEIOBとMOV10の精製、EMSA、ヘリカーゼ活性測定を含む手法で、特殊機器不要で1日以内に完了し、長期間の再現性を確保します。

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私たちは、P.ジェレミー・ワン(ペンシルバニア大学)に役立つ編集と議論に感謝します。また、言語編集のためのシグリッド・エッカートに感謝します。K.Z.は、中国国家主要研究開発プログラム(2016YFA0500902、2018YFC1003500)と中国国家自然科学財団(31771653)の支援を受けました。L.Y.は、中国国立自然科学財団(81471502、31871503)と江蘇省の革新的および起業家プログラムによって支援されました。浙江医科学技術プロジェクト(2019KY499)の支援を受けました。M.L.は、中国国立自然科学財団(31771588)と1000青少年人材計画の助成金によって支援されました。

1. タンパク質製剤
<ol><li>MEIOB および MOV10 式コンストラクト<ol><li>cDNA発現を生成し、マウスMEIOB-A、C、およびE(図1A)およびMOV10を符号化する。<ol>
<li>各フラグメントに対するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)反応を設定する。マウスcDNAの1 μL(C57BL/6マウス試験から)、dNTPの1μL、10μM前方プライマーの2μL、10μMの逆プライマーの2μL、DNAポリメラーゼの1μL、2x PCRバッファーの25 μL、および18 μLの二重蒸留H2 O(ddH2O)を混合する50 μLの容積。 注:MeiobおよびMov10遺伝子断片の増幅のためのプライマーは、表1にリストされている。
</li>
			<li>以下のプログラムを使用してPCR反応を行います:95°Cを5分間、15sの95°Cで35サイクルの加熱、15sの64°Cでのアニーリング、20sの72°Cでの延長(全長MOV10を延長するための2分)、および7分間の68°Cでの最終延長を行います。 注: プライマー ペア MEIOB-E (F1) と MEIOB-E-mut (R1) と MEIOB-E-mutット (F2) と MEIOB-E(R2) を使用して、3' と 5' の両端で重なり合うシーケンス内の変異シーケンスを含む 2 つのセグメントを増幅し、それぞれ変異型 PCR テンプレートを生成します。</li>
		</ol></li>
		<li>ゲル電気泳動によって増幅されたPCR DNAを分析し、必要なサイズのバンドをUVランプの下で素早くゲルから切断し、遠心管に入れます。 注:MEIOB-Aのアガロースゲルに表示される期待される製品サイズは536bp、MEIOB-Cは296bp、MEIOB-Eは312 bpおよび229 bp、MOV10は3015 bpです。</li>
		<li>製造元のプロトコルに従ってゲル抽出キットでPCR DNAを精製します。<ol>
<li>ステップ1.1.2から遠心管に同量の溶解バッファーを追加し、50-55°Cの水浴でゲルを5〜10分間溶かし、ゲル片が完全に溶けるようにします。チューブの壁から任意の液滴を収集するために簡単に遠心分離機。 注:ゲルおよび溶解バッファーの質量/体積濃度は1mg/μLです。</li>
			<li>吸着カラムを回収管に入れ、溶解したゲル断片を含む溶液を吸着カラムに移し、遠心分離機を12,000×gで2分間回す。 </li>
			<li>回収管の下部にある濾過を破棄します。カラムに600μLの洗浄バッファーを追加し、1分間12,000 x gで遠心分離機を加え、濾液を廃棄します。</li>
			<li>手順 1.1.3.3 を 1 回繰り返します。</li>
			<li>カラムを回収管に戻し、遠心分離機を12,000 x gで2分間取り除き、残りの洗浄バッファーをすべて取り除きます。</li>
			<li>吸着カラムを1.5mLの殺菌遠心管に入れ、吸着カラムの中心に50μLのddH2Oを加え、遠心分離機を1分間12,000xgで測定します。</li>
		</ol></li>
		<li>プラスミドの消化制限<ol>
<li>BamHIおよびNotIを使用してpGEX-4T-1ベクターをダイジェストする。これを行うには、pGEX-4T-1ベクターの4 μg、10倍のダイジェストバッファーの5μL、BamHIの1μL、およびNotIとddH2Oの1 μLを50μLの最終反応量に混合します。37 °Cで2時間インキュベートします。</li>
			<li>pRK5ベクターの4μg、10倍ダイジェストバッファーの5μL、BamHIの1μL、およびXhoIおよびddH2Oの1μLを50μLの最終反応体積に混合することにより、BamHIおよびXhoIを使用したダイジェストpRK5ベクトルを消化する。37 °Cで2時間インキュベートします。</li>
		</ol></li>
		<li>ゲル電気泳動によってベクターDNAを分析し、UVランプの下のメスでゲルから所望のサイズのバンドを素早く切断し、遠心管に入れます。</li>
		<li>製造元の指示に従って、ゲル抽出キットを 1.1.3 としてベクター DNA を精製します。 注:線形プラスミドの長さ:pGEX-4T-1、4.4 kb;pRK5、4.7 kb。</li>
