Name: ヒト膵島の単一細胞RNAシーケンシングと解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: 学ぶ ヒト膵島細胞の単一細胞RNAシーケンス解析手法。ドロップレット型マイクロ流体デバイスを用いて細胞異質性と遺伝子発現を解析し、糖尿病研究における希少細胞型の同定と治療標的発見に貢献します。

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1. 人間のアイレット解離
<ol><li>研究目的のために特定の人口統計を有するドナーからの島が必要でない限り、15〜80歳の性別の死体臓器提供者から単離されたヒトの島を得る。<ol>
<li>単離後、隔離された島をサプライヤーで2〜3日間組織培養施設に保管する。多くの場合、イレットの損傷が見えるようになるまでに1日以上かかります。</li>
		<li>ボトルに島を入れ、島培地に完全に浸します。夜間発送で研究室に持って行け</li>
		<li>出荷された島の同等量 (IEQ) を、島の仕入先から入手します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>島到着日に出荷から島を回収します。汚染の可能性を最小限に抑えるためにフードを使用してこの手順を実行します。<ol>
<li>完全なアイズルメディア(CMRL-1066、10%(v/v)FBS、1xペンストレップ、2mMグルタミン)を冷蔵庫で冷却します。</li>
		<li>ボトルから50 mLの円錐形チューブに島を移します。</li>
		<li>空のボトルに10mLの予冷完了の完全な島の媒体を加えて残りの島を洗い流す。メディアを円錐形のチューブに移します。</li>
		<li>200 x gでチューブを遠心分離し、2分間、島を回収します。ペレットで約1-2 mL培分を残して上清を吸引する。</li>
		<li>あらかじめ冷却された完全な島の媒体で島を再中断します。サプライヤーが提供する IEQ に基づいて、5000 IEQ ごとに 12 mL メディアを追加します。</li>
		<li>10cmの非処理組織培養皿に培中に島を注ぎます。大気中の5%CO2で37°Cの組織培養インキュベーターで一晩インキュベートする。</li>
	</ol>
</li>
	<li>以下に示すように、島を解離する。一晩インキュベーションの後にこの手順を実行します。<ol>
<li>事前ウォーム完全なイレット培養および細胞解解。</li>
		<li>室温で0.04%BSAを含む1x PBSを調調します。</li>
		<li>P200ピペットを使用して200-300の島を数え、5 mLの予め温められた完全な島の媒体を含む15 mLの円錐形の管に渡す。</li>
		<li>200 x gで200xgで遠心分離して島を2分間集め、底部のペレットを邪魔することなく上清を静かに吸引する。</li>
		<li>1.0 mLの予め温められた細胞の解離液を加え、上下にゆっくりとピペッティングしてペレットを破壊する。島を37°Cで9~11分間インキュベートします。3分ごとに上下にゆっくりと10sの細胞を単一の細胞に解離する。</li>
		<li>イレット細胞がよく解離され、溶液が濁ると、9 mLの完全な入り物培養物を追加し、30 μmセルストレーナーを通して新しい15 mL円錐管にフィルターを加えます。</li>
		<li>チューブとセルストレーナーを2mLの完全な島の培養物で洗浄し、残りの島を回収し、同じチューブに追加します。</li>
		<li>400 x gで5分間遠心分離によって細胞を集める。</li>
		<li>メディアを穏やかに吸引し、0.04%BSA(PBS-BSA)を含む5 mL 1x PBSで細胞ペレットを再中断します。</li>
		<li>新しい30 μmセルストレーナーを15 mLの円錐管にフィルターでフィルタリングし、遠心分離機を400 x gで5分間取り込み、細胞を集めます。</li>
		<li>上清を吸引し、200-300 μL 1x PBS-BSA溶液で細胞ペレットを再中断します。</li>
		<li>細胞濃度を測定し、400-500細胞/μLの最終濃度に体積を調整します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. シングルセルサスペンション品質管理
<ol><li>蛍光系自動細胞カウンター34を用いて細胞濃度を決定する。<ol>
<li>10 μL セルを 0.5 μL AO/DAPI と混合します。ピペットミックスを徹底的に混ぜます。スライドに10.5 μLをロードし、セルカウントアッセイを実行して、カウントと生存率を判断します。</li>
		<li>セル数に基づいて、必要に応じてセル懸濁液を希釈またはフィルタリングします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. マイクロ流体チップを使用した単一セルパーティショニング。マイクロ流体チップメーカー35からのプロトコルに従ってください。
<ol><li>3'ゲルビーズと逆転写(RT)試薬を室温(>30分)に持参してください。必要に応じて、TE バッファ内の RT プライマーを再構成します。</li>
	<li>表 1で説明するように、低バインド チューブで RT マスター ミックスを準備します。</li>
	<li>各サンプルに入力するセルの数を決定します。目的のターゲットセル数を提供するために必要なセル懸濁量(X)を計算します。各サンプルに添加するヌクレアーゼフリー水の計算量は33.8-X μLになります。</li>
	<li>各サンプルを仕切る場合は、33.8-X μLヌクレス料フリー水を0.2 mL PCRストリップチューブに追加します。次に、各ストリップチューブに66.2 μLマスターミックスを追加します。この時点で、セルをストリップ チューブに追加しないでください。ピペットをやさしく混ぜます。準備されたストリップチューブを氷の上に置きます。</li>
	<li>マイクロ流体チップをチップケースに入れておきます。オイルウェル(3行)が実験を行う人に最も近いチップケースの向きを整えます。</li>
	<li>8サンプル未満を実行する場合は、50%のグリセロールを使用して、次の順序で未使用のチャネルを充填します。<ol>
<li>50%グリセロールの90 μLを、未使用のチャネルの行1のウェルに追加します。</li>
		<li>50%グリセロールの40 μLを、未使用のチャネルの行2のウェルに追加します。</li>
		<li>50%グリセロールの270 μLを、未使用のチャネルの行3のウェルに追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ゲルビーズを渦にスナップします。30 s. のフルスピードで渦は、ビーズを収集するために、ベンチトップのストリップを数回タップします。気泡が存在することを確認します。</li>
	<li>準備されたストリップチューブにセルのX μLを追加します。ピペットを5回混ぜます。ピペットチップを捨てずに、90μLのセル混合物をチップの行1に移します。</li>
	<li>30 s を待ってから、40 μL のゲルビーズを 2 行目にロードします。このステップのために非常にゆっくりとピペット。3列目の井戸に270 μLの仕切りオイルを分配します。</li>
	<li>チップガスケットをチップホルダーのタブに引っ掛けます。組み立てられたチップホルダーを単一セルパーティショニングデバイスに入れ、実行ボタンを押します。</li>
	<li>実行完了時に組み立てられたチップホルダーを直ちに取り外します。</li>
	<li>ホルダーからチップガスケットを取り出し、チップケースを45°の角度で開き、チップから100μLのエマルジョンを青いプラスチック96ウェルプレートに取り外します。</li>
</ol>4. 単一細胞cDNA増幅。マイクロ流体チップメーカー35からのプロトコルに従ってください。
<ol><li>逆転写 注:クリーンなPCR専用フードの下でこの手順を実行して、増幅されていないcDNAの微生物やその他の汚染を防ぎます。<ol>
<li>96ウェルブループレートを加熱プレートシーラーにホイルシールでシールします。</li>
		<li>次のように熱サイクラーで逆転転写反応を実行します: 53 °C 45 分 à 85 °C 5 分 à 4 °C ホールド. 注: これは安全な停止ポイントです。サンプルは72までの72の間4 °Cで保持することができる。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ポストRT精製<ol>
<li>核酸結合磁気ビーズと核酸サイズ選択磁気ビーズを室温と渦に持ち込み、再停止します。この時点で、65°Cで10分間サンプルクリーンアップバッファを解凍します。他のすべての試薬を室温および渦に持ち込む。</li>
		<li>表 2および表 3に示すように、バッファーを準備します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>化学的にエマルジョンを壊し、浄化します。<ol>
<li>これを行うには、プレートからホイルシールを静かに取り外します。</li>
		<li>各エマルションに125 μLのピンクエマルション破断試薬を分配します。1 分間待ってから、ボリューム全体をクリーンな 0.2 mL ストリップ チューブに転送します。ストリップチューブに透明な層とピンクの層があることを確認します。</li>
		<li>明確な層を妨げることなく、ストリップチューブの底からピンク層の125 μLを取り外します。ピンク層の少量(約15μL)がチューブ内に残るのは正常です。</li>
		<li>表2から200μLのクリーンアップミックスをストリップチューブに加え、室温で10分間インキュベートします。</li>
		<li>ストリップチューブを磁気スタンドに移し、溶液をクリアします。上清を取り出して廃棄し、80%エタノールでビーズを2回洗浄します。ビーズを1分間乾燥させます。</li>
		<li>磁石からストリップチューブを取り出し、表3からビーズに35.5μLの溶出液を加えます。ピペットは、溶液中のビーズを再中断します。室温で2分間インキュベートします。</li>
		<li>ストリップチューブを磁気スタンドに移し、溶液をクリアします。精製したcDNAをストリップチューブから取り出し、0.2 mLのストリップチューブをきれいにするために分配します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>cDNAを増幅します。<ol>
<li>以下の表4で増幅マスターミックスを準備する。</li>
		<li>各サンプルに65μLのcDNA増幅マスターミックスを追加します。ストリップチューブをサーマルサイクラーに入れ、次のプログラムを実行する:98 °C 3分の15サイクル[98 °C 15 s à 67 °C 20 s à 72 °C 1分] à 72 °C 5分 4 °C ホールド 注: これは安全な停止ポイントです。サンプルは72までの72時間のための4°Cで保持することができる。</li>
		<li>0.6倍の核酸サイズ選択磁気ビーズで増幅されたcDNAを浄化します。80%エタノールで2回洗浄し、40.5 μLで溶出します。</li>
		<li>自動ゲル電気泳動および蛍光ベースのDNA定量アッセイ36、37を使用して品質管理cDNAを実行します。 注: これは安全な停止ポイントです。サンプルは72までの72のか-20°Cで4°Cで保つことができる。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. シーケンスライブラリ構築
<ol><li>cDNA38のタグ付けとクリーンアップ .<ol>
<li>総体積の20μLでcDNAを50ngに正規化します。この手順では、正確な定量が重要です。</li>
		<li>表 5とアリコート 30 μL のタグ付けを、氷上の各 20 μL cDNA サンプルに合わせることができます。サンプルをサーマルサイクラーに入れ、タグ付けプロトコルを実行します:55 °C 5分à 10 °Cホールド。</li>
		<li>列38を使用してタグ付き cDNA のクリーンアップを実行します。各サンプルに180 μLのDNA結合バッファーを追加します。230 μL をスピンカラムに転送します。</li>
		<li>1300 x gで2分間遠心分離機を使用し、フロースルーを破棄します。</li>
		<li>300 μL DNA洗浄バッファーで2回洗浄します。エタノール除去を確実にするために、1300 x gでさらに2分を遠心分離します。</li>
		<li>カラムに31μLの溶出バッファーを加えて精製したタグを精製し、室温で2分間インキュベートした。</li>
		<li>精製された製品を回収するために1300 x gで2分間遠心分離機。</li>
	</ol>
</li>
	<li>サンプル インデックス PCR.<ol>
<li>多重シーケンス実行中に重複しないバーコードを選択します。</li>
		<li>表 6に示すように、サンプル インデックス PCR マスター ミックスを作成します。</li>
		<li>精製サンプルの30 μLにサンプルインデックスPCRマスターミックスの60 μLを追加します。</li>
		<li>各サンプルに20 μMの10 μL、4オリゴサンプルインデックスを追加します(使用されるレコードインデックス)。総反応量は100μLになりました。</li>
		<li>蓋を105°Cに設定したサーマルサイクラーに入れます。次のプログラムを実行する:98 °C 45 s à 12-14 サイクル [98 °C 20 s à 54 °C 30 s à 72 °C 20 s] à 72 °C 1 分 à 4 °C ホールド。 注: これは安全な停止ポイントです。サンプルは72までの72の間4 °Cで保持することができる。</li>
	</ol>
</li>
	<li>二重ビーズクリーンアップでライブラリを浄化します。<ol>
<li>サンプルに100μLの核酸サイズ選択磁気ビーズを加え、ピペットと十分に混ぜます。室温で5分間インキュベートします。</li>
		<li>磁石に移し、溶液がクリアされるまで放置します。上清を取り除いて捨てます。</li>
		<li>80%エタノールの200 μLで2回洗います。</li>
		<li>磁石のビーズを2分間乾燥させ、磁石から取り出し、ビーズペレットに50.5 μLのEBバッファーを加えます。バッファ内のビーズを再中断するピペット。</li>
		<li>室温で2分間インキュベート磁石に移し、2分間放置し、50μLのelutedサンプルをきれいなストリップチューブに移します。</li>
		<li>40μL核酸サイズ選択磁気ビーズを試料に加え、室温で5分間インキュベートし、磁石に移し、溶液を透明にします。上清を取り除いて廃棄します。</li>
		<li>80%エタノールの125 μLで2回洗います。</li>
		<li>磁石のビーズを2分間乾燥させ、磁石から取り出し、ビーズペレットに60.5 μLのEBバッファーを加えます。バッファ内のビーズを再中断するピペット。</li>
		<li>室温で2分間インキュベート磁石に移し、2分間放置し、50μLのelutedサンプルをきれいなストリップチューブに移します。これが最後のライブラリです。</li>
		<li>最大72時間、または-20°Cで4°Cでサンプルを無期限に保持します。これは安全な停止ポイントに注意してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>自動化ゲル電気泳動および蛍光ベースのDNA定量アッセイ36、37を用いて最終ライブラリの品質管理を定量し、実行する。品質管理を実行する前に、サンプルを 1:10 に希釈します。</li>
</ol>6. ライブラリのシーケンス
<ol><li>各サンプルを2 ng/μLに配列し、各正規化されたサンプルのプール3 μLを一緒に正規化します。</li>
	<li>蛍光ベースのDNA定量アッセイ37でプール濃度を測定する。</li>
	<li>プールを 0.25 ng/μL に希釈します。</li>
	<li>プールを次のように変性:希釈プールサンプルの12 μL(0.25 ng/μL)+1 μL DNA制御(1 nM)、2 μL EBバッファー+ 5 μL NaOH(0.4N)。これを5分間インキュベートし、200 mMトリスpH 8.0の10 μLを加えます。</li>
	<li>4.05 μL を 1345.95 μL HT1 にロードします。シーケンサーのカートリッジに1.3 mLをロードし、26サイクル(読み取り1)+8サイクル(i7インデックス)+0サイクル(i5インデックス)+55サイクル(読み取り2)のシーケンスレシピを使用して、製造元のガイドライン39に従って実行します。</li>
</ol>7. 位置合わせを読み取る (補足ファイル 1)
<ol><li>セル レンジャー (v2.0.0) を実行して、FASTQ ファイルへのシーケンスによって生成された未加工基本呼び出し (BCL) ファイルを多重化解除します。FASTQファイルをヒトB37.3ゲノムアセンブリおよびUCSC遺伝子モデルに合わせ、発現定量を得る。</li>
	<li>アライメント品質管理。<ol>
<li>位置合わせメトリックを生成し、Q30 ベース、有効なバーコード分数、セル関連の読み取り分率、マップされた読み取り分率、および各セルで検出された読み取り値を確認します。</li>
		<li>バーコードランクプロットを調べて、セルに関連付けられたバーコードと背景の分離を確認します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. データ分析(補足ファイル2)
<ol><li>細胞の品質管理と前処理。<ol>
<li>< 500 検出された遺伝子を持つ細胞を除外し、< 3000 一意の分子識別子(UMI)の合計数、> 0.2 生存率スコアを前述の32.組織および細胞のタイプに従ってカットオフを調節する。</li>
		<li>ダレットを取り外します。<ol>
<li>Rを用いて5つの内分泌ホルモン遺伝子(グルカゴン - GCG、インスリン-INS、ソマトスタチン-SST、膵臓ポリペプチド-PPY、およびグレリン-GHRL)を評価し、Rを用いて二モーダル発現パターン(高発現および低発現モード)を評価する。 パッケージmclust40.</li>
			<li>複数のホルモン遺伝子を発現する細胞、すなわち、高発現モードで2つ以上のホルモン遺伝子を発現する細胞を除去する。</li>
		</ol>
</li>
		<li>全UMIによる遺伝子発現を正規化し、RパッケージSeurat41を用いて細胞レベルで10,000のスケール因子を乗算する。</li>
		<li>3未満の細胞で検出された遺伝子を除去します。</li>
		<li>すべての細胞の平均発現と分散を使用して可変遺伝子を検出します。組織および細胞のタイプに従ってカットオフを調節する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>可変遺伝子を使用して主成分分析を実行します。選択した数の主成分を含むクラスターセル。1つの細胞クラスターと他の細胞を比較することにより、細胞クラスターを濃縮した遺伝子を導出する。</li>
</ol>

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<li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Div-Seq%3A+Single-nucleus+RNA-Seq+reveals+dynamics+of+rare+adult+newborn+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons.</a> Science. 353 (6302), 925-928 (2016).</li>
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</ol>

著者はいずれもリージェロン・ファーマシューティカルズ社の従業員および株主です。

近年開発された単細胞技術は、細胞型を特徴付け、ヒト膵島の分子不均一性を研究する新しいプラットフォームを提供します。我々は、ヒトの島を研究するために、液滴ベースのマイクロ流体単一細胞単一細胞単一細胞単一細胞単一細胞の単一細胞分離とデータ解析のプロトコルを採用した。我々のプロトコルは、配列の品質とバッチ効果の比較的小さな変動を持つ20,000以上の単一ヒトイストレット細胞からのRNAシーケンシングデータを正常に生成しました。
特に、このプロトコルでは、高品質の結果を生み出すには、2 つの手順が重要です。人間の島を解離する際には注意が必要です。島を消化し過ぎないようにすることが重要です。単一セルのパーティション分割は、単一セル実験を成功させるためのもう 1 つの重要なステップです。図3で良質および低品質のエマルションの例を示した。明確なエマルションは、通常、パーティション分割ステップで収集されるセルの数が不十分であることを示します。
単離された一次ヒト個体へのアクセスは、大...

膵島は、血糖値を調節するために内分泌ホルモンを放出します。機能的および形態的に異なる5つの内分泌細胞タイプは、この重要な役割に関与している:α細胞はグルカゴン、β細胞インスリン、δ細胞ソマトスタチン、PP細胞膵臓ポリペプチド、およびε細胞グレリン1を産生する。遺伝子発現プロファイリングは、正常または特定の状態で内分泌細胞を特徴付ける有用なアプローチである。歴史的に、全イレット遺伝子発現プロファイリングは、マイクロアレイと次世代RNAシーケンシング2、3、4、5、6、7を用いて生成された。,8.全てのイレットトランスクリプトームは、臓器特異的転写物および疾患候補遺伝子を同定するのに有益であるが、各イレット細胞型の分子不均一性を明らかにすることができない。レーザー捕捉微細解剖(LCM)技術は、島9、10、11、12から直接特定の細胞タイプを得るために適用されているが、標的細胞の純度に満ちばない人口。これらの制限を克服するために、蛍光活性化細胞選別(FACS)は、α細胞およびβ細胞13、14、15、16などの特定の内分泌細胞集団を選択するために使用されてきた。,17歳,18.さらに、Dorrellらは抗体ベースのFACS選別アプローチを用いてβ細胞を4つの亜集団19に分類した。FACSソートされたイレット細胞は、単一細胞のRNAシーケンシング用にメッキすることも可能です。しかし、プレートベースの方法は、スケーラビリティ20、21、22の課題に直面しています。
各内分泌細胞型の高品質で大規模なトランスクリプトームデータを生成するために、ヒトのイレット細胞にマイクロ流体技術を応用しました。マイクロ流体プラットフォームは、ハイスループット、高品質、スケーラブルな方法で多数の単一細胞からトランスクリプトームデータを生成します23,24,25, 26,27.大量に捕捉された細胞型の分子特性を明らかにするとともに、スケーラブルなマイクロ流体プラットフォームにより、十分な細胞が提供されたときに希少な細胞タイプを同定することができます。従って、ヒト膵島へのプラットフォームの適用は、グレリン分泌ε細胞のプロファイリングを可能にし、その希少性28に起因するほとんど知られていない機能を持つ稀な内分泌細胞型である。近年、技術29、30、31、32を用いたヒト島の大規模な転写データを報告する研究がいくつか出版されている。 33.このデータは、内分泌細胞の不均一性と疾患への影響を研究するために、公に入手可能で有用なリソースです。
ここでは、α-、β-、δ-、PP、ε細胞、および非内分泌細胞の小さな割合を含む約20,000個のヒトイヌアレット細胞のトランスクリプトームデータを生成するために使用されている液滴ベースのマイクロ流体単一細胞RNAシーケンシングプロトコルについて説明します。32.ワークフローは、孤立した人間の島から始まり、島細胞の解離、単一細胞のキャプチャ、およびデータ分析のステップを示しています。このプロトコルは、新たに分離された島を使用する必要があり、ヒトやげっ歯類などの他の種からの島に適用することができます。このワークフローを使用して、ベースラインおよび他の条件の下で公平で包括的な入り点細胞アトラスを構築することができる。

<table><tbody><tr><td>30 &micro;m プレセパレーションフィルター</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td>セルストレーナー</td></tr><tr><td>8チャンバースライド</td><td>Chemometec</td><td>102673-680</td><td>デル カウントアッセイスライド</td></tr><tr><td>バイオアナライザー 高感度 DNAキット</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td>QC用</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>シングルセル培地</td></tr><tr><td>クロムシングルセル 3' ライブラリ &Gel Bead Kit v2, 16 rxns</td><td>10X Genomics 120237</td><td></td><td>Single Cell Reagents</td></tr><tr><td>Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips)</td><td>10X Genomics</td><td>120236</td><td>Microfluidic chips</td></tr><tr><td>CMRL-1066</td><td>ThermoFisher</td><td>11530-037</td><td>Complete islet media</td></tr><tr><td>EB Buffer</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>Elution buffer</td></tr><tr><td>Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blue, semi-skirted</td><td>VWR</td><td>47744-112</td><td>エマルジョンプレート</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ThermoFisher</td><td>16000-036</td><td>完全な膵島培</td></tr>地 <tr><td>ヒト膵島</td><td>Prodo Labs</td><td>HIR</td><td>分離されたヒト膵島</td></tr><tr><td>L-グルタミン (200 mM)</td><td>ThermoFisher</td><td>25030-081</td><td>完全な膵島培</td></tr>地 <tr><td>Nextera DNA Library 調製キット (96 サンプル)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1031</td><td>Library調製試薬</td></tr><tr><td>NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles)</td><td>Illumina</td><td>FC-404-2005</td><td></td></tr><tr><td>Sequencing Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>ThermoFisher</td><td>15140-122</td><td>Complete islet media</td></tr><tr><td>Qubit High Sensitivity dsDNA Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td>for QC</td></tr><tr><td>Solution 18</td><td>Chemometec</td><td>103011-420</td><td>Cell counting assay試薬</td></tr><tr><td>SPRISelect</td>試薬<td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>B23318</td><td>浄化ビーズ</td></tr><tr><td>組織培養皿(10 cm)</td>島<td>培養</td>用<td>VWR</td><td>10861-594</td></tr><tr><td>TrypLEエクスプレス</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ12604-013</td>細胞<td>解離溶液</td></tr><tr><td>Zymo DNAクリーン&濃縮器-5、50反応</td><td>VWR</td><td>77001-152</td><td>ライブラリクリーンアップカラム</td></tr></tbody></table>

ヒト膵島の単一細胞rnaシーケンシングと解析

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

膵島は、特徴的なホルモン発現パターンを有する内分泌細胞からなる。内分泌細胞は、正常および病理学的状態に応答して機能的な違いを示す。このプロトコルの目的は、液滴ベースのマイクロ流体単一細胞RNAシーケンシング技術を使用して、各内分泌細胞タイプの高品質で大規模なトランスクリプトームデータを生成することです。このようなデータは、正常または特定の条件で各内分泌細胞型の遺伝子発現プロファイルを構築するために利用することができる。このプロセスには、慎重な取り扱い、正確な測定、および厳格な品質管理が必要です。このプロトコルでは、ヒト膵島の解離、シーケンシング、およびデータ解析の詳細な手順について説明する。約20,000個のヒト単一のイレット細胞の代表的な結果は、プロトコルの正常な適用を実証する。

単細胞RNAシーケンシングワークフローは、無傷のヒト島を単一細胞懸濁液に解離すること、液滴ベースの技術を用いて単一細胞を捕捉すること、およびRNA-seqデータを解析するという3つのステップで構成されています(図1)。まず、後天したヒト島を一晩インキュベートした。無傷の島を顕微鏡下で調べた(図2A)。解離されたイブリゲーション細胞の完全性は、その中のハイブリダイゼーションにおけるRNA蛍光(RNA-FISH)を用いて検証された。図2Bに示すように、解離されたα細胞およびβ細胞は、それぞれGCGおよびINS mRNAプローブを用いて可視化した。
単一細胞捕捉ステップの前に、細胞数と生存率を決定する必要があります。生存率が低いセルやデブリが高い...

ここでは、液滴ベースのマイクロ流体単一細胞RNAシーケンシング技術を用いて、単体ヒト膵島から単一細胞の高品質で大規模なトランスクリプトームデータを生成するプロトコルを提示する。

ヒト膵島の単一細胞RNAシーケンシングと解析

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

このプロトコルは、個々のヒト小胞体細胞の高スループット転写データを生成し、アノクロム細胞の異種性の研究、希少細胞タイプの同定、疾患における遺伝子調節に使用することができる。この手法は、より大きなスケールの単一セルデータを生成し、使いやすく、処理時間がかなり短い。この方法は、他の種からの小島に適用され、他の新たに単離された組織をプロファイルすることができます。しかし、プロトコルは、組織固有の解離手順に合わせて最適化する必要があります。高品質の解体細胞を準備することが重要です。.単一セル分割前の細胞懸濁液のQCが重要であり、エマルジョンを慎重かつ迅速に処理している。チップが詰まっているかどうかを知るようないくつかの品質のチェックポイントは、読み取りよりもよく見られます。ヒトの小島を得て一晩インキュベートした後、P200ピペットを用いて200~300個の小島をカウントし、ハンドピックする。5ミリメートルの完全な小島培地を含む15ミリメートルの円錐管に島を移し、摂氏37度に予め温めます。チューブを200回Gの遠心分離機に2分間置きます。底部のペレットを邪魔することなく、上清を優しく吸引します。1ミリメートルの予熱セル解離液を加え、上下に軽くピペット処理してペレットを破壊します。37°Cで9〜11分間、小島をインキュベートします。3分ごとにピペットを10秒間ゆっくりと上下させ、細胞を単一細胞に解約する。小子細胞が十分に解約され、溶液が曇ったら、完全な小子培地9ミリリットルを加え、30マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して新しい15ミリリットルの円錐管にフィルターを加えます。5分間Gの400倍で遠心分離により細胞を回収する。上清を吸引し、1X PBS 04%BSA溶液の200〜300マイクロリットルで細胞ペレットを再懸濁します。今度は、10マイクロリットルの細胞培養液を0.5マイクロリットルのAO/DAPIと混合する。ピペットを上下にして完全に混ぜます。スライドに10.5マイクロリットルをロードし、蛍光ベースの自動セルカウンターで細胞数アッセイを実行して、カウントと生存率を決定します。マイクロ流体チップをチップケースに入れる。チップケースの向きを変え、油田が実験を行う人に最も近い位置に位置することを確認します。ピペットを使用して、計算された細胞の体積を準備されたチューブストリップに追加します。5回混合するピペット。ピペットチップを捨てずに、90マイクロリットルの細胞混合物をチップの1つを漕ぐ。30秒間待ってから、ピペットを非常にゆっくりとピペットに入れて、40マイクロリットルのゲルビーズを2行にロードします。270マイクロリットルの分割オイルを3行目の井戸に分配します。チップホルダーのタブにチップガスケットをフックします。組み立てたチップホルダーをシングルセルの分割

single-cell-rna-sequencing-and-analysis-of-human-pancreatic-islets

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

ヒト膵島の高品質と適切な量を達成することが成功した膵島移植のための著名な前提条件の一つです。このビデオでは、我々は段階的に説明し、人間の膵島を分離するための手順：変更された自動化法を用いて（パートI消化および膵組織のコレクション）。...

人間の膵島単離：パートI：膵組織の消化とコレクション

免疫組織化学染色した膵臓標本の大規模な調達と分析の新たなコンピュータ支援の方法が説明されています：セクション全体の（1）仮想スライスのキャプチャを、大規模データの（2）質量分析、2D仮想スライスの（3）復興（4）3Dの膵島のマッピング、および（5）数理解析。...

膵島質量、サイズ分布とアーキテクチャのコンピュータ支援大規模可視化と定量化

レーザーマイクロダイセクションでは、実質の微量から選択された細胞の回復を可能にする技術です。ここでは、トランスクリプトーム研究のために使用される手術標本からヒト膵島を取得するためのプロトコルを記述します。我々のプロトコルは、このように彼らのコレクションを容易にして、ヒトβ細胞の内因自家蛍光を向上させます。...

手術標本からヒト膵島のレーザーマイクロダイセクションのために改良されたプロトコル

前のヴィヴォ膵研究、糖尿病研究のため重要です。ネイティブ 3 d アーキテクチャで培養膵島を研究する既存の技術は、時間がかかり、非効率的で、使用頻度の低いです。この作品は、全体培養膵島の高品質パラフィン...

パラフィン セクションの埋め込み膵島

マウス膵臓内分泌細胞の単一細胞トランスクリプトーム解析

このプロトコルは、一次ヒト化物試料からベータ細胞に特異的にミトファジータンパク質複合体形成の定量分析のための方法を概説する。この技術により、貴重なヒト膵臓ベータ細胞サンプルにおいて重要な限られた生物材料からのミトファジーの分析が可能になります。...

近接リゲーションアッセイを利用したヒト膵臓ベータ細胞における内因性ミトファジー複合体の可視化

このプロトコルでは、膵島は、専用のマルチプラットフォームアプリケーションに実装された計算アルゴリズムを使用して再構築および分析されます。...

構造・機能解析ツールとしての膵島の計算再構成

膵臓の転生細胞は、膵臓腫瘍を引き起こす悪性細胞の前駆体です。しかし、無傷の生膵細胞を単離することは困難です。ここでは、膵臓組織を解離するための効率的な方法を紹介します。その後、細胞はシングルセルRNAシーケンシング(scRNA-seq)または2次元または3次元の共培養に使用できます。...

生存可能な単一細胞を単離するための膵臓組織解剖

このプロトコルは循環アデノシンの一リン酸塩(cAMP)の生物センサー、 その場 (cADDis)のcAMPの相違の探知器のアデノウイルス配達を使用して細胞内シグナリングでき事およびインシュリンおよびグルカゴンの分泌およびmicroperifusionシステムの同時獲得そしてco登録のための方法を記述する。...

蛍光バイオセンサーの動態とホルモン分泌プロファイルの同期評価のためのヒト偽島システム

このプロトコルは、全膵臓からのマウス内皮細胞の単離を説明しています。...

マウス膵臓内皮細胞の単離

このプロトコルは、凍結した非ヒト霊長類膵島から高品質の核を単離し、単一核同時RNAシーケンシングおよびATACシーケンシングで使用すると同時に、同じサンプルからのメタボローム分析のためのバルク細胞質画分を保持する手順を説明しています。...

単一核RNAシーケンシングとATACシーケンシングの組み合わせ、およびバルクメタボロミクスのための凍結非ヒト霊長類胎児膵島の調製

学ぶ ヒト膵島細胞の単一細胞RNAシーケンス解析手法。ドロップレット型マイクロ流体デバイスを用いて細胞異質性と遺伝子発現を解析し、糖尿病研究における希少細胞型の同定と治療標的発見に貢献します。

ヒト膵島の単一細胞RNAシーケンシングと解析

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