Name: 生体活性親水性球状タンパク質の捕捉に対するナノリポソームの調製と特性解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 s
Description: 学ぶナノリポソームの調製法。薄膜法でタリンを封入し、動的光散乱と走査型電子顕微鏡で特性解析する。高い封入効率と安定性を実現し、親水性タンパク質のドラッグデリバリー応用に貢献する。

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著者は、COPPE/UFRJ、電子顕微鏡検査研究所、およびマルチユーザー材料特性分類実験室施設に感謝しています。アダルベルト・ヴィエラ博士、ジェニファー・ロウ博士、ラファエル・リンドソ大学教授に対し、ブラジルのUFRJ大学の教授は、超遠心分離機の使用を行いました。アレクサンドル・ゲーデス・トーレス博士とダニエル・ペローネ博士に、ロータリーエバポレーターの使用のために、ブラジルのUFRJであるリオデジャネイロ大学の教授たち。ベルリンのフリー大学のローランド・ボドマイヤー教授とアンドリー・ダシエフスキー博士に、資源を手伝い、新しい方法論を提供し、ドイツでの6ヶ月間のエラスムス+フェローシップの間にACNTFを監督しました。ロッサナ・ティレ博士とアライン・フェルナンデス博士、ゼータサイザー・マルバーンの使用のために、ブラジルのUFRJ、リオデジャネイロ大学の教授と技術者に。ブルマ・グエンターとタイサ・ロドリゲス、ユニバーシダーデ連邦ド・リオデジャネイロ、UFRJ、ブラジルの教授と技術者に、SEMの使用のために;ナレーションのために、ファンダサン・オズワルド・クルスの研究者、レイチェル・アン・ハウザー・デイビス博士に。この研究は、一部は、Coordenaçãoデアペルフェイソアメントメントデペッソアルデニヴェルスーペリア、ブラジル(CAPES)- 財務コード001(助成金番号1627392;1811605)によって資金を調達しました。フンダサン・カルロス・シャガス・フィリョ・デ・アンパロ・ア・ペスキサ・ド・エスタド・ド・リオデジャネイロ(FAPERJ)(助成金No.E-26/202.815/2018;E-26/202.815/2018;E-26/203.039/2015およびE-26/202.860/2016);コンセルホ・ナシオナル・デ・デセンボルヴィメント・シエンティフィコ・エ・テクノロジコ(CNPq)(助成金第406601/2018-6)、フィナンシアドラ・デ・エストゥトス・エ・プロジェトス(FINEP)。

