Name: オキュロ運動神経増殖のタイムラプスイメージングのための胚性GFP発現マウスからのEx Vivo Oculomotorスライス培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: 学ぶ ex vivoスライス培養法によるオキュロ運動神経の軸索誘導メカニズムのリアルタイムイメージング。GFP発現マウス胚を用いて、初期軸索伸長と神経発達を詳細に観察する手法です。

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国立眼科研究所[5K08EY027850]、国立小児保健開発研究所[U54HD090255]、ハーバードビジョン臨床科学者開発プログラム[5K12EY016335]、ナイツテンプラーアイ財団[キャリアスターター]グラント」と小児病院眼科財団[教員発見賞]。ECEはハワード・ヒューズ医学研究所の調査員です。

ここに記載されているすべての動物の仕事は、ボストン小児病院機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)プロトコルに従って承認され、実行されました。
1. 時当て交配
<ol><li>場所ISLMN:GFP (イズレット運動ニューロン緑蛍光タンパク質;MGI: J:132726;Jax Tg(Isl-EGFP*)1Slp/J ストック No: 017952オスとメスのマウスを一晩一緒に.雌の体重を計量し、交配する前に体重を記録する。 注:ISL MN:GFPは、細胞傷害性ではない遠内酸GFPを有する運動ニューロンに特異的に標識し、運動ニューロンとその軸線の細胞膜に局所化し、開発25の間に神経を可視化することを可能にする。他の蛍光標識線も用いることができる。</li>
	<li>早朝に膣プラグを確認してください。プラグが識別される日付は E0.5 として指定されます。</li>
	<li>E10.5で体重増加および/または超音波を使用して妊娠を確認します。妊娠中のダムは、E10.5で超音波で見ることができる少なくとも1 g.胚を得たはずです。</li>
</ol>2. スライス培養用試薬とビブトームの調製
<ol><li>スライスバッファーの500 mLを準備する:Ca2+およびMg2+なしでハンクのバランス塩溶液(HBSS)の500 mLにHEPESの5 mLおよびペニシリン/ストレプトマイシンの5mLを加える。 4 °Cに冷やす。 注:余分なスライスバッファは4°Cで保存する必要があり、将来のスライス培養実験に使用することができます。</li>
	<li>培養培地の50 mLを準備する:無菌フードで、HBSSの12.5 mL、胎児牛血清の12.5 mL、ブドウ糖の250 μL、L-グルタミンの250 μL、HEPESの125 μLを24.4 mLのフルオロブライトDMEMを追加します。(最終濃度:25%HBSS、25%FBS、0.5%グルコース、1mMグルタミン、および2.5 mM HEPES.を有するフローロブライトDMEM)。 無菌水浴で培養剤を37°Cに温めます。 注:培養培地は4°Cで最大3週間保存できます。<ol>
<li>無菌フードで、6ウェルプレートの各ウェルに1.5 mLの培養培地を追加します。 各ウェルに細胞培養インサート(材料表)を追加します。 無菌37°Cおよび5%CO2インキュベーターに入れなさい。</li>
	</ol>
</li>
	<li>4%低融解温度アガロースを調製する:無菌PBSの50mLで低溶融温度アガロースの2gを溶解します。完全に溶解するまで30〜60秒間隔でマイクロ波。液体を保つために40°Cの水浴に置きます。 注:余分なアガロースは室温(RT)で保存し、将来のスライス培養実験のために溶かすことができます。</li>
	<li>ビブラートームを設定する:ビブラートムに新しいブレードを配置します。チェック設定: 厚さ 400-450 μm. ビブラートステージを事前に冷やします。外側の部屋に氷を入れます。ライブスライス専用のチャンバーとステージを使用してください。残留固定剤がスライスに損傷を与える可能性があるとして、固定組織に同じビブラート室を使用しないでください。</li>
	<li>顕微鏡ステージトップインキュベーターを37°Cおよび5%CO2に調調します。</li>
	<li>解剖の準備:きれいな外科用器具および70%のエタノールとスプレー。HBSSで2つのペトリ皿を満たし、氷の上に置きます。12ウェル組織培養プレートを開き、下側を上にして氷の上に蓋を置きます。6ウェル組織培養プレートを開き、各ウェルに細胞培養膜インサートと1.5mL細胞培養培地を配置します。プレートを37°Cおよび5%CO2インキュベーターで予め温める。</li>
</ol>3. E10.5胚の収穫とスライスの準備
注: この時点からのすべてのステップは、できるだけ早く行う必要があります。胚は常に氷の上に置いてください。
<ol><li>CO2室で妊娠中のダム(E10.5)を安楽死させる。頸部脱臼を行う。</li>
	<li>70%のエタノールで腹部をスプレーします。はさみで腹部を切り開き、子宮を取り除き、氷冷HBSSでペトリ皿に入れて、すぐに血液を洗い流します。洗った子宮を皿氷冷HBSSで満たされた第2のペトリに移動します。</li>
	<li>解剖範囲の下で、子宮角および個々の角嚢から胚を取り除く。12ウェルプレートの蓋の下側に胚を置きます。氷の上にいろ</li>
	<li>解剖範囲の下で、フィルターペーパーを使用して、各胚を取り巻く液体を除去する。 注:胚は触れるとフィルターペーパーに付着します。</li>
	<li>アガロースに胚を埋め込む。それをカバーするために、各胚の上に溶かしたアガロースを注ぎます。氷の上にいろアガロースが硬化したら、各胚をひっくり返し、反対側に追加のアガロースを注ぎます。氷の上にいろ</li>
	<li>蛍光解剖スコープを使用して、各胚の周りにアガロをトリミングし、ビブラートステージに接着したときに適切に配向されます。オキュロモータ核および初期軸索の成長は蛍光である。核、伸び軸索、目が線を形成するように胚を整列させ、この線に平行に切られたかみそり刃でアガロースをトリミングする(胚への背面、図1Aを参照)。 注:これは、ビブラートの段階に接着された側になります(胚は、ビブレーターブレードに最も近い背中に配置されます)。眼球運動核と眼の間の線は、ビブラートムブレードと平行でなければなりません。</li>
	<li>氷冷スライスバッファでビブラート室内を埋めます。胚をビブラート段階に重ね、ブレードが眼核と目と平行になるようにします。スーパーグルーが乾燥したら、胚がブレードから離れて向かるようにビブラートステージを水没させます。</li>
	<li>スライス 400 - 450 μm スライス. 生殖不能の転写ピペで各スライスを収集します。コールド スライス バッファに配置します。</li>
	<li>解剖範囲の下で、オキュロモーター核と目を含むスライスを選択します。無菌転写ピペを使用して、6ウェルプレートに細胞培養挿入物に置きます。プレートを37°Cインキュベーターに戻します。または、1 人の人がスライスし、別の人がスライスを配置します。スライスとインキュベーターへの配置までの時間を最小限に抑えます。 注:スライスは、核および軸索から放出される最大蛍光がイメージング顕微鏡の目的に最も近い方法で方向付けされるべきである。反転顕微鏡では、プレートの下の目的に最も近い核と軸索を持つ膜上にスライスを配置する必要があります。</li>