		<li>線形化ベクターの0.03 pmol、cDNA断片の0.06 pmol、2 μLのリガーゼ、5xリガーゼバッファーの4μL、およびddH2 Oを10μLの最終反応量で組み合わせて標準的な組換えライゲーション反応を設定します。 注: MEIOB-A、C、および E を pGEX-4T-1 ベクトルにクローンし、MOV10 を pRK5 ベクトルにします。</li>
		<li>37°Cで30分間インキュベートし、その後、氷上で5分間反応を直ちに冷却します。MEIOB組換えプラスミドをBL21細菌およびMOV10組換えプラスミドをDH5α細菌に変換する。 注: サンガー シーケンスによってすべての組み換えコンストラクトを確認します。</li>
		<li>液体培養物に50%のグリセロールを同量添加して確認済みの組換えプラスミドを含む細菌培養物のグリセロールストックを調製し、-80°Cで保存する。 注:その後の実験のたびに、グリセロールストックから新鮮な寒天プレートに細菌を取り出し、ステップ1.2で説明するように、単一のコロニーを使用して拡張を行います。</li>
	</ol></li>
	<li>細菌からのMEIOBタンパク質抽出物<ol>
<li>100 μg/mLアンピシリンを含む3mL LBでシーケンシングおよび接種により検証された空または組換えpGEX-4T-1プラスミドでトランスフェクトされた各BL21株の1つのコロニーを選択します。220 rpmで振りながら37°Cで一晩成長します。</li>
		<li>3 mL の一晩培養から 100 μg/mL アンピシリンを含む 300 mL LB を接種します (ステップ 1.2.1 から)。OD600が0.5-1.0に達するまで2時間37 °Cで揺れで培養物を成長させる。</li>
		<li>イソプロピルβ-D-チオガラクピラノシド(IPTG)を0.2mMの最終濃度に添加してタンパク質発現を誘導する。180 rpmおよび18 °Cで振盪と付加的な3時間の培養物をインキュベートする。</li>
		<li>細菌培養を3,500xg、4°Cで20分間遠心分離します。 </li>
		<li>冷たいダルベッコのリン酸緩衝生理食生(DPBS)バッファーの20 mLでペレットを再中断します。短い10sのバースト(出力電力20%)の25サイクルのための氷の上の細菌の懸濁液を超音波処理続いて2-3で氷の上に置く。</li>
		<li>12,000 x gと4 °Cで15分間、ライサテを遠心分離し、すべての上清を新鮮なチューブに移します。</li>
		<li>ビーズを洗浄する前に。<ol>
<li>新鮮な15 mLチューブにグルタチオンセファローズビーズを300μL加え、10mLの氷冷PBSバッファーでビーズを洗浄します。</li>
			<li>750 x gおよび4 °Cで遠心分離機はビーズをペレットし、洗浄液を捨てる1分間。</li>
		</ol>
</li>
		<li>洗浄したビーズにライサートを加え、ビーズをペレットに1分間750xgと4°Cで2°C4°Cでインキュベートします。 ビーズを10mLの氷冷PBS 8xですすいでください。</li>
		<li>溶出バッファーの1mL(pH 8.0で50mMトリス-HClで10mMグルタチオン)6xでビーズを溶出し、各溶出工程の前に10分間4°Cでインキュベートする。750 x gおよび4 °Cで遠心分離機を1分間ビーズをペレットする。6分の1を収集し、プールします。</li>
		<li>elutedタンパク質を遠心フィルターに移し、7,500 x gの遠心分離によって濃縮し、100-200 μLの最終体積を得る。</li>
	</ol></li>
	<li>HEK293T細胞からのMOV10タンパク質抽出物<ol>
<li>培養HEK293T細胞におけるMOV10タンパク質を一過性に発現させる。<ol>
<li>MOV10-pRK5プラスミドを濃度>500 ng/μLで調製します。</li>
			<li>15 cm皿の種子HEK293T細胞。細胞密度が〜70%〜90%に達すると、細胞培養培地を10%の胎児ウシ血清(FBS)および1%ペニシリン連鎖筋ミンを含む新鮮なダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)に置き換える。</li>
			<li>1回のトランスフェクションでは、減らされた血清培地の3mLでMOV10-pRK5プラスミドDNAの60μgを希釈し、次いでトランスフェクションエンハンサー試薬の120μLを加え、よく混合する。</li>
			<li>別のチューブで減らされた血清媒の3 mLを持つトランスフェクション試薬の90 μLを希釈し(ペニシリン-ストレプトマイシンなし)とよく混合する。</li>
			<li>希釈されたトランスフェクション試薬の各チューブに希釈DNAを添加する。室温で15分間インキュベートします。</li>
			<li>トランスフェクション混合物を細胞培養に加え、〜36〜48時間培養した。</li>
		</ol>
</li>
		<li>36-48 hの後、50 mLチューブで各プレートから細胞を集集める。4 °Cで5分間500 x gの遠心分離機。各ペレットを10mLの氷冷PBSで洗浄し、500 x gで遠心分離して4°Cで5分間細胞を集めます。</li>