1. タリンリポソームナノカプセルの調製16
注:すべての調製物は、より大きな体積(7 mL)を得て、サンプルが超遠心分離機で遠心分離されることを可能にするために三重に調製する必要があります(下記の詳細を参照)。
<ol><li>表 1に示すように、分析バランスを使用してリポソーム成分の重量を量る。</li>
	<li>ロータリーエバポレーターに収まる250mLの体積フラスコを使用してクロロホルムで脂質成分を溶解し、材料の損失を防ぎます。</li>
	<li>150 rpmで15分間撹拌します。</li>
	<li>次の条件下でロータリーエバポレータを使用してクロロホルムを除去します。<ol>
<li>加熱風呂の水と接触しながら、最適な効率のために、体積フラスコ口を標準位置(25°)に調整します。 注:機器アームは、蒸発効率に影響を与えたり、サンプルを損傷したりしない間、体積フラスコと水浴の間の接触を維持するために25°で傾斜する必要があります。標準位置は、機器のブランドによって異なる場合があります。</li>
		<li>コンデンサー温度を最低3°Cに設定します。</li>
		<li>加熱浴温を40±1°Cに設定します。</li>
		<li>回転を 120 rpm に設定します。</li>
		<li>真空を207mbarに調整し、沸点を20°Cに調整します。</li>
		<li>約25分後、フラスコを取り出し、蒸発した溶媒を捨て、凝縮器に残り、適切に。 注:リポソーム成分からなる薄くて不透明なフィルムは、このステップで形成され、容易に視覚化することができます。凝縮器に残っている蒸発溶媒は、適切な廃棄のために専門会社が取り扱う処分受領者(塩素化)に保管する必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>脂質フィルムを水和して、1mg/mLでタリンを含む0.3M硫酸アンモニウム溶液(pH=7.4)で0.01M脂質濃度に達し、最終体積は10mLに達する。<ol>
<li>混合物を40分間撹拌し、4°Cで一晩インキュベートする。 注: このステップはストップ ポイントと見なすことができます。一晩のインキュベーションは必須ではありません。</li>
	</ol></li>
	<li>インキュベーション後、25°C(室温)で1分間懸濁液を超音波処理します。RT)小胞のサイズを減らし、凝集を避けるために。 注:サイズの減少は、次の条件下で超音波超音波装置で行われました:130 Wと40 kHz。</li>
	<li>0.2 μmのポリカーボネート細孔膜を通して12サイクルの押し出しを行います。 注:押出プロセスの前に、サンプル漏れを避けるために水を使用してミニ押出機アセンブリをテストします。0.1 μmの細孔膜も適しています。この場合、脂質とタンパク質の両方の物理化学的特性を維持しながら、押し出しを容易にするために、脂質転移温度の上にミニ押出器ホルダーを予熱する。<ol>
<li>製造元のマニュアルに記載されているように、ミニ押出機の部品にフィットします。</li>
		<li>ポリカーボネート膜を2つのプレウェットフィルターサポートの間に置き、ホルダーに入れます。</li>
		<li>1 mLの空の注射器を装置に挿入し、リポソーム懸濁液で他の注射器をその総容積に充填し、反対側に挿入する。</li>
		<li>0.2 μmのポリカーボネート細孔膜を通して12サイクルの押し出しを行います。サンプルを注射器から別の注射器にゆっくりと押し込みます。予おかされたチューブに押し出された懸濁液を集める。 注:ポリカーボネート膜は、あるシリンジから別のシリンジへのサンプル転移が困難になった場合にのみ交換する必要があります。リポソームサスペンションは、SUVの形成によるサイズ縮小の結果として押し出しプロセス中に明確になる必要があります。このステップでは、サンプルの約0.2 mLが失われる可能性があります。</li>
	</ol></li>
	<li>超遠心分離により別々のリポソームを分離する。 注:超遠心分離機を使用する準備ができるまで、氷浴でサンプルを維持します。スイングバケットローターを備えた超遠心分離機を用いた超遠心分離による残りのコンポーネントと硫酸アンモニウムを分離します(下記の詳細を参照)。<ol>
<li>ローターに合うチタンチューブでサンプルを計量し、チューブのバランスをとります。チューブの損傷を防ぐために使用されるローターに従って必要な最小体積を確認し、必要に応じて硫酸アンモニウムでリポソーム懸濁液量を調整します。 注:遠心分離機の外側では、回転速度を決定するために遠心分離機で使用される「シマウマストライプ」(底部の黒と白のストライプ)を傷つけないように、スイングバケットは常にスタンドでサポートする必要があります。</li>
		<li>遠心分離機を使用する前に真空をオンにして、冷蔵できるようにします。</li>
		<li>チタンチューブをスイングバケツに取り付けます。 注:チューブを走行時に想定する位置に持ち上げて、完全にフィットしていることを確認します。</li>
		<li>真空を離し、遠心分離機のドアを開け、ローターを中に入れます。 注:ローターの底面の円マークに注意してください。</li>
		<li>遠心分離機のドアを閉じ、真空を押し、真空が200から&lt;20ミクロンまたは26 Paから&lt;3 Paに達するまで待ちます。</li>