	<li>ビブラート段階から残留アガロースを取り出し、次の胚をステージに接着し、すべての胚がスライスされ、めっきされるまでステップ3.7-3.9を繰り返します。</li>
	<li>各ウェルの培地に選択した阻害剤または組換え分子を追加して、用量応答曲線を作成します。 適切な溶媒で希釈する。 注:DMSOを使用する場合は、組織培養グレードDMSOのみを使用してください。あるいは、タンパク質溶出ビーズは、スライス上の特定の場所に配置することができる。</li>
	<li>37 °C および 5% CO2チャンバ内の顕微鏡に置きます。 顕微鏡をセットして、各スライスの位相コントラストと蛍光写真を30分毎に撮影します(または必要に応じてより頻繁に)。スライスは48-72時間維持することができる。</li>
</ol>

<ol><li>Whitman, M. C., Engle, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+congenital+cranial+dysinnervation+disorders+%28CCDDs%29%3A+insights+into+axon+growth+and+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Ocular congenital cranial dysinnervation disorders (CCDDs): insights into axon growth and guidance.</a> Human molecular genetics. 26, 37-44 (2017).</li>
<li>Giger, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin-2+is+required+in+vivo+for+selective+axon+guidance+responses+to+secreted+semaphorins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuropilin-2 is required in vivo for selective axon guidance responses to secreted semaphorins.</a> Neuron. 25 (1), 29-41 (2000).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin-2+regulates+the+development+of+selective+cranial+and+sensory+nerves+and+hippocampal+mossy+fiber+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuropilin-2 regulates the development of selective cranial and sensory nerves and hippocampal mossy fiber projections.</a> Neuron. 25 (1), 43-56 (2000).</li>
<li>Lerner, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell-derived+factor-1+and+hepatocyte+growth+factor+guide+axon+projections+to+the+extraocular+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles.</a> Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).</li>
<li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CFEOM1+mutations+attenuate+KIF21A+autoinhibition+and+cause+oculomotor+axon+stalling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Human CFEOM1 mutations attenuate KIF21A autoinhibition and cause oculomotor axon stalling.</a> Neuron. 82 (2), 334-349 (2014).</li>
<li>Tischfield, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+TUBB3+mutations+perturb+microtubule+dynamics%2C+kinesin+interactions%2C+and+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Human TUBB3 mutations perturb microtubule dynamics, kinesin interactions, and axon guidance.</a> Cell. 140 (1), 74-87 (2010).</li>
<li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+cell+bodies+are+actively+positioned+by+Slit%2FRobo+repulsion+and+Netrin%2FDCC+attraction%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Motor neuron cell bodies are actively positioned by Slit/Robo repulsion and Netrin/DCC attraction.</a> Developmental Biology. 399 (1), 68-79 (2015).</li>
<li>Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+and+In+Vitro+Knockdown+Approaches+in+the+Avian+Embryo+as+a+Means+to+Study+Semaphorin+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling.</a> Methods in molecular biology. 1493, 403-416 (2017).</li>
<li>Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha2-Chimaerin+regulates+a+key+axon+guidance+transition+during+development+of+the+oculomotor+projection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">alpha2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).</li>