		<li>完全なエヒレンディアミンテトラセチン酸(EDTA)フリープロテアーゼ阻害剤カクテルを含む細胞溶解バッファーの3 mLでペレットを再中断する。氷の上で30分間インキュベートします。20,000 x gおよび 4 °C で 20 分間のリサートを遠心分離します。</li>
		<li>1.5 mLチューブに細胞の皿あたり100 μLの抗FLAG磁気ビーズを追加します。</li>
		<li>磁気ビーズをK150バッファで2倍に洗浄します(pH 7.5、150 mM KoAc、1mM DTT、0.1%NP-40)。<ol>
<li>磁気ビーズを1mLの氷冷K150バッファーに再サスペンドします。</li>
			<li>穏やかな回転で4°Cで2分間磁気ビーズをインキュベートし、磁石の助けを借りて磁気ビーズをペレットします。上清を取り除いて捨てます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>ステップ1.3.3から細胞に磁気ビーズを加え、4°Cで2時間インキュベートします。</li>
		<li>タンパク質結合磁気ビーズを K150 バッファーで 3 倍洗い、次に 250 mM NaCl を含む K150 で 2x、K150 バッファーを 1.3.5 として 3x 洗浄します。</li>
		<li>FLAG溶出バッファーの300 μL(100 mM NaCl、pH 7.5で20mMトリス-HCl、5mM MgCl 2、10%グリセロール)でビーズを再中断し、0.5 μg/μLの最終濃度にFLAGペプチドを加え、4°Cのローターにビーズをインキュベートします。磁石の助けを借りて、磁気ビーズをペレットします。</li>
		<li>ELUSE MOV10タンパク質を含む上清を回収し、濃度を決定し、将来の使用のために-80°Cで保存します。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 核酸製剤
<ol><li>適切な供給源からビオチン標識の有無にかかわらずDNAおよびRNAオリゴヌクレオチド(オリゴレオチド)を購入する。RNaseフリーddH2O~20 μMで各オリゴを希釈し、将来の使用のために-80°Cに保ちます。 注:本研究で使用されるDNA/RNA基板のオリゴ配列は表2に記載されています。</li>
	<li>MOV10ヘリケース活性アッセイに対する二本鎖RNA(dsRNA)アニール反応に対して以下の混合物を調製する:pH 7.5、6 mM KCl、0.2mM MgCl2およびRNas-Free ddHで60mM N-2-ヒドロキシチルピペラジン-N-エタンスルホニック酸(HEPES)を混合するOは20μLの最終反応量で。</li>
	<li>アニールRNAオリゴは、ビオチン標識されたトップストランド(2μM、最終濃度)とアニールバッファー内のその標識されていない相補的な底鎖の1.5倍の混合物を5分間95°Cで加熱し、ゆっくりと部屋に冷却することによってRNA二重を形成する。温度(RT)。</li>
</ol>3. インビトロ生化学アッセイ
<ol><li>EMSAと酵素反応<ol>
<li>MEIOB EMSAアッセイの場合、pH 7.5、2 mM MgCl 2、50mM NaCl、10 mM EDTA、2 mMジチオスレイトール(DTT)、0.01%NP-40、0.8mM(または図2図2図およびMEM3に示すように他の関連濃度)で50mMトリスHClを混合する。20μLの最終反応体積におけるビオチン標識オリゴヌクレオチドおよびddH2O。RTで30分間インキュベートし、反応を停止するために5xストップバッファ(125 mM EDTA、50%グリセロール)を追加します。</li>
		<li>ステップ 3.1.1 に記載されているように MEIOB ヌクレアーゼ活性反応をセットアップしますが、10 mM EDTA を添加せずに設定します。</li>
		<li>MOV10ヘリケース活性アッセイの場合は、pH 7.5で50mMトリス-HClを混合し、 20 mM KoAc,2 mM MgCl 2, 0.01% NP-40, 1 mM DTT, 2 U/μL RNase 阻害剤, 10 nM ビオチン標識 RNA 基質, 2 mM アデノシン 三リン酸 (ATP), 100 nM RNA トラップ, MOV10 タンパク質および ddH6 の 20 ng>2Oの最終反応量20μL。反応混合物を37°Cで10分、30分、60分間インキュベートし、5倍のストップバッファーを追加して反応を停止します。 注:RNAトラップは、ビオチン標識されていないオリゴを配列し、標識されたオリゴに相補性を有し、巻き戻されたdsRNAが再びアニーリングするのを防ぎます。</li>
	</ol></li>
	<li>ポリアクリルアミドゲル<ol>
<li>ゲルプレート(16 cm x 16 cm)と1.5mmの櫛を洗います。ゲル電気泳動ユニットを組み立てます。</li>
		<li>10%天然ポリアクリルアミドゲルを調製するには、 ddH2Oの14 mL、10xトリスボリン酸EDTA(TBE)の1.25 mL、30%アクリルアミドの8.3mL、グリセロール50%の1.25 mL、10%の187.5 μLの10%の新たに調製されたペルスルフェートアンモニウム(APS)、および12μLを混合するテトラメチルチレンジアミン(TEMED)。</li>
		<li>20%天然ポリアクリルアミドゲルを調製するには、ddH2Oの5.5mL、10x TBEの1.25 mL、50%グリセロールの1.25 mL、30%アクリルアミドの16.7 mL、10%APSの187.5 μL、およびTEMEDの12.5 μLを混合します。</li>
		<li>すぐにゲルにアクリルアミド溶液を注ぎ、櫛を挿入します。混合物を約30分間重合させます。</li>
	</ol></li>
	<li>ゲルランニング<ol>
<li>櫛を取り外し、電気泳動実行バッファ(0.5x TBE)でタンクを満たします。</li>
		<li>0.5x TBEバッファーでサンプルウェルをすすいでから、氷の上で100Vでゲルを30分間事前に実行します。</li>
		<li>各ウェルに20~25μLサンプルをロードします。</li>
		<li>EMSAアッセイには10%の天然アクリルアミドゲルを使用し、酵素アッセイには20%の天然アクリルアミドゲルを使用します。ブロモフェノールブルーマーカーがゲルの底分に移行するまで、氷浴で100Vで電気泳動を実行します。</li>
	</ol></li>
	<li>ゲルプレートを分解し、ローディングウェルと未使用のレーンを除去してゲルをトリミングします。ゲルを 0.5x TBE バッファーに入します。</li>
	<li>フィルターペーパーとナイロン膜をゲルの大きさに切ります。クリーンフィルターペーパーとナイロン膜をあらかじめ濡らします。</li>
	<li>転送用にスタックを組み立てます。<ol>
<li>プレウェット膜をウェット前のフィルターペーパーの上に置きます。</li>
		<li>ゲルを膜の上に置きます。</li>
		<li>ゲルを別のウェルトフィルターペーパーで覆います。</li>
		<li>クリーンなピペットを中心から端まで転がして、すべての気泡を取り除きます。</li>
	</ol></li>
	<li>90 mAで半乾燥電気泳動装置でゲルから膜にサンプルを20分間移します。</li>
	<li>転写を停止し、新しいフィルターペーパーで膜を1分間乾燥させます。</li>
	<li>254 nm電球(自動架リンク機能)を装備したUV光架リンカーで45-60sの120 mJ/cm2で膜を照射することにより、サンプルを架光します。RTで膜を30分間乾燥させます。</li>
	<li>化学発光検出<ol>
<li>プロトコル1:市販の化学発光核酸検出キットの標準体積を使用する。<ol>
<li>膜に20 mLのブロッキングバッファーを追加し、20-25 rpmで回転子に穏やかな揺れで15〜30分間インキュベートします。</li>
			<li>66.7 μL安定化ストレプトアビジン-ワサビ酸ペルオキシダーゼコンジュゲートを20mLのブロッキングバッファーに加えてコンジュゲート/ブロッキングバッファー溶液を調製する。</li>
			<li>ブロッキング バッファをゆっくりと取り外し、コンジュゲート/ブロッキング バッファに置き換えます。20-25 rpmで回転子で15分間インキュベートします。</li>
			<li>40-45 rpmで5分間振って膜を4倍洗います。</li>
			<li>膜に基板平衡バッファーの30 mLを追加します。20-25 rpmで振って5分間膜をインキュベートします。</li>
			<li>安定な過酸化物溶液の6 mLにルミノール/エンハンサー溶液の6 mLを添加することにより、基板作業溶液を調付します。光を避けてください。</li>
			<li>基板加工液で膜の表面全体を覆い、5分間インキュベートします。</li>
			<li>化学発光イメージングシステムで膜を1-3sでスキャンします。</li>
		</ol>
</li>
		<li>プロトコル2:2倍希釈市販の化学発光核酸検出キットを使用し、手順3.10.1.1-3.10.1.8に従ってください。</li>
		<li>プロトコル 3: 自作試薬6を使用します。<ol>
<li>ブロッキング バッファーを準備する: pH 7.5、0.1 M NaCl、2 mM MgCl2、および 3% ウシ血清アルブミンフラクション V. AP 7.5 バッファー: pH 7.5、0.1 M NaCl、および 2 mM MgCl2で 0.1 M Tris-HCl を混合します。AP 9.5 バッファ: pH 9.5、0.1 M NaCl、および 50 mM MgCl2で 0.1 M トリス-HCl を混在させます。TE バッファ: pH 8.0 で 10 mM トリス-HCl を混合し、pH 8.0 で 1 mM EDTA を混在かします。</li>
			<li>1時間30°Cでブロッキングバッファーに膜を浸します。</li>
			<li>AP 7.5 バッファーの 10 mL にストレプトアビジンアルカリホスファターゼの 8.5 μL を追加します。この溶液中の膜をRTで10分間ゆっくり振ります。次いで、AP 7.5バッファーの15mLで膜2xを10分間洗浄する。</li>
			<li>AP 9.5バッファーの20 mLで膜をもう一度10分間洗い、反応を止めるためにTEバッファーの20 mLを追加します。</li>
			<li>7.5 mLの開発溶液を膜上に加え、1-3sの化学発光イメージングシステムで膜をスキャンします。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

利益相反は宣言されていません。

タンパク質と核酸の相互作用を調べると、多様な生物学的プロセスの基礎となる分子メカニズムを理解するうえで重要です。例えば、MEIOBは、哺乳類25、26、27におけるマイオシスおよび不妊に不可欠な精巣特異的タンパク質である。MEIOBは、一本鎖DNAに結合するOBドメインを含み、3'〜5'エキソヌクレアーゼ活性26を示し、これは、メオティック再組換え時の生理的関連性に直接関連する。別の例として、MOV10は、RNA二次構造16と関連しきうるユビキタス機能を有するRNAヘリケースである。したがって、MOV10は広範なRNA結合特性と5'〜3'RNA二重巻き戻し活性16を表示する。これらのタンパク質の上記の生化学的活性を報告する研究は、インビトロアッセイ用の核酸を標識する32P同位体の使用に依存...

タンパク質-核酸相互作用は、DNA修復、複製、転写、RNA処理、翻訳などの多くの必須細胞プロセスに関与しています。クロマチン内の特定のDNA配列とのタンパク質相互作用は、転写レベル1における遺伝子発現の厳密な制御のために必要とされる。多数のコードおよび非コードRNAの正確な転写後調節は、任意のタンパク質とRNA2との間の広範で複雑な相互作用を必要とする。遺伝子発現調節機構のこれらの層は、転写/エピジェネティック因子またはRNA結合タンパク質の相互作用によって調整される動的分子間イベントのカスケードを含み、ならびにその核酸標的とのRNA結合タンパク質とタンパク質とタンパク質の相互作用。生体内のタンパク質が直接または間接的に核酸と関連しているかどうかを調べるために、そのような関連がどのように起こり、終わるかを調べるために、インビトロ生化学アッセイを行い、目的のタンパク質の結合親和性または酵素活性を調べるために実施される。DNAおよび/またはRNAの設計された基板。
電気泳動性シフトアッセイ(EMSA)を含む核酸タンパク質複合体を検出し、特徴付けるために多くの技術が開発され、ゲル遅滞アッセイまたはバンドシフトアッセイ3、4、5とも呼ばれる.EMSAは、核酸とのタンパク質の直接結合を研究するために広く使用されている汎用性と敏感な生化学的方法です。EMSAは、ビオチン標識6、7、蛍光標識8、9、またはによって検出するために化学発光を使用して日常的に視覚化されるバンドのゲル電気泳動シフトに依存しています。放射性32Pラベルの自動無線撮影10,11.生化学的研究の他の目的は、核酸基質からの切断産物を評価するヌクレアーゼベースの反応などのタンパク質の核酸処理活性の同定と特徴付けである12、13歳,14およびDNA/RNA構造アンワインディングアッセイは、ヘリケース活性を評価する15、16、17.
このような酵素活性アッセイでは、放射性同位体標識または蛍光色素標識核酸は、その高感度のために基質として使用されることが多い。32P標識放射トレッサーを含む酵素反応の放射線写真の分析は、敏感で再現可能であることが判明した18.しかし、世界で増加する研究室では、放射性同位体の使用は、潜在的な暴露に関連する健康上のリスクのために制限または禁止されています。バイオセーフティの懸念に加えて、放射性同位体、必要な放射能ライセンス、32Pの短い半減期(約14日間)、およびプローブ品質の徐々な劣化を行うために必要な機器が他に必要です。放射線を通して従って、代替の非同位体法が開発されている(すなわち、蛍光球でプローブを標識することで蛍光イメージング19による検出を可能にする)。しかし、蛍光標識プローブを使用する場合は、高解像度のイメージングシステムが必要です。一般的に使用される標識であるビオチンは、タンパク質や核酸などの生体高分子に容易に結合します。ビオチン連鎖生物ビンシステムは効率的に動作し、非特異的な背景20、21を増加させることなく検出感度を向上させます。EMSAに加えて、ビオチンはタンパク質精製およびRNAプルダウンに広く使用され、その中で22、23、24である。
このプロトコルは、ビオチンが一般的に使用されていない酵素反応に加えて、EMSAを含むインビトロ生化学アッセイの基質としてビオチン標識核酸を使用することに成功しました。MEIOB OBドメインが構築され、2つの変異体(切り捨ておよび点突然変異)は、GST融合タンパク質25、26、27、ならびにマウスMOV10組換えFLAG融合タンパク質16として発現される。本報告では、タンパク質精製およびビオチン標識アッセイに対するこの組み合わせプロトコルの有効性を強調する。

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>エッペンドルフ、ドイツ</td><td>5242R</td><td></td></tr><tr><td>化学発光イメージングシステム</td><td>タノン、中国</td><td>5200</td><td></td></tr><tr><td>デジタルソニファー</td><td>ブランソン、アメリカ</td><td></td><td>BBV12081048A 450ワット; 50/60 HZ</td></tr><tr><td>セミドライ電気泳動ブロッター</td><td>ホーファー、アメリカ</td><td>TE77XP</td><td></td></tr><tr><td>チューブリボルバー&nbsp;</td><td>Crystal, USA</td><td>3406051</td><td></td></tr><tr><td>UV光架橋剤</td><td>UVP, USA</td><td>CL-1000</td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter&nbsp;</td><td>ミリポア、米国</td><td>UFC801096</td><td>4 ml/10 K</td></tr><tr><td>ナイロン膜</td><td>Thermo Scientific、米国</td><td>TG263940A</td><td></td></tr><tr><td>TC-treated Culture Dish</td><td>Corning, USA</td><td>430167</td><td>100 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>TC処理されたカルチャーディッシュ</td><td>コーニング、米国</td><td>430597</td><td>150 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>マイクロチューブチューブ</td><td>AXYGEN, USA</td><td>MCT-150-C</td><td>1.5 mL&nbsp;</td></tr><tr><td>米国</td><td>コーニング</td><td>430791チューブ 15</td><td>mL</td></tr><tr><td><強力>試薬&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>SunShine Bio, China</td><td>8h288h28</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2 magnetic beads</td><td>Sigma, USA</td><td>M8823</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>591136</td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit</td><td>Beyotime, China</td><td>C3206</td><td></td></tr><tr><td>CelLyticTM M Cell Lysis試薬&nbsp;</td><td>シグマ、米国</td><td>107M4071V</td><td></td></tr><tr><td>ClonExpress IIワンステップクローニングキット&nbsp;</td><td>Vazyme, China</td><td>C112</td><td></td></tr><tr><td>Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Kit</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>T1269950</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>DNTP100-1KT</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco, USA</td><td>10569044</td><td></td></tr><tr><td>DPBS buffer</td><td>Gibco, USA</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen, USA</td><td>AM9260G</td><td>0.5 M</td></tr><tr><td>EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>ロシュ、米国</td><td>04693132001</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Maxi Plasmid Kit&nbsp;</td><td>Vazyme, 中国</td><td>&nbsp; DC202</td><td></td></tr><tr><td>FastPure ゲル DNA 抽出ミニキット</td><td>Vazyme, China</td><td>DC301-01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco, USA</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>FLAG peptide</td><td>Sigma, USA</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma, USA</td><td>SHBK3676</td><td></td></tr><tr><td>GST Bulk Kit</td><td>GE Healthcare, USA</td><td>27-4570-01</td><td></td></tr><tr><td>HEPES buffer</td><td>Sigma, アメリカ</td><td>SLBZ2837</td><td>1 M&nbsp;</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>34060</td><td></td></tr><tr><td>KoAc</td><td>Sangon Biotech, China</td><td>127-08-02</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamin 3000 Transfection Reagent</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>L3000001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Invitrogen, USA</td><td>AM9530G</td><td>1 M</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Invitrogen, USA</td><td>AM9759 &nbsp;</td><td>5メートル&nbsp;</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Amresco, USA</td><td>M158-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM medium</td><td>Gibco, USA</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco, USA</td><td>10010023</td><td>PH 7.4</td></tr><tr><td>RNase Inhibitor</td><td>Promega, USA</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin アルカリホスファターゼ</td><td>Promega, USA</td><td>V5591</td><td></td></tr><tr><td>TBE</td><td>Invitrogen, USA</td><td>15581044</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCIバッファ&nbsp;</td><td>Invitrogen, USA</td><td>15567027</td><td>1 M, PH 7.4</td></tr><tr><td>Tris-HCI バッファー&nbsp;</td><td>Invitrogen, USA</td><td>15568025</td><td>1 M, PH 8.0</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sangon Biotech, China</td><td>A600560</td><td></td></tr></tbody></table>

ビオチン標識を用いてタンパク質核酸相互作用を研究するインビトロ生化学アッセイ

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

タンパク質と核酸の相互作用は、転写、組み換え、RNA代謝などの生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たします。タンパク質と核酸の相互作用を研究する実験的方法では、蛍光タグ、放射性同位体、またはその他の標識を使用して特定の標的分子を検出して分析する必要があります。非放射性核酸標識であるビオチンは、電気泳動性シフトアッセイ(EMSA)で一般的に使用されていますが、核酸プロセス中のタンパク質活性を監視するために定期的に使用されていません。このプロトコルは、インビトロ酵素反応中のビオチン標識の有用性を示し、このラベルがさまざまな生化学アッセイの範囲でうまく機能することを実証する。具体的には、放射性同位体32P標識基質を用いたこれまでの知見と整合して、MEIOB(特異的にマイオティック組換えに関与するタンパク質)がDNA結合タンパク質であるビオチン標識EMSAを介して確認され、そのMOV10(RNAヘリケース)は、ビオチン標識RNA二重構造を解決し、MEIOBがビオチン標識された一本鎖DNAを切断します。本研究は、ビオチンが様々な核酸関連生化学アッセイで32Pをインビトロで置換できることを示している。

MEIOBのタンパク質構造と本研究で用いられる発現構造体を図1Aに示す。MEIOBのOBフォールドは、一本鎖核酸を認識し、相互作用することができるコンパクトなバレルのような構造です。OBドメインの1つ(aa 136-307、構築A)は、一本鎖DNA(ssDNA)、切り捨てられたタンパク質(aa 136-178切り捨て、構築C)およびMEIOBの点変異形態(R235A突然変異、構築E)を結合するDNA結合活性26を有しない。GST-MEIOB融合タンパク質はBL21細菌で過剰発現し、その後の単離工程により、クーマッシーブルー染色およびウェスタンブロット解析によって示される精製タンパク質が得られた(図1B)。異なる濃度の核酸基質は、ビオチンシグナルの高感度を示し、1〜3s(図2A)に対する比較的短い露光時間の後に1nMオリゴの検出可能なシグナル<st...

ここに示すビオチン標識を用いてインビトロ生化学アッセイを用い、タンパク質-核酸相互作用の研究に広く適用可能なプロトコルを示す。

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

このプロトコルは、堅牢で信頼性が高く、効率的で手頃な価格であることが証明されたタンパク質-核酸相互作用の研究のためのビオチン標識プラットフォームを提供します。ビオチン標識核酸の同じバッチを長期間にわたって使用することができ、実験の再現性を維持する。最後に、ここで説明するすべてのビオチン標識アッセイは1日以内に実行でき、特別な装置を必要としません。この手順のデモンストレーションは、当研究室の大学院生であるリナ・ユーです。MEIOBおよびMOV10の構造を準備し、適切な細菌に変える。MEIOBを抽出するには、遠心分離を介して細胞をペレットし、氷冷ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、またはDPBSバッファーの20ミリリットルでそれらを再懸濁します。氷の上の細菌の懸濁液を超音波処理します。次いで、12,000回gと摂氏4度で15分間の遠心分離し、上清を新鮮なチューブに移します。グルタチオン-セファローズビーズを洗い流し、摂氏4度で2時間培養します。750倍gと4度でビーズをペレット化するために1分間遠心分離します。10ミリリットルの氷冷PBSでビーズを8回すすいでください。次に、溶出バッファーを1ミリリットル加え、ビーズを摂氏4度で10分間インキュベートし、遠心分離を介してビーズを溶出させます。溶出を6回繰り返し、6つの分数を一緒にプールします。溶出したタンパク質を遠心フィルターに移し、100〜200マイクロリットルの最終体積に対して7、500倍gの遠心分離によって濃縮する。MOV10を抽出するために、原稿の指示に従ってHEK293T細胞およびペレット細胞でタンパク質を発現させる。完全なEDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテルで3ミリリットルの細胞ライシスバッファーでペレットを再懸濁し、氷の上で30分間インキュベートします。その後、摂氏4度でリセートを遠心分離します。K150バッファーで2回洗浄して、アンチフラッグの磁気ビーズを調製します。洗浄後、ビーズを氷冷K150バッファーの1ミリリットルに再び懸濁し、穏やかな回転で摂氏4度で2分間インキュベートします。磁石にビーズを集め、上清を取り除きます。ビーズを細胞のライセートに加え、摂氏4度で2時間インキュベートします。原稿の方向に従ってK150バッファーでビーズを洗浄し、FLAG溶出バッファーの300マイクロリットルにビーズを再懸濁します。ビーズを磁石の上に置き、MOV10タンパク質を用いて上清を集め、タンパク質濃度を決定します。各オリゴを20マイクロモルに希釈し、それらをアニールして原稿の指示に従ってRNA二重鎖を形成して、RNAオリゴヌクレオチドを調製します。MEIOB電気泳動移動性シフトアッセイ(EMSA)の場合は、原稿の指示に従って試薬を混合します。20マイクロリットルの最終的な反応量のための水を加える。反応を室温で30分間インキュベートし、次いで5倍の停止バッファーを加えます。MOV10ヘリケース活性アッセイの場合は、原稿の指示に従って試薬を混合し、20マイクロリットルの最終的な反応量のために水を加えます。37°Cで10分、30分、60分間インキュベートし、5倍の停止バッファーを加えて反応を停止します。次いで、20%天然ポリアクリルアミドゲルを調製し、各サンプルの20〜25マイクロリットルを各ウェルに負荷します。ブロモフェノールブルーマーカーがゲルの下部4分の1に移行するまで、氷浴の100ボルトでゲルを実行します。アクリルアミドは有害で有毒です。適切な個人用保護具で処理することが重要です。ゲルプレートを分解し、ローディングウェルと未使用レーンを除去してゲルをトリムします。ゲルを 0.5x TBE バッファーに入れます。フィルターペーパーとナイロン膜をゲルの大きさにカットし、紙と膜を事前に濡らし、スタックを組み立てて転写します。90ミアンペアで半乾燥電気泳動装置でゲルから膜にサンプルを20分間移します。次いで、45〜60秒間、120ミリジュール/センチメートルで膜を照射することにより、試料を架橋する。化学発光検出のために、20ミリリットルのブロッキングバッファーを膜に加え、穏やかに振りながら15〜30分間インキュベートします。ブロッキングバッファーを慎重に取り外し、コンジュゲート/ブロッキング バッファーに置き換えます。膜を15分間再びインキュベートします。1回の洗浄で5分間振りながら、膜を4回洗います。次いで、膜に30ミリリットルの基質平衡バッファーを加え、20〜25rpmで振りながら5分間インキュベートする。膜の表面全体を基質の作業溶液で覆い、5分間インキュベートします。インキュベーション後、化学発光イメージングシステムで膜を1〜3秒間スキャンします。MEIOBタンパク質A、C、およびEの精製は、クマシーブルー染色およびウェスタンブロット分析で検証することができます。赤い矢印は、精製されたMEIOBタンパク質の位置を示す。MEIOBと一本鎖DNAの相互作用は、EMSAを用いて可視化することができる。濃度依存性結合および切断が観察される。予想通り、変異体MEIOB-EとMEIOB-CはDNAと相互作用しないが、野生型のMEIOB-AだけがDNAと相互作用する。MEIOBと一本鎖RNAの相互作用も観察できる。野生型MEIOBは、一本鎖RNAに対する濃度依存的結合およびエキソヌクレアーゼ活性を示す。しかし、定量比較は、MEIOBがRNAよりも高い効率でDNAを結合することを示している。MOV10の精製は、クマシーブルー染色で検証され、タンパク質のヘリカゼ活性を5素数のオーバーハングを有するRNAデュプレックスで測定した。反応時間が長くなるにつれて、MOV10は徐々に二本鎖RNAを巻き戻します。アッセイのコストを削減するために、化学発光検出は、検出キット試薬の2倍希釈または自作試薬を用いて行うことができる。ここで説明するプロトコルは、EMSAなどのインビトロ生化学アッセイやビオチンが一般的に使用されていない酵素反応の基質としてビオチン標識核酸を使用しました。

in-vitro-biochemical-assays-using-biotin-labels-to-study-protein

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

タンパク質のメンブレンオーバーレイアッセイ：可溶性および不溶性タンパク質間の相互作用をテストするためのプロトコル in vitroで</em

このビデオでは、ビオチン化細胞透過性ペプチドを使用して細胞内のタンパク質間相互作用を検出する技術を示しています。細胞透過性ペプチドは、結合ペプチドが細胞内に侵入し、その相互作用タンパク質に特異的に結合するのを促進します。ビオチンは、アビジンに結合した後、細胞溶解物から相互作用するタンパク質の複合体を精製することができます。...

タンパク質間相互作用を検出するためのビオチン化細胞透過性ペプチドプローブ

このビデオでは、ビオチン標識されたdsRNA基質を巻き戻すための標的タンパク質のヘリカーゼ活性を決定する手順を実演します。この酵素の活性は、電気泳動移動度シフトを解析し、続いて化学発光酵素結合ストレプトアビジンを用いた化学発光アッセイを行うことで同定しました。...

ビオチン標識RNA二本鎖を用いた標的タンパク質のヘリカーゼ活性測定

我々は、DNAと転写因子との相互作用を測定するための定量的なDNA結合性、ELISAベースのアッセイを開発した。 RUNX2タンパク質に対して高い特異性は、コンセンサスDNA認識オリゴヌクレオチドと特異的モノクローナル抗体を用いて達成された。酵素結合抗体基質反応と比色検出をリアルタイムでモニターした。...

遺伝子発現のDNA相互作用、ディスカバー転写レギュレータ、および新規抗腫瘍剤を同定：タンパク質を研究するために、定量的アッセイ

ここプロトコルは、バイオレイヤー干渉法によるタンパク質 - タンパク質相互作用のカイネティックアッセイを記載する。細胞のエネルギー代謝に関与するF型ATP合成酵素、細菌中のεサブユニットによって阻害することができる。私たちは、εの阻害C末端ドメインと触媒の複合体の相互作用を研究するバイオレイヤー干渉法を適応している。...

タンパク質 - タンパク質相互作用およびアロステリックリガンド効果の反応速度を測定するためのバイオレイヤー干渉法

この報告では、原形質膜で発現されるタンパク質の細胞表面発現およびエンドサイトーシス速度を決定するために設計された2つのビオチン化に基づく方法を提示する。...

ビオチン化を用いた初代星状細胞培養におけるタンパク質の細胞表面発現およびエンドサイトーシス速度の測定

これは、組み合わせシーケンスの細胞貫通の目新しさとビオチン-アビジン プルダウン ・ システムに基づく細胞内タンパク質間相互作用を研究するためのプロトコルです。主な利点は、ターゲット シーケンスはセル lysates...

細胞内タンパク質間相互作用を研究するビオチン化セル透過ペプチド

ここでは、ヒト細胞からの総タンパク質抽出物、ビオチン化RNAでコーティングされたストレプトアビジンビーズ、および質量分析を使用して、特定のRNA配列のタンパク質相互作用因子を発見、定量、および検証するための最適化された in vitro メソッドを紹介します。...

短いビオチン化RNAを用いたRNA結合タンパク質の最適化された定量的プルダウン解析(英語)

この記事では、ストレプトアビジンベースの生体層干渉法(BLI)システムを使用してDNA-タンパク質相互作用を研究するためのプロトコルについて説明します。本稿では、相互作用の平衡結合親和性(KD)を決定するために、基本的または高度な結合動力学を利用するための基本的なステップと考慮事項を概説しています。...

ストレプトアビジンベースの生体層干渉法によるDNA-タンパク質相互作用の解析

このプロトコルは、目的のタンパク質に融合したビオチンリガーゼへのビオチンの近接性に基づいて、タンパク質へのビオチンの in vivo...

インビボParamecium tetraureliaにおけるタンパク質相互作用研究のための近接ビオチン化

学ぶビオチン標識を用いたタンパク質核酸相互作用のインビトロ生化学アッセイ。MEIOBとMOV10の精製、EMSA、ヘリカーゼ活性測定を含む手法で、特殊機器不要で1日以内に完了し、長期間の再現性を確保します。

ビオチン標識を用いてタンパク質核酸相互作用を研究するインビトロ生化学アッセイ

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