		<li>超遠心分離機ディスプレイのパラメータを150,000 x g(前述のスイングバケットの29,600 rpmに相当)に4°C(加速度:最大、減速:最大)で90分間調整します。 注: 特定の遠心分離機が rpm に設定されている場合は、常に速度を x gに変換します。遠心分離機のウェブサイトを使用して、使用するローターに従ってユニットを変換します。</li>
		<li>[リコール] を押し、条件を確認し、[開始] を押して実行します。 注: 遠心分離機が目的の速度に達するまで待ちます。</li>
		<li>90分後、真空ボタンを押して真空を解放し、真空が200-700ミクロン(26-93 Paに相当)に達したときに遠心分離機のドアを開きます。</li>
		<li>遠心分離機を切り、内側からローターを取り外し、バケツを乾かしてベンチに置きます。</li>
		<li>氷の上に超遠心サンプルを維持します。</li>
	</ol></li>
	<li>慎重に、上清とペレットを分離するために使い捨て15 mL遠心管にチューブを逆さまにすることによって、ペレットから上清を分離します。 注:封入されていないタンパク質を含む上清を4°Cに保管してください。カプセル化の効率を決定するために使用されます。ペレットは半透明のゼリーとして現れる。</li>
	<li>HEPES緩衝生理生理中の封入タンパク質を含むペレット(1x HBSの3mL)を中断する。 注:HBS 2x(ストック溶液)は、蒸留水中の試薬の次の量を希釈することによって調製されます:140 mM NaCl、1.5 mM Na2HPO 4、50 mM HEPES、その後、pHを7.4に調整し、最終容積を100mLにします。Na2HPO4は、リポソーム濃度が決定される場合に干渉を避けるためにNaHCO3に置換することも、干渉を避けるために省略することもできる。 HBS 2xストック溶液は、使用前にHBS 1xを得るために蒸留水中で希釈する必要があります。</li>
</ol>2. カプセル化効率
注:タンパク質定量における脂質干渉を回避するために、Petersonのプロトコル17を使用してカプセル化効率を決定する。すべてのサンプル(BSA規格およびリポソーム上清)は三重で分析されるべきである。また、ブランクチューブを準備します。
<ol><li>ストック試薬および作業ソリューションの調製17<ol>
<li>ストック試薬の場合は、炭酸ナトリウム20%の10mL、硫酸銅0.1%の200μL、200 μLの0.2%の硫酸カリウムを9.6mLの蒸留水で混合して、炭酸銅(CTC)を調製します。10%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)および0.8N水酸化ナトリウム(NaOH)の100 mLを調出します。</li>
		<li>作業溶液の場合は、デオキシコレートナトリウム(DOC)および72%トリクロロ酢酸(TCA)の10 mLを調記します。10mLの蒸留水にウシ血清アルブミン(BSA)を10mgを溶解し、1mg/mL標準溶液を得た。CTC、NaOH、SDS、およびH2 Oの等しい部分を加えて試薬Aを調製し、蒸留水中にフォリン・シオカルテウ・フェノール試薬1:5を希釈して試薬Bを調製する。 注:試薬Aは各反応管に対して1mLを必要とし、試薬Bは0.5mLを必要とする。試薬AおよびBの最終容積を決定するには、まず使用する反応管の数を定義し、三量三極内のBSA、ブランク、およびサンプルの3つの異なる濃度を考慮します。試薬Aは、使用前に十分に均質化されなければならず、25°C(RT)で2週間保存することができます。試薬Bは、琥珀色のボトルに保存した場合も25°C(RT)で安定である。</li>
	</ol></li>
	<li>沈殿 物 注:このステップはマイクロ遠心管で行われる。<ol>
<li>5-100 μgのタンパク質を含む1 mLの最終容積に水でリポソーム上清を希釈します。 注:ブランクチューブは、蒸留水の1 mLで満たされるべきです。</li>
		<li>0.15%DOCの0.1 mLを加え、渦によって均質化し、RTで10分間インキュベートする。</li>
		<li>72% TCA の 0.1 mL を追加し、よく混ぜ、遠心分離機を 3,000 x gと RT で 15 分間追加します。 注:DOC-TCAはタンパク質沈殿を促進し、2つの異なる相を形成する。標的タンパク質は遠心分離によって回収することができ、脂質の干渉を回避する。</li>
		<li>チューブを下方に置き、吸収性の紙の上に置くことによって、慎重に上清を廃棄します。後続のステップのペレットを保存します。 注:ペレットは見えにくいかもしれませんが、目に見えない場合でもチューブを逆さまにする必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>分光光度計<ol>
<li>ステップ2.2.4から得られたペレットを1mLの蒸留水に吊り下します。ペレットが溶解していることを確認し、新しい試験管にサンプルを転送するために完全に混合します。</li>
		<li>アルブミン(BSA)規格の希釈を最終容積1mLに調剤する。 注: タンパク質規格は、5~100 μg/mLの間で調製する必要があります。</li>
		<li>ステップ2.3.1および2.3.2からチューブに試薬Aの1 mLを例外なく加え、よく混ぜ、RTで10分間インキュベートします。 注:SDSはタンパク質の可溶化を助けながら、可能な脂質の干渉を緩和することができます。</li>