<li>Ferrario, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+guidance+in+the+developing+ocular+motor+system+and+Duane+retraction+syndrome+depends+on+Semaphorin+signaling+via+alpha2-chimaerin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).</li>
<li>Dupin, I., Dahan, M., Studer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+axonal+guidance+with+microdevice-based+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Investigating axonal guidance with microdevice-based approaches.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (45), 17647-17655 (2013).</li>
<li>Ebendal, T., Jacobson, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+explants+affecting+extension+and+orientation+of+axons+in+cultured+chick+embryo+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue explants affecting extension and orientation of axons in cultured chick embryo ganglia.</a> Experimental Cell Research. 105 (2), 379-387 (1977).</li>
<li>Dazert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+delivery+of+fibroblast+growth+factor-1+by+transfected+cells+induces+spiral+ganglion+neurite+targeting+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+physiology%22%5BJournal%5D)">Focal delivery of fibroblast growth factor-1 by transfected cells induces spiral ganglion neurite targeting in vitro.</a> Journal of cellular physiology. 177 (1), 123-129 (1998).</li>
<li>Walter, J., Henke-Fahle, S., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoidance+of+posterior+tectal+membranes+by+temporal+retinal+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Avoidance of posterior tectal membranes by temporal retinal axons.</a> Development. 101 (4), 909-913 (1987).</li>
<li>Vielmetter, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F., Stuermer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assay+to+test+differential+substrate+affinities+of+growing+axons+and+migratory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells.</a> Experimental Brain Research. 81 (2), 283-287 (1990).</li>
<li>Joanne Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidics-based+turning+assay+reveals+complex+growth+cone+responses+to+integrated+gradients+of+substrate-bound+ECM+molecules+and+diffusible+guidance+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues.</a> Lab Chip. 8 (2), 227-237 (2008).</li>
<li>Wittig, J. H., Ryan, A. F., Asbeck, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reusable+microfluidic+plate+with+alternate-choice+architecture+for+assessing+growth+preference+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">A reusable microfluidic plate with alternate-choice architecture for assessing growth preference in tissue culture.</a> Journal of neuroscience methods. 144 (1), 79-89 (2005).</li>
<li>Keenan, T. M., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+gradients+in+cell+culture+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Biomolecular gradients in cell culture systems.</a> Lab Chip. 8 (1), 34-57 (2008).</li>
<li>Jimenez, D., Lopez-Mascaraque, L. M., Valverde, F., De Carlos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tangential+migration+in+neocortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Tangential migration in neocortical development.</