Name: 大西洋サケにおける亜鉛の例を用いた相補的方法を用いた魚飼料の鉱物供給率の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 54 s
Description: 学ぶ大西洋サケの飼料中亜鉛の生物学的利用能評価法。SEC-ICP-MS、in vitro溶解度試験、RTgutGC細胞を用いたin vitro吸収試験、およびin vivo給餌試験を組み合わせた相補的手法を解説します。

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この作業は、ノルウェー研究評議会が資金を提供するプロジェクトAPREMIA(大西洋サケの鉱物の明らかな可用性と要件、助成金第244490)の下で行われました。

セクション4の給餌試験は、ノルウェー語(FOR-2015-06 - 18-761)と欧州の法律(指令2010/63/EU)に従って行われました。
1. SEC-ICP-MS法による大西洋サケ飼料の可溶性分率におけるZn化学種の評価
<ol><li>抽出 バッファー (100 mM トリス-HCl、pH 8.5)
	<ol>
<li>適量のトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを溶解して抽出バッファーを調製し、所望のイオン強度(100 mM)を超純度H2Oに到達します。</li>
		<li>HCl溶液でpH 8.5に溶液のpHを調整し、pHメーターでpH変化を監視します。</li>
	</ol></li>
	<li>飼料サンプルの調製 注:使用される飼料サンプルは、主に植物ベースの成分(すなわち、約5%の魚タンパク質、10%の魚油、68%の植物ベースのタンパク質および12%植物ベースの油)からのタンパク質源を含む、大西洋サケの市販飼料に基づいて製剤化された。硫酸亜鉛を飼料に添加した。<ol>
<li>乳鉢と乳鉢を使用して、手でフィードサンプルを粉砕します。</li>
		<li>フィードサンプルをふるいにかけると、抽出が同様の粒子サイズ(850 μmから1.12mm)のフィード分数で確実に行われます。</li>
		<li>Zn抽出を実行する。</li>
	</ol></li>
	<li>飼料サンプルからの亜鉛抽出
	<ol>
<li>15 mLの円錐形の管に三重に供給のおよそ0.5gの重量を量る。</li>
		<li>抽出バッファー (5 mL 100 mM Tris-HCl、pH 8.5) をサンプルに加えます。</li>
		<li>4 °Cで24時間、回転器(20rpm)でサンプルを抽出します。</li>
		<li>可溶性と非可溶性の分画を、3000 x gで10分間遠心分離して分離 する。</li>
		<li>0.45 μm の使い捨てシリンジフィルターを使用して、可溶性分数をフィルター処理します。</li>
		<li>フィルター処理されたサンプルをクリーンチューブに移します。</li>
		<li>ステップ1.6で説明したように、SEC-ICP-MSを用いて可溶性分数でZn種分分析を行う。 注: フィードサンプルからのZn抽出手順の概要を 図2に示します。</li>
	</ol></li>
	<li>移動相ソリューション(50 mMトリス-HCl + 3%MeOH、pH 7.5)
	<ol>
<li>3%MeOH溶液(v/v)の1 Lでトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンの6.057 gを溶解する移動相溶液を調製します。</li>
		<li>HCl溶液でpHから7.5まで溶液のpHを調整し、pHメーターでpH変化を監視します。</li>
		<li>0.45 μmの膜フィルターを介して移動相溶液をフィルター処理します。</li>
	</ol></li>
	<li>SECカラム分離範囲の分子量較正
	<ol>
<li>分子量キャリブレーションを行って分離範囲を較正します。 注:この研究では、チログロブリン(660 kDa)、Zn/Cuスーパーオキシドジスムターゼ(32kDa)、ミオグロビン(17 kDa)およびビタミンB12(1.36kDa)が使用されました。</li>
		<li>超純粋なH2Oで既知の濃度で各標準を準備します。</li>
		<li>250 μLの標準をバイアルに加えて、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)バイアルを用意します。</li>
		<li>サンプルのシーケンス実行に標準のバイアルをロードします。</li>
		<li>分析配列の最初と最後に分子量較正を実行し 、127I(チログロブリン )、66Zn(Zn/Cuスーパーオキシドジスムターゼ )、57Fe(ミオグロビン )、59Co(ビタミンB12)を監視します。 メモ:分子量キャリブレーションはZn種分分析と同時に行われます。</li>
	</ol></li>
	<li>SEC-ICP-MSを用いた亜鉛種分分析 注: SEC-ICP-MS法によるZn種分分析は、大西洋サケ飼料7の分析のために他の場所で説明した10、11の原理に基づいて開発され、さらなる最適化が行われました。<ol>
<li>サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)カラムと、誘導結合プラズマ質量分析(ICP-MS)と結合したHPLCを用いて、可溶性分画に対するZn種分分析を行います。</li>
		<li>250 μL の可溶性分率をバイアルに加えて、HPLC バイアルを準備します。</li>
		<li>分析の前に、0.5 μLのビタミンB12でサンプルを全てスパイクします。このステップは 、59Coを監視し、保持時間のシフトを修正することができます。</li>
		<li>抽出バッファー (100 mM Tris-HCl、pH 8.5) で可溶性分率を希釈し、最終体積 1 mL に調整します。</li>
		<li>サンプルのシーケンス実行をランダムな順序で準備します。</li>
		<li>製造元の指示に従って ICP-MS を調整します。</li>
		<li>Zn 種分分析を実行する HPLC および ICP-MS の計測器設定に従ってください( 表 1を参照)。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 大西洋サケ飼料中のサプリメントZnのインビトロ溶解度
注:使用される飼料サンプルは、主に植物ベースの成分(すなわち、約5%の魚の食事、10%の魚油、68%の植物ベースの成分と12%植物油)からのタンパク質源を含む、大西洋サケの市販飼料に基づいて製剤化されました。
<ol><li>ナイフミルを使用して3000 rpmで10 sの大西洋サケ飼料サンプルを粉砕し、さらに分析するまで4°Cで保存します。</li>
	<li>ステップ2.1で約0.2gのフィードサンプルを粉砕し、5mL体積サンプルチューブ(キャップ付き)に既知の比活性のZn放射性トレーサ(65Zn)を加える。 注意: この手順は、放射性核種スイート内で実行する必要があります。このステップを実行する人は、無線同位体を処理するための訓練と認定を受ける必要があります。研究所の放射線安全管理によって助言される安全および予防措置は厳密に従わなければならない。</li>
	<li>次に、以下に説明する淡水腸ルミナル緩衝液を調製する。<ol>
<li>塩溶液Aの場合、11.65gのNaNO 3、0.55gのKNO3およびMgSO4の0.4gを量る。塩を超純度H2Oに溶かし、60mLの最終体積に調整します。</li>
		<li>塩溶液Bの場合、重さはCa(NO3)2の0.31gを量る ·4H2O. 塩を超純度H2Oに溶かし、最終体積10mLに調整します。</li>
		<li>500 mM HEPES ストック溶液を塩溶液Cとして使用する。</li>
		<li>塩溶液Dの場合、MgCl2の1.2gを秤量し、塩を超純粋なH2Oに溶解し、20mLの最終体積に調整する。</li>
		<li>塩溶液Eの場合、MgSO4の0.9gを秤量し、塩を超純粋なH2Oに溶解し、最終容積20mLに調整する。</li>
		<li>超純H2Oの10 mLにCH3COCOONaの0.55 gを溶解することによりピルビン酸溶液を調製する。</li>
		<li>0.9 gのガラクトース (C6H12O6)を超純度 H2O に溶解します。</li>
		<li>磁気撹拌機を使用してよく溶解し、オートクレーブ加工により塩溶液A、B、D、Eを殺菌し、200μmのシリンジフィルターを通してろ過して溶液C、ピルビン酸およびガラクトースを殺菌します。</li>
		<li>異なるストック溶液を調製した後、バッファーの100mLの作業溶液を調製し、上記の調製溶液を以下の割合で混合する:6.8mLの塩溶液A、4.14mLのB、5 mLのC、2.5mLのD、1.5mLのE、および1.14mLのピルビン酸およびガラクトート。脱イオン水を使用して100 mLに体積を構成します。 注:上記のバッファーは、淡水サルモデイドに見られる腸管腔のイオン組成を表します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ステップ2.6に記載のバッファーの他の6つのアリコートを調製し、5mMの最終的なモル濃度に達するために、次のアミノ酸(システイン、メチオニン、グリシン、ヒスチジン、リジンおよびアルギニン)のいずれかを加える。</li>
	<li>淡水腸の発光バッファー (反応量 = 3 mL; pH 7.4) をフィードサンプルに加えます。</li>
	<li>ステップ2.5を2.4に記載された緩衝液で繰り返す(5mM濃度で異なるアミノ酸が存在する場合)。</li>
	<li>チューブを閉じ、回転スピナーで回転させ、25rpmで30分間回転させます。</li>
	<li>1157 x g で 10 分間遠心分離して可溶性分率と非可溶性分画を分離 します。</li>
	<li>ガンマテラーを使用して、可溶性および非可溶性の分率で 65Znの1分あたりの数(cpm)を測定します。</li>
	<li>可溶性および非可溶性画分に存在するZn(65Zn)の無線同位体の割合を計算する。</li>
</ol>3. インビトロ腸管モデル(RTgutGC)によるZn化学種取り込みの評価
<ol><li>RTgutGC細胞培養 注:このステップで使用されるすべての作業材料は、無菌でなければなりません。<ol>
<li>20°Cに設定された水浴で、凍ったRTgutGC細胞を優しく蘇生させます。</li>
		<li>細胞を含む溶液を軽くピペットアウトし、10%胎児ウシ血清(FBS)を含むL15培地(FBS)の10mLに懸濁液を使用します。 </li><li></li><li> </li></ol></li><li><ol><li><li><li><li><li><li></li><li><li></li><li> </li><li> </li></ol></li><li> <ol><li><li><li> </li></ol></li><li><ol><li></li><li><li> </li><li><li><li></li><li><li><li></li><li><li><li> </li><li><li> </li><li><li> </li></ol></li></ol><ol><li><li> </li><li><li><li><li> </li><li><li><li></li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59862/59862eq1.jpg"></li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

Znの腸の吸収は、Zn種13の化学形態の影響を受けているようです。この点に関して、この記事に記載されているプロトコルの使用は、大西洋サケにおけるZnの「入手可能性」の根底にある化学的および生物学的側面の逐次的研究を可能にした。
本研究ではZn種化解析法の使用を報告した。SEC-ICP-MS法は、大西洋サケ飼料の可溶性分率に存在するZn化学種の分子量に関する定性的データを提供した。これは、分子量較正基準(すなわち、チログロブリン(660kDa)、Zn/Cuスーパーオキシドジスムターゼ(32kDa)、ミオグロビン(17kDa)およびビタミンB12(1.36kDa)の保持時間とピークを含むZnの保持時間との比較によって達成された。Zn種分分析で見つかった課題は、分析基準の欠如による未知のZn化学種の同定でした。SECでは、分子の分離は、静止相の細孔に対するそのサイズに基づいています。原則として、より大きな分子はより速く移動し、最初に溶出し、より小さな分子は遅く移動し、後に14を溶出する。その結果、ピークを含む各Znは、類似した分子量15を有するいくつかの化合物を含んでい得る。これはまた、未知のZn化学種を同定するという課題に貢献しています。また、Znの抽出についていくつかの軽度の抽出条件を試験した。抽出されたZnは低く(〜10%)であった。Znの化学種をそのまま維持するために軽度の抽出条件が適用されたが、これは抽出効率7を損なった可能性がある。
インビトロ溶解アッセイでは、補ったZnの溶解度(ラジオ同位体65ZnCl2として)は、アミノ酸、特にヒスチジンおよびリジンがZnの溶解度を増加することを示した(図5)。シミュレーションされた消化管条件下でのインビトロ溶解アッセイに直接飼料サンプルを使用することは、Zn種分化の変化がpH依存性16であるという知見に基づいている。しかし、消化管の初めに酸性条件は、不可逆的である可能性のある種分化に何らかの変化をもたらす可能性がある(例えば、ZnO−>ZnCl2、胃内の酸性条件下でHClの存在下で)。それにもかかわらず、ここで用いられるZn源は、ZnSO4であり、その溶解度は培地中のアミノ酸によって改善された。次に答える質問は、溶解度の増加を可用性に変換できるかということです。RTgutGC腸細胞株は、この質問を研究するために使用されました.動物のミネラル栄養の文脈では、「入手可能性」という用語は定義が難しく、動物(in vivo)と比較して細胞(in vitro)で差をつけて調節することができます。それゆえ、腸細胞株を用いたインビトロ評価に関しては「取り込み」という用語が用いられた。細胞株は、動物の鉱物の入手可能性を支配する複雑な調節プロセスの一部である腸上皮におけるZn取り込みメカニズムに関する有用な情報を提供した。RTgutGC細胞は、アミノ酸(すなわち、メチオニン)の存在下でZnのアプリカル取り込みのためのより良い容量を引き出した。図 6.しかし、インビボでの明らかな可用性は、大西洋サケの無機Zn源と有機Zn源の間で有意に異なっていなかった。in vivo可用性試験では、Znソース比較は、大西洋サケ17の既知のZn要件をはるかに上回る食事Znレベルで行われ、Zn濃度は150mg/kgの総フィードでした。可用性の違いは、動物が飽和に達する前に、テストされた食事レベルが線形ダイナミックレンジに落ちるとき、よりよく視覚化されます。本インビボ研究では、大西洋サケが使用されるソース間のZn吸収の差を観察するために十分に飽和していた可能性がある。
要約すると、最初の方法は、大西洋サケ飼料の可溶性分率に見られる異なるZn化学種に関する定性的情報を提供した。第二の方法は、補充されたZnのインビトロ溶解度がアミノ酸リガンドの存在下で改善された;第三の方法は、アミノ酸による改善された溶解性が腸上皮での取り込みを改善できることを確認しました;逆に、第4の方法は、無機または有機の供給源から大西洋サケへのZnの入手可能性の違いを見つけることができませんでした。結論として、in vivoの知見と一致していないが、in vitroプロトコルはZn可用性のさまざまな構成要素を理解するための興味深い洞察を提供した。

魚の食事と魚油は、伝統的に大西洋サケ飼料に使用されていました。しかし、これらの成分は、植物ベースの成分1に置き換えられつつある。飼料組成物の前述の変化は、低食事の可用性をもたらし、大西洋サケ飼料、特に亜鉛(Zn)2におけるミネラルの可用性を向上させる必要性の増加をもたらした。可用性の低下は、Znレベル、Zn化学種または/および飼料マトリックスに存在する抗栄養因子の変化の結果である可能性があります。このシナリオでは、一般的に「有機源」と考えられている添加物の新しい配列は、魚に食物ミネラルのより良い利用可能な供給源である可能性を持って出現しました。したがって、魚に対する鉱物とその供給源の利用可能性を支配する基本的な化学と生理学を理解することが重要です。亜鉛は、すべての生物に不可欠な微量元素である 3.シグナル分子としてのZnの役割は、魚4における細胞内レベルと細胞内レベルの両方で説明されている。大西洋サケでは、Zn欠乏症は、骨格異常と様々なZnメタロ酵素5、6の活性低下と関連している。
本研究では、Znの入手可能性を、様々な化学的および生物学的複雑さの4つの異なる区画に分類することによって、その利用可能性を理解するための体系的なアプローチを説明する。関連する方法は、図1に示されているように 、4つのセクションに記載されている:(1)サイズ排除クロマトグラフィー誘導結合血漿質量分析法7を用いた大西洋サケ飼料の可溶性分画におけるZn化学種の評価(2) 大西洋サケ飼料中の補助Znのインビトロ溶解度;(3) インビトロ腸管モデル(RTgutGC)によるZn化学種取り込み評価 8;(4) 大西洋サーモンのZnの明らかな可用性 (サルモ・サラル)9.同様のプロトコルは、養殖魚種に栄養関心の他の鉱物(例えば、マンガン、セレン、銅)のために開発することができます。

<table><tbody><tr><td>0.45 以上m シリンジフィルター</td><td>ザルトリウス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu;m メンブレンフィルター</td><td>Pall</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 % 胎児ウシ血清</td><td>Eurobio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1282 Compugamma Laboratory Gamma Counter</td><td>LKB Wallac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 well plates (Falcon, TPP microplates)&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td></td><td></td>10048760</tr><tr><td>2-アミノビシクロ(2.2.1)ヘプタン-2-カルボン酸</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>A7902</td><td></td></tr><tr><td>75cm2細胞培養フラスコ(ファルコン、TPP組織培養フラスコ)</td><td>TPPテクノプラスチックプロダクツAG&nbsp;</td><td>90075</td><td></td></tr><tr><td>L-アルギニン</td><td>シグマ アルドリッチ&nbsp;</td><td>A5006</td><td></td></tr><tr><td>Bradford assay kit</td><td>Bio-Rad</td><td>5000001</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf Centrifuge 5702</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>30089</td><td></td></tr><tr><td>DL-メチオニン</td><td>アルファ Aesar</td><td>59-51-8</td><td></td></tr><tr><td>D-メチオニン</td><td>Σ アルドリッチ&nbsp;</td><td>M9375</td><td></td></tr><tr>ス<td>クレッティング</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>シグマ アルドリッチ 実験魚餌&nbsp;</td><td></td><td></td>410225</tr><tr><td>ガードコラム TSKgel SWxlタイプ (7 &mu;m 粒径)</td><td>東ソーL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>-ヒスチジン</td><td>シグマアルドリッチ&nbsp;</td><td>53319</td><td></td></tr><tr><td>HPLC と 7500ce ICP-MS</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Emsure ACS, ISO, 37% w/w, Merck</td><td>1.00317</td><td></td></tr><tr><td>Knife mill</td><td>GM 300, Retsch Gmbh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-15 medium</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>&nbsp;</td><td></td>21083027</tr><tr><td>L-メチオニン&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>M9625</td><td></td></tr><tr><td>L-リジン</td><td>シグマ アルドリッチ&nbsp;</td><td>23128</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>LiChrosolv、HPLCグレード、メルク&nbsp;</td><td>1.06035</td><td></td></tr><tr><td>ミリQ水(18.2&nbsp;M&オメガ;&nbsp;cm)&nbsp;</td><td>EMDミリポアコーポレーション</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ミオグロビン&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>M1882</td><td></td></tr><tr><td>NexION 350D ICP-MS</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur ピペット</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH メーター&nbsp;</td><td>inoLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>806552 RTgutGC細胞&nbsp;</td><td></td><td></td><td>クリスティン・シルマー教授博士、環境毒物学部、Eawag、スイス連邦水生科学技術研究所、スイス</td></tr><tr><td>SECコラム、TSKgel G3000SWxl</td><td>東ソー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ふるいステンレス鋼(850?