		<li>ステップ2.3.1および2.3.2からチューブに試薬Bの0.5 mLを加え、よく混ぜ、光から保護しながらRTで30分間インキュベートします。 注:Follin-Ciocalteuフェノール試薬は、タンパク質などのいくつかの窒素含有化合物の着色アッセイに使用されるホスモリブデートとホスホトンステートの混合物です。銅の複雑化は、この試薬に向かってフェノールの反応性を増加させ、タンパク質濃度に応じて青/紫色の複合体を生成します。</li>
		<li>分光光度計を使用して750nmの吸光度を決定します。</li>
		<li>標準曲線に基づいて上清中のタンパク質濃度を以下のように算出する。<ol>
<li>線形傾向線を考慮して角度係数(k)を得るために吸光度値(Abs)対BSA濃度(mg/mL)をプロットする。</li>
			<li>上清タンパク質濃度(C)を吸光度値と角係数(k)の比率で決定し、次のように総体積を掛けます。 <img alt="濃度計算式、C=[Abs/k]×上清体積、吸収研究に関連しています。" src="/files/ftp_upload/59900/59900eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1">
</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>次の式に従ってカプセル化の効率を決定します。 <img alt="タンパク質カプセル化率計算式を示すカプセル化効率式。" src="/files/ftp_upload/59900/59900eq2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2"></li>
	<li>ここで、読み込まれたタンパク質=10mg、非カプセル化タンパク質=ステップ2.3.6.2で得られたCの値。 注:この場合、硫酸アンモニウム溶液に溶解した合計10mgのタリン(1mg/mL)を用いて封入手順を行い、この濃度はインビトロ効果13、16で満足のいく得られるのに十分であるので、 18.</li>
</ol>3. サイズと安定性の決定
注:リポソーム製剤のサイズ分布およびポリ分散指数(PdI)は、動的光散乱(DLS)によって評価される。0.1 に近い PdI は、均質な調製を示します。安定性の決定のために、リポソームを4°Cで保存し、サイズ分布とサイズ平均を定期的にチェックします。
<ol><li>レーザーランプをウォームアップする前に、DLS機器の電源を30分オンにします。</li>
	<li>ステップ1.10で得られたリポソーム製剤を使い捨てサイジングキュベットに移す。</li>
	<li>装置パラメータを次のように設定します: 分散型 = 水 (RI = 1.33)。材料 = 脂質 (RI = 1.45);とRT。</li>
	<li>[開始] を押して、機器が読み取りを終了する間待ちます。</li>
	<li>キュベットを取り外し、機器の電源を切ります。 注:後続の分析のために、キュベットから使い捨て15 mL遠心チューブにサンプルを戻すか、新しい読み取りに十分な量がある場合は廃棄してください。</li>
</ol>4. 形態学的特徴付け
注:リポソームの特徴付けは、ムルテイとラマサミー19に従って行われます。ステップ1.10で得られたナノリポソームを含む試料は、三分三で調製される。
<ol><li>ガラスカバーリップ(直径13mm)を両面テープでペトリ皿の底面に固定します。テープを小さく切り(カバースリップを固定するのに適したサイズ)、下の保護紙を取り外し、ペトリ皿の底に固定します。ピンセットの助けを借りて、テープの上に保護紙を取り外し、その上にカバースリップを修正します。 注: 次の手順では、カバースリップを解放せず、強力なテープを使用しないように注意してください。</li>
	<li>カバーをポリL-リジンでコーティングします。水分を維持するためにペトリ皿の中に濡れフィルターペーパーを置き、RT(25°C)で1時間インキュベートします。</li>
	<li>コーティング後、カバースリップを蒸留水ですすいでください。</li>
	<li>ステップ1.10からサンプルの滴でカバーリップを充填し、RTで1時間乾燥させます。</li>
	<li>サンプルを固定するには、0.1 Mリン酸バッファー、pH = 7.2で調製した4%グルタルアルデヒドでそれらをカバーします。ペトリ皿の中に濡れフィルターペーパーを入れ、水分レベルを維持するために皿を密封します。4°Cで48時間インキュベートします。</li>
	<li>同じリン酸バッファーでカバースリップを3x5分間すすいで下します。</li>
	<li>以下のようにサンプルを脱水:35%エタノール1x15分、15分間50%エタノール1x、15分間75%エタノール1x、15分間95%エタノール2x、20分間の絶対エタノール3x。</li>
	<li>ヘキサメチルジラザン(HMDS)の1−2 mLに浸漬2xでサンプルを化学的に乾燥させます(HMDS)。 注:HMDSは、ヒュームフード内で慎重に操作する必要があります。サンプルは、デシケータ内またはRTのヒュームフード内で一晩乾燥させるべきです。</li>
	<li>乾燥したサンプルを炭素伝導粘着テープでスタブに取り付けます。</li>
	<li>金パラジウムの電気伝導層(厚さ20nm)を有する真空中のカバースリップの表面をスパッタする。</li>
	<li>低真空モードおよび低電圧(20 kV)で走査型電子顕微鏡(SEM)で画像を記録します。</li>
</ol>

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著者は何も開示していない。

本明細書に記載のプロトコルは、コロカシア・エスキュレンタ22から精製された免疫調節および抗腫瘍レクチンを封入するためにCorreaら16によって試験された。この方法論は成功した結果をもたらし、治療用途に適したサイズの安定したナノリポソームの製造を可能にした。製剤は、生理学的条件下で異なるpHレベルで制御放出を提示する。また、ヒト神経膠芽腫U-87 MGおよび乳癌MDA-MB-231細胞株の阻害およびマウス骨髄細胞の刺激などのタリン薬理学的特性を増強する。リポソーム製剤は、健康なマウス細胞16において毒性作用を示さなかった。
Bangham et al.7によって最初に説明された古典的な方法は、大きなマルチラメラリポソーム小胞の生産を可能にし、サイズおよび形状が不均一である。本研究で報告されているように、この方法の適応は、0.2 μmのポリカーボネート膜を通る超音波処理および押出などの追加ステップを含むことで正常に適用される。これは、ナノメートルの範囲16、23、24のサイズに関するより均質な分散の生産を可能にする。したがって、成功した結果を確実にするために、ここで説明する封入プロトコルおよびリポソーム製剤は厳密に従うべきである。
ナノリポソーム組成物は、DOPE、MPEG 2000-DSPE、およびCHEMSを主成分として二層膜の形成を確実にするために慎重に選択した。これらは自然な動物膜二層成分であり、後者はナノリポソームアーキテクチャに流動性を与えることができ、ヒトにおける生理活性化合物送達のための広範な適用を保証する。
ナノリポソームペギル化は、リポソーム構造安定性を保証するために不可欠です。PEGの不在はサイズの拡大、高い多分散率および低い捕獲効率につながる。最適な結果は、主なリポソーム成分としてDOPEを使用して得ることができる。しかし、これは高コストのリン脂質である。ナノリポソーム産生の財政的コストは、DOPC(1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン)などの他の同様の脂質とDOPEを置き換えることによって達成することができます。CHEMSは、動物細胞膜に自然に見出されるコレステロール分子であり、これは製剤から除外してはならないが、脂質二重層の流動性および可鍛性16を確保することが重要であるからである。
カプセル化プロトコルの他の側面も適応できます。リポソーム成分を溶解するために使用されるクロロホルムは、サイズ平均、均質性、および捕捉効率に影響を与えなく、メタノールに容易に置き換えることができます。しかし、いくつかのタンパク質漏出は、4 °C16の下の貯蔵で発生する可能性があります。タリンを含む硫酸アンモニウム溶液による一晩のインキュベーションステップは必須ではありません。しかしながら、便宜上、Correaら16によって実証されるように、ナノリポソーム生物物理学的特性、カプセル化、または安定性効率の損失に損傷を与えなく行うことができる。押出工程は室温で行われ、0.1 μmの細孔サイズの膜を使用すると、シリンジ間の流量を減少させることができる。
この問題を克服するために、0.2 μmの細孔サイズの膜の使用または脂質転移温度の上の押出器ホルダーの加熱を考慮する必要があります。アナリストは、不活性化され、生物学的活性を失う可能性のある脂質やタンパク質を損傷しないように注意する必要があります。あるいは、リポソーム調製物は、超遠心分離の代わりにHBSに対して透析することができ、タンパク質分子量に応じてカットオフ膜を用いることができる。超遠心分離後にナノリポソームが懸濁されるバッファーの化学的性質の選択は、その後の適用に直接関連する。本研究の視点はインビボおよびインビトロアッセイに含まれるため、HEPES緩衝生理生理中の懸濁液は、細胞毒性作用を全く確保し、生理学的条件に近いpH範囲を確保するのに十分であった。
リポソームは、生細胞と同様に細かく処理し、より高品質のSEM画像を得る必要があります。固定および乾燥手順は、真空条件下で20kV以上の値をサポートする小さな無傷の小胞の視覚化を確保するために重要です。図 2A、Bは押し出しプロシージャと互換性があるナノサイズの小胞を表示する。この手順に従って十分なサンプル調製を行えば、51~396nmまでの小胞の可視化が可能である。ステップには、固定、エタノール濃度の増加による乾燥、真空および電子ビームによって引き起こされる凝集体および破裂した小胞の形成を避けるために化学脱水が含まれる。一方、図2C,Dは、室温下で乾燥したリポソーム小胞を示し、ここで説明する治療を受けていない、不十分に調製されたことを意味する。 不十分な手順の結果として、0.2 μmの細孔サイズの膜を押し出した後でも、巨大な小胞が形成される。破裂した小胞は、真空および電子ビーム損傷の結果として両方のパネルでも観察される。
ナノリポソーム小胞は、大腸癌細胞に対する生理活性化合物であるレスベラトロール(3,5,4'-trihydroxystilbene)を含む疎水性分子の封入および送達システムとして探索されてきた。封入手順は、生体適合性、生分解性、非免疫原性、およびリポソームナノカプセル25に固有の非毒性特性を提供することに加えて、親油性化合物の不溶解性を克服することができる。プロトコル適応は、経口投与のための新しいリポソーム製剤の開発など、投与経路および目的に応じて考慮されなければならない。

近年、効率的な薬物送達システムを調査する研究が増えている。しかし、迅速なクリアランス、生体分布の悪さ、生理的pHの溶解性、細胞の取り込み不足などの限界を超える必要があります。ナノシステムの使用は、がん治療の最近の進歩として出現し、健康な細胞の毒性を最小限に抑えながら、癌細胞内の薬物の細胞内濃度を増加させるために適用される。さらに、異なる範囲の材料(ポリマー、デンドリマー、リポソーム、ウイルス、カーボンナノチューブ、酸化鉄や金などの金属)から得られるナノ粒子は、抗癌効果を高め、全身性を低下させるために現在適用されています。毒性1.特にリポソームナノカプセルは、製薬、化粧品、食品業界において多くの用途に応用されている。近年、リポソーム技術2を用いてビタミン、酵素、ハーブエキスなどの様々な栄養補助食品が配合されている。
リポソームは、水性媒体3、4におけるリン脂質の分散によって自発的に形成される1つ以上の同心性脂質二層体からなる球状小胞である。リン脂質の極性頭部は、水性環境と接触して、膜の外側および内面に位置する。対照的に、脂肪酸鎖は膜の疎水性コアを形成し、水5から保護される。それらを魅力的な薬物送達システムを作るリポソームのいくつかの属性は、それらの生体適合性、生分解性、非免疫原性、非毒性、および親水性化合物および疎水性化合物6の両方を捕捉する能力を含む。
リポソームは、攪拌、超音波処理、押出、凍結、凍結、解凍などの様々なプロセスステップを使用して調製することができます。古典的な方法は、逆相蒸発、溶媒注入、および洗剤透析を含む。最も適用される方法は、薄い脂質膜水和であり、バンガムの方法としても知られており、小胞脂質形態7、8、9、10、11を得るために使用される。ラメラリティ(リン脂質二重層の数)と粒子サイズは、リポソームを1)ユニラメラ小胞(ULV)として特徴付けるために使用される古典的なパラメータであり、ユニークなリン脂質二重層によって形成され、以下のようにサイズが変化する:i)小さなユニラメラ小胞 (SUV, ~0.02-0.20 μm), ii) 大型ユニラメラ小胞 (LUV, ~0.2-1.0 μm), iii) 巨大なユニラメラ小胞 (GUV, >1 μm);または2)マルチラメラ小胞(MML、>0.1 μm)3、12.小胞の大きさは、<200 nmのサイズが内皮バリアを横断し、腫瘍組織に到達することを可能にするのに理想的である癌治療などの治療的使用を考慮する際に重要なパラメータである4。
本明細書において、薄脂質膜技術7の古典的な水和に続く封入手順を、タリンを用いて説明した、親水性球状タンパク質13、14、15として特徴付ける植物レクチン.ナノサイズの小胞は、主な技術に超音波処理および押出工程を含むことによって産生され、その結果、高い捕捉効率を持つ安定したリポソームナノベシクルを得る16。

<table><tbody><tr><td>硫酸アンモニウム</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>Analitycal Ballance Mettler H10Twメト</td><td>ラー株式会社</td><td>417870</td><td></td></tr><tr><td>ベックマン DU-640 分光光度計</td><td>ベックマン・コールター</td><td>8043-30-1090</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>シグマ・アルドリッチ社</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>ビュッヒ・ロタバポロ R-300 ロータリーエバポレーター コントローラーと V-300 ポンプ付き</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>05-001-022PM</td><td></td></tr><tr><td>CHEMS (コレステリルヘミスコハク酸)</td><td>シグマ・アルドリッチ社</td><td>C6512</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>48520-U</td><td>注意</td></tr><tr><td>銅 (II) 硫酸塩 (五水和物)</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ (直径 13mm)</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>EW-01839-00</td><td></td></tr><tr><td>DOPE (1,2-ジオレオイル-sn-グリセロール-3-ホスホエタノールアミン)</td><td>リポイド GMBH</td><td>565600.1</td><td></td></tr><tr><td>エタノール アブソリュー</td>ト <td>Sigma-Aldrich Co</td><td>32205</td><td></td></tr><tr><td>Folin -Ciocalteu フェノール試薬</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>F9252</td><td></td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>440191</td><td>CAUTION</td></tr><tr><td>JEOL JSM-6460 LV Sacnning Electron Microscope</td><td>JEOL Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ミニ押出機 7</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>MPEG 2000-DSPE 1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3- ホスホエタノールアミン-N-[アミノ(ポリエチレングリコール)-2000] (アンモニウム塩)</td><td>リポイド GMBH</td><td>588200.1</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-90k 超遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>PN LL-IM-12AB</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝液</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>P3619</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>L-酒石酸カリウム モノ塩基性</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>243531</td><td></td></tr><tr><td>炭酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>S7795</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム (DOC)</td> <td>Sigma-Aldrich Co</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二塩基性無水</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>RES20908-A7</td><td></td></tr><tr><td>TESCAN VEGA 3 走査型電子顕微鏡</td><td>TESCAN</td><td>#657874</td><td></td></tr><tr><td>トリクロロ酢酸 (TCA)</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>91230</td><td></td></tr><tr><td>ゼータサイザー ナノ ZSP</td><td>Malvern Panalytical LTD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超音波洗浄バス model 2510</td><td>Branson</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

生体活性親水性球状タンパク質の捕捉に対するナノリポソームの調製と特性解析

Preparation and Characterization of Nanoliposomes for the Entrapment of Bioactive Hydrophilic Globular Proteins

リポソームナノカプセルは、製薬、化粧品、食品業界で多くの目的に適用されています。リポソームの属性は、その生体適合性、生分解性、非免疫原性、非毒性、および親水性化合物および疎水性化合物の両方を捕捉する能力を含む。有機溶媒中の薄脂質膜の古典的な水和は、植物レクチンであるタリンをナノリポソーム中に封入する技術として本明細に適用される。ナノリポソームサイズ、安定性、捕捉効率、および形態特性が詳細に説明される。ナノリポソームは、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロール-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[アミノ(ポリエチレングリコール)-2000](アンモニウム塩を使用して調製されます。DSPE-MPEG 2000)、及びコレステリルヘミコン酸(CHEMS)を主成分として有する。脂質は、まずクロロホルムに溶解し、その後、一晩閉じ込められ、インキュベートされるタンパク質を含む硫酸アンモニウム溶液中で水分補給される薄い脂質膜を得る。次に、超音波処理および押出技術を適用して、ナノサイズのユニラメラ小胞を生成する。ナノベシクルのサイズと多分散性指数は動的光散乱によって決定され、ナノベシクル形態は走査型電子顕微鏡によって評価される。捕捉効率は、最初にロードされたタンパク質の元の量に対するカプセル化されていないタンパク質の量の比率によって決定される。均質リポソームは、平均サイズ155nmおよび多分散性指数値0.168で得られる。83%の高い封入効率を達成する。

図1は、ナノリポソーム調製物16、20、21を記載する。リン脂質、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロール-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[アミノ(ポリエチレングリコール)-2000] (アンモニウム塩;DSPE-MPEG 2000)と、主なリポソーム成分であるコレステリルヘミコン酸(CHEMS)と、まずクロロホルムに溶解し、脂質膜を得た。次いで脂質膜を包入する親水性タンパク質(タリン)を含む硫酸アンモニウム溶液中に再水和し、インキュベーションを一晩行った。次に、超音波処理および押出技術を適用し、小さなユニラメラ小胞を生成した。超遠心分離工程では、リポソーム製剤をフリー脂質および封入されていないタンパク質から分離し、上清は捕捉効率の決定に使用した。
前述の方法論を用いて製造されたナノリポソームは、51−396nmおよび平均サイズ155nm(表2)の範囲のサイズ分布を示した。多分散指数は0.168であったので、調製は均質であった。リポソームが0.2 μmの細孔サイズの膜を通して押し出された場合、83%の高い捕捉効率に達することができます(表2)。
形態学的ナノリポソーム特性をSEM.図2Aで評価し、Bは121nmの範囲で円形のリポソーム小胞を表示し、20kVで分析したのに対し、図2C,Dは不十分に調製された。サンプル。ナノリポソームは、本研究に記載された以前の固定または他の治療なしに単に空気乾燥した。その結果、332μmの範囲でより大きく損傷した小胞を5kVで分析し、観察した。
<img alt="脂質ナノ粒子合成図;ドラッグデリバリー研究のための再水和、超音波処理、押出。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59900/59900fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図1:ナノリポソーム調製の概略表現。ドープ、PEG、およびCHEMSは、主なリポソーム成分を、まずクロロホルムに溶解し、脂質膜(1,2,3)を得た。次いで脂質膜を、閉じ込める親水性タンパク質(タリン)を含む生理塩基バッファーに再水和し、インキュベーションを一晩行った(4)。次に、超音波処理および押出技術を適用してSUV(5,6)を生成した。超遠心分離工程では、リポソーム製剤をフリー脂質および封入されていないタンパク質から分離し、一方、上清は捕捉効率の決定に用いた(7)。この図は Correa ら16から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59900/59900fig1large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="適切なSEMサンプルと不十分なSEMサンプル。ナノスケールでの微細構造比較;粒度分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59900/59900fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 図2:SEMによるナノリポソーム光顕微鏡検査。(A, B)121nmの範囲の円形リポソーム小胞の画像を20kVで分析した。(C, D)不十分に準備されたサンプルのイメージ。5kVで真空および/または電圧条件に抵抗できない大きな小胞および/または損傷した小胞の観察のために許可された不当処理されたサンプル。この図は Correa ら16から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59900/59900fig2large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>リポソーム成分</td>
			<td>重量(g)</td>
			<td>濃度(mM)</td>
			<td>最終巻</td>
		</tr>
<tr>
<td>ドープ</td>
			<td>0.0420</td>
			<td>5.7</td>
			<td rowspan="3">10 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>MPEG 2000-DSPE</td>
			<td>0.1059</td>
			<td>3.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>ケムズ</td>
			<td>0.0024</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
</tbody></table>DOPE - 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロール-3-ホスホエタノールアミン);MPEG 2000-DSPE - 1,2-ジステアロイル-snグリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[アミノ(ポリエチレングリコール)-2000](アンモニウム塩);CHEMS – コレステリルヘミスチン酸塩.
表1:タリンリポソームナノカプセルの調製。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>膜細孔サイズ(μm)</td>
			<td>サイズ分布 (nm)</td>
			<td>平均サイズ (nm)</td>
			<td>多分散指数(PdI)</td>
			<td>ピーク (nm)</td>
			<td>エントラップ効率</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.2</td>
			<td>51 - 396</td>
			<td>155</td>
			<td>0. 168</td>
			<td>94 ± 39</td>
			<td>0.83</td>
		</tr>
</tbody></table>サイズおよび多分散性指数は動的光散乱によって評価され、一方、カプセル化効率はPeterson17に従って決定された。
表2:ナノリポソーム調製のサイズ、ポリ分散指数、及び捕捉効率。

本研究では、ナノリポソーム調製の薄い脂質膜法を用いた古典的な水和を説明し、続いてナノ粒子の特性を説明する。47 kDa親水性および球状タンパク質であるタリンは、安定性を向上させ、速いクリアランスを避け、制御された放出を促進する戦略として正常にカプセル化される。この方法は、疎水性分子カプセル化に適合させることができる。

Liposome nanocapsules have been applied for many purposes in the pharmaceutical, cosmetic, and food industries. Attributes of liposomes include their ...

押出技術によるリポソームナノカプセルの調製は、コロカシア・エスキュレンタから精製された親水性タンパク質中の48キロダルトンのタリンの捕捉において段階的に行われることが実証されるであろう。ナノカプセルの特性評価のためのすべての手順は、走査電子顕微鏡を含み、動的光散乱も従う。カプジュレーション手順は、脂質の選択から高効率カプセル化の達成に、閉じ込められた分子の生物活性を維持するいくつかの課題に直面する可能性があります。記述されるプロトコルは、これらの困難のいくつかを克服することができます。分析バランスを使用してリポソーム成分の重量を量る。ロータリーエバポレーターに収まる体積フラスコを使用して、脂質成分をクロロホルムに溶解し、材料の損失を防ぐ。150 RPMで15分間かき混ぜます。ロータリーエバポレーターを使用してクロロホルムを取り外します。加熱浴から水に接触しながら、最高の効率のために、最良の位置に容積フラスコの口を調整します。説明したプロトコルに従ってパラメータを設定します。約25分後、フラスコを取り出し、蒸発した溶媒を適宜捨てる。薄く、不透明なフィルムが形成され、容易に視覚化することができる。1ミリリットル当たり1ミリグラムでタリンを含む硫酸アンモニウム溶液中の脂質膜を水和する。混合物を40分間かき混ぜ、摂氏4度で一晩インキュベートします。その後、25°C、室温で1分間懸濁液を超音波処理します。小胞のサイズを小さくし、凝集を避けるために、2つのプリウェットフィルターサポートの間にポリカーボネート膜を置き、ホルダーに置きます。1つの空の注射器をデバイスに挿入し、もう一方をリポソーム懸濁液の1ミリリットルで満たし、反対側に挿入します。2マイクロメータのポリカーボネート孔膜を通して12サイクル押し出しを行います。サンプルを1つの注射器から別のシリンジにゆっくりと押し込む。最後に、リポソーム懸濁液は、サイズの減少の結果として、遠足プロセス中に明確になる必要があります。サンプルの約2ミリリットルは、このステップ中に失われる可能性があります。リポソームを超遠心分離で分離する。まず、サンプルをチタンチューブに計量し、チューブのバランスを取ります。充填する最小体積を確認し、必要に応じて硫酸アンモニウムでボリュームを調整します。チタンチューブをスイングバケットに取り付けます。遠心分離機のドアを開け、ローターを中に入れます。遠心分離機のドアを閉め、真空を押し、真空が200から20ミクロン未満になるまで待ちます。超遠心分離機ディスプレイのパラメータを調整します。リコールを押し、条件を確認し、実行を開始します。90分後、真空ボタンをクリックして真空を放し、遠心分離機のドアを開けます。ローターを内側から取り外します。氷の上に超遠心分離剤サンプルを維持し、その後、ペレットから上清を分離し、チューブを逆さまにして、ペレットから上澄み剤を分離するために使い捨ての59ミル遠心分離機に。非カプセル化タンパク質を含む上清を摂氏4度で保存します。これは、カプセル化の効率を決定するために使用されます。ペレットは半透明のゼリーとして提示されます。ペレットを懸濁し、HEPES緩衝生理液を加熱します。詳細については、プロトコルを確認してください。タンパク質定量における脂質干渉を避けるために、Peterson のプロトコルによってカプセル化効率を決定します。サンプルは三重で分析する必要があります。マイクロフュージチューブでは、リプソーム上清またはBSAを1ミリリットル当たり1ミリグラムで水で希釈し、最終体積1ミリリットルにします。DOC を追加して 10 分間インキュベートします。72%TCAの1ミリリットルを加え、よく混ぜます。室温で15分間3,000gで遠心分離機。上清を慎重に下向きに逆にして、吸収性の紙の上に置いて乾燥させます。ペレットを1ミリリットルの水に入れます。ペレットが溶解していることを確認するために十分に混ぜます。次いで、サンプルを試験管に移します。試薬Aを1ミリリットル加え、室温で10分間混ぜ合わせてインキュベートします。試薬Bを5ミリリットル加え、混合し、光から保護された室温で30分間インキュベートします。750ナノメートルで吸光度を決定し、カプセル化効率を計算します。サイズ平均分布とサイズ分布は、動的光散乱によって決定されます。リポソームナノベシクルを使い捨てサイジングキュベットに移します。装置の中にキュヴェットを合わせる。機器パラメータを設定します。安定性を測定するには、リポソームを摂氏4度で保存し、サイズ分布とサイズ平均を定期的に確認します。走査型電子顕微鏡によるリポソーム特性は、ムルタとラマサミーによる三重化で行われる。ペトリ皿の底にガラスカバースリップをテープで固定します。カバースリップにポリL-リジンを塗ります。ペトリ皿の中に湿ったろ紙を入れて水分を維持し、1時間インキュベートします。蒸留水ですすります。サンプルを1滴加え、室温で1時間乾燥させます。サンプルを固定するには、リン酸緩衝液で調製したグルタルアルデヒドでそれらをカバーします。ペトリ皿の中に濡れたフィルターペーパーを入れます。ペトリ皿を密封することが重要です。摂氏4度で48時間インキュベートします。カバーをそれぞれ5分間3回、同じリン酸緩衝液ですすいでください。エタノール濃度の上昇液を35%から絶対エタノールに洗浄して以下のようにして試料を脱水する。ヘキサメチルジシラザンでサンプルを10分間化学的に乾燥させます。ヘキサメチルジシルラザンは、フームフードの内部で慎重に操作する必要があります。サンプルは、デシケータの内部または室温で煙フードの内側で一晩乾燥させるべきです。乾燥したサンプルを、カーボンの導電性粘着テープでスタブに取り付けます。金でスタブをスパッタ。走査型電子顕微鏡SEMで、低真空モードと低電圧、20キロボルトでSEM画像を記録します。図1は、ナノリポソーム製剤について説明する。リン脂質、ドープ、ペグ、およびケムは、主なリポソーム成分を、まずクロロホルムに溶解して脂質膜を得た。次いで、脂質膜を塩基緩衝液中で再水和し、親水性タンパク質を含む、タリン、封じ込めされ、インキュベーションは一晩前に形成されるべきである。その後、超音波処理および押出しが適用され、小さな単層小胞を生成する。超遠心分離工程は、リポソーム製剤を遊離脂質、および非カプセル化タンパク質から分離する。上清は、封入効率の決定のために使用される間。上記の方法論を用いて製造されたナノリポソームは、51~396ナノメートルのサイズ分布と、平均155ナノメートルの分布を示す。ポリ分散指数は168であるため、調製は均質である。リポソームが2マイクロメートルの孔サイズの膜を通って押し出されると、83%の高い封じ込め効率に達する。形態学的ナノリポソーム特性は走査型電子顕微鏡法により評価した。リポソームは、最終的に、より良い品質の画像を得るために、生きている細胞と同様に処理されるべきです。固定および乾燥のプロシージャは真空条件の下で20キロボルト以上を支えるより小さい無傷の小胞の視覚化を保障するために重要である。図2A及び2Bは、121ナノメートルの範囲で円形のリポソーム小胞を表示し、20キロボルトで分析した。図2Cおよび2Dに対して、不十分に調製されたサンプルを表示する。誤処理されたサンプルは、真空およびまたは電圧条件に抵抗できない大きく、または損傷した小胞の観察のためにだけ可能である。ここで説明するプロトコルは、円形形状、小表面、および約150ナノメートルの平均サイズを示す再現可能な小胞の製造を可能にする。この方法は、複雑で大きな分子を封じ込め、四量体タンパク質として、親水性矯正剤を呈する。欠損自己封じ込めは80%より高く、漏れ率は非常に低く、ナノカプセルが摂氏4度で保存されると1.5%に劣る。このビデオが、teriのような大きな分子のカプセル化に役立つことを願っています。

preparation-characterization-nanoliposomes-for-entrapment-bioactive

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

出典: Zhu, J., et. al., 神経成長因子カプセル化のための新規 HDL 模倣ナノ粒子の調製と特性評価。J. Vis.

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