&mu;m - 1.12?mm)</td><td>Retsch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>436143</tr><tr><td>スーパーオキシドジスムターゼ&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>S7571</td><td></td></tr><tr><td>サイログロブリン&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>T1001</td><td></td></tr><tr><td>トリカインメタンスルホン酸</td><td>PharmaQ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水中の0.25%のトリプシン</td>252859 <td>Biowest</td><td>L0910</td><td></td></tr><tr><td>Versene EDTA溶液</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>15040-033</td><td></td></tr><tr><td>Vitamin B12</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>V2876</td><td></td></tr><tr><td>グリシンの亜鉛キレート</td><td>Phytobiotics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫酸亜鉛</td><td>Vilomix</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

大西洋サケにおける亜鉛の例を用いた相補的方法を用いた魚飼料の鉱物供給率の評価

Assessing Mineral Availability in Fish Feeds using Complementary Methods Demonstrated with the Example of Zinc in Atlantic Salmon

食物のマイクロミネラルの入手可能性を評価することは、魚種のミネラル栄養における大きな課題です。本稿は、大西洋サケ(サルモ・サラー)における亜鉛(Zn)の入手可能性を評価するために、異なる方法論を組み合わせた体系的なアプローチを説明することを目的としています。いくつかのZn化学種が大西洋サケ飼料に存在することができることを考慮して、Znの入手可能性は、飼料中に存在するZn化学種の影響を受けていると仮定した。したがって、本研究では、第1のプロトコルは、飼料から異なるZn化学種を抽出し、それらをサイズ排除クロマトグラフィー誘導結合プラズマ質量分析法(SEC-ICP-MS)法によって分析する方法についてです。続いて、大西洋サケ飼料中の食事Znの溶解度を評価するin vitro法が開発された。第3のプロトコルは、ニジマス腸細胞株(RTgutGC)を用いた魚腸上皮モデルにおけるZnの取り込みに対するZn化学種組成の変化の影響を研究する方法を記述する。一緒に、 in vitro方法からの知見は、大西洋サケ飼料に補充されたZnの無機および有機供給源の明らかな入手可能性を調べるインビボ研究と比較された。結果は、いくつかのZn化学種が飼料に見つけることができ、有機Zn源の効率は、Znをキレートするために使用されるアミノ酸リガンドに非常に依存することを示した。インビトロ法の知見は、インビボ研究の結果とあまり相関していなかった。それにもかかわらず,この記事で説明したインビトロプロトコルは,Znの入手可能性と魚の飼料におけるその評価に関する重要な情報を提供した。

SEC-ICP-MS法による大西洋サケ飼料の可溶性分率におけるZn化学種の評価 SEC-ICP-MS法は、大西洋サケ飼料の可溶性分率に含まれるZn化学種に関するデータを提供する。 図4 は、可溶性画分に見られるZnのクロマトグラフィープロファイルを示す。このクロマトグラムはSEC-ICP-MS法を用いて得られた。ピークを含む5つのZnは、大西洋サケ飼料の可溶性分画に見られた。各ピークは、異なる分子量を有する;ピーク1(〜600kDa)、ピーク2とピーク3(32〜17 kDa)、ピーク4(17〜1.36kDa)およびピーク5(&gt;1.36 kDa)。ピーク4が最も豊富で、次いでピーク2、3、5、1が続いた。可溶性分率に含まれるZn化学種は、使用される飼料に海洋系および植物ベースの成分の両方が含まれているため、異なる供給源を有し得る。また、補足された形態(すなわち、Zn硫酸塩)である。Zn化学種の分子量範囲は、これらの化合物がメタロタンパク質である可能性を示唆した。
大西洋サケ飼料における補剤Znのインビトロ溶解度 アミノ酸の存在下で65Znを補ったの溶解度が増加した。すべての試験されたアミノ酸は、補充された65Zn.メチオニン、グリシン、システイン、ヒスチジン、およびリジンの溶解度を増加させました65Zn溶解度を改善;ヒスチジンとリジンでより高い溶解性が見つかりました(図5)。
インビトロ腸管モデル(RTgutGC)を用いたZn種取り込みの評価 RTgutGC細胞におけるアペカル亜鉛取り込みは、2mM濃度でのL-MetまたはDL-Metの存在によって有意に影響を受けた。さらに、RTgutGC細胞におけるZn取り込みにおけるメチオニンの影響は、BCH(アミノ酸輸送系ブロッカー)の存在によって悪影響を受け、BCHで処理されていない細胞と比較した場合(図6)。
大西洋サーモンの食事Znの明らかな可用性 (サルモ・ サルラー) 大西洋サケの実用的な飼料では、明らかなZnの入手可能性は、無機源(Zn硫酸塩)または有機源(グリシンのZnキレート)を補う場合と同じであった。大西洋サケにおけるZn(%、n=3)の見かけの利用可能性の推定値は、無機源(Zn硫酸塩)を補う場合は31%±12%、有機源(グリシンのZnキレート)を補う場合は31%±3%であった。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59862/59862fig1.jpg"> 図1:相補的な方法を用いて鉱物の利用可能性を評価する体系的アプローチの概要このアプローチは、Zn種分化、腸内環境におけるZn溶解度、腸細胞によるZn取り込み、Znの明らかな可用性を含む大西洋サケにおける亜鉛の入手可能性を研究するために使用された。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59862/59862fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59862/59862fig2.jpg"> 図2: フィードサンプルからのZn抽出手順の概要 亜鉛は、軽度の抽出条件を使用して飼料サンプルから抽出されます。抽出の後にZn種分分析が行われます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59862/59862fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59862/59862fig3.jpg"> 図3:細胞培養フラスコに播種した後のRTgutGC細胞1時間(左)と1週間(右)の例を示 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59862/59862fig3large.jpg" target="_blank">します。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59862/59862fig4.jpg"> 図4:大西洋サケ飼料の可溶性分率からZn含有ピークを示し、SEC-ICP-MSで分析したクロマトグラム。 3つの複製は青、赤および黒の線によって特徴付けられる。分子量較正は、チログロブリン(660 kDa、モニタリング 127I)、Zn/Cuスーパーオキシドジスムターゼ(32 kDa、モニタリング 66Zn)、ミオグロビン(17 kDa、モニタリング 57Fe)、ビタミンB12(1.36 kDa、モニタリング 59Co)を使用して行った。ピーク1(P1):~600kDa、保持時間(RT)8.2分。ピーク2+3(P2+3):32から17 kDa、RT 14.2 + 15.3分。ピーク4(P4):17から1.36 kDa、RT 16.3分。ピーク5(P5):&gt;1.36 kDa、Rt 23.2分。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59862/59862fig4large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59862/59862fig5.jpg"> 図5:大西洋サケ飼料中の補助Znのインビトロ溶解度に及ぼすアミノ酸の影響 データはSD±平均として提示されます(n = 3)。データは一方向のANOVAを通じて分析され、次にダンネットの多重比較検定を行い、各AAグループの平均を対照群の平均(No AA)と比較した。アスタリスクは、ANOVA の有意性のレベルを示します (P 値 &lt; 0.05 (*),0.01 (**) &lt;0.001 (**), &lt; 0.0001 (****)、 &lt; 0.0001 (****))。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59862/59862fig5large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59862/59862fig6.jpg"> 図6:メチオニンとアミノ酸輸送抑制剤(2-アミノビシクロ[2.2.1]ヘプタン-2-カルボン酸、BCH、10mM)の影響。データはSD±平均として提示されます(n = 3)。データは双方向のANOVAを通じて分析され、続いてTukeyの多重比較検定がp&lt;0.05レベルの有意性を有する。グループ間のポストホックの違いは、バーの上に上付き文字として表されます。異なる上付き文字を持つバーは統計的に異なります (p &lt; 0.05)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59862/59862fig6large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>HPLC 設定</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>コラム</td>
			<td>SEC 列 (30 cm x 7.8 mm、5 μmの粒子サイズ) + ガードカラム(7 μm粒径)</td>
		</tr>
<tr>
<td>キャリブレーション範囲</td>
			<td>1.0 × 104 - 5.0 × 105 Da</td>
		</tr>
<tr>
<td>モバイルフェーズ</td>
			<td>50 mM トリス-HCl + 3% MeOH (pH 7.5)</td>
		</tr>
<tr>
<td>流量</td>
			<td>0.7 mL 分-1
</td>
		</tr>
<tr>
<td>射出量</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ICP-MS 設定</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>フォワードパワー</td>
			<td>1550 W</td>
		</tr>
<tr>
<td>プラズマガスの流れ</td>
			<td>15.0 L 分-1
</td>
		</tr>
<tr>
<td>キャリアガスの流れ</td>
			<td>0.86 L 分-1
</td>
		</tr>
<tr>
<td>メイクアップガスの流れ</td>
			<td>0.34 L 分-1
</td>
		</tr>
<tr>
<td>ドウェルタイム</td>
			<td>同位体あたり 0.1 秒</td>
		</tr>
<tr>
<td>同位体の監視</td>
			<td>
127I, 66Zn, 59Co, 57Fe</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1.HPLC および ICP-MS の計測器設定の概要。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>化学組成(mM)</td>
			<td>L15/ex</td>
			<td>実験媒体(L15/FW)</td>
		</tr>
<tr>
<td>硝酸ナトリウム</td>
			<td>155</td>
			<td>155</td>
		</tr>
<tr>
<td>硝酸カリウム</td>
			<td>6.2</td>
			<td>6.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>硫酸マグネシウム</td>
			<td>3.8</td>
			<td>19.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>硝酸カルシウム</td>
			<td>1.5</td>
			<td>5.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>ヘペス</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>塩化マグネシウム</td>
			<td>-</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>ピルビン酸ナトリウム</td>
			<td>5.7</td>
			<td>5.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>ガラクトース</td>
			<td>5.7</td>
			<td>5.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>pH</td>
			<td>7.1</td>
			<td>7.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>イオン強度</td>
			<td>178</td>
			<td>258</td>
		</tr>
<tr height="36">
<td>イオン組成物(mM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>カルシウム、Ca2+ *
</td>
			<td>1.6 ± 0.1</td>
			<td>5.3 ± 0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>マグネシウム、Mg2+ *
</td>
			<td>3.9 ± 0.3</td>
			<td>32.5 ± 0.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>カリウム、K +*
</td>
			<td>8.2 ± 1.2</td>
			<td>8.6 ± 1.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>ナトリウム、Na+ *
</td>
			<td>160 ± 3</td>
			<td>157 ± 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>硝酸塩、NO3- **
</td>
			<td>164</td>
			<td>172.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>硫酸塩、SO4- **
</td>
			<td>3.8</td>
			<td>18.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>塩化物、Cl- **
</td>
			<td>1.5</td>
			<td>31.5</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2.実験媒体の化学およびイオン組成を試験した。

この記事では、大西洋サケのマイクロミネラルの可用性を評価するための体系的なアプローチを詳細に説明します。この方法論には、生物学的複雑性を持つツールとモデルが含まれています:(1)化学種分分析、(2)体外溶解度、(3)細胞株の取り込み研究、および(4)生体魚の研究。

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a ...

我々は、供給組成の変化という文脈で、異なる化学形態または供給源を有する亜鉛セレンのような微金属の溶解性の入手可能性を研究した。放射性核種スイートでは、約0.2グラムの地上大西洋サケ飼料サンプルを計量し、5ミリリットル体積サンプルチューブ内の既知の特定活性の亜鉛放射性トレーサーと混合します。バッファーの他の 6 つのアリコートを準備し、5 ミリモルの最終的なモル濃度に到達するためにここに示すアミノ酸の 1 つを追加します。.サンプルを供給するために淡水腸の発光バッファーを追加します。次に、アミノ酸を含む緩衝アリコートに淡水腸発光バッファーを加える。チューブを閉じ、25 RPMの回転スピナーで30分間回転させます。次いで、遠心分離機を1、157xgで10分間、可溶性及び非可溶性の画分を分離する。ガンマテラーを使用して、可溶性および非可溶性の分率における亜鉛ラジオトレーサの1分あたりの数を測定します。虹のマス由来の腸細胞株を1ミリリットルのEDTA溶液で2回洗浄し、ピペットを使用して各洗浄後に溶液をサイフォンアウトします。洗浄した細胞を0.25%トリプシン溶液で処理します。フラスコを鋭角で2分間軽く回転させます。その後、5%FBSを含むL-15培地の10ミリリットルを加え、トリプシンを中和します。滅菌ピペットを使用して、得られた細胞懸濁液を円錐底遠心管にデカントする。遠心分離機で130×Gで3分間。次に、ヘモサイトメーターを使用して、手動カウントによって採取した細胞の密度を決定する。細胞を1ミリリットル当たり50,000個の細胞密度で24ウェルプレートに播種し、実験前に48時間、通常の雰囲気下で摂氏19度でプレートをインキュベートします。魚に11日間餌を与え、安楽死させた後、腹側のひれからアヌスに剥がして魚の便のプールされたサンプルを集め、皿の上に置きます。へらを使用して、プレートから50ミリリットルの円錐管に便を移します。すぐに20°Cでサンプルを保存します。本研究では、魚の飼料のミネラルの入手可能性は、いくつかの無料の方法を使用して評価されます。大西洋サケ飼料の代表的な分析は、誘導結合プラズマ質量分析法を介したサイズ排除クロマトグラフィーを介して、可溶性分率に見られる亜鉛化学種に関するデータを提供する。ピークを含む5つの亜鉛は、それぞれ異なる分子量を有するこの画分で見ることができる。使用される飼料は海洋系と植物系の両方の成分を含み、補充されるため、可溶性分率に見られる亜鉛化学種は、異なる供給源を有することができる。これらの種の分子量範囲は、これらの化合物がメタロタンパク質である可能性を示唆している。添加亜鉛65の溶解度は、試験された全てのアミノ酸の存在を増加させる一方で、ヒスチジンおよびリジンでより高い溶解性が見られる。アルテカGC細胞におけるアピカル亜鉛取り込みは、L-MetまたはDL-Metが2ミリモル濃度で存在することによって有意に影響を受ける。さらに、亜鉛取り込みにおけるメチオニンの影響は、BCHの存在によって悪影響を受ける。このプロトコルの主な利点は、鉱物の可用性を研究することになると比較し、お互いを補完するために、視覚的、分析的、およびinvivo研究で異なるアプローチを組み合わせることです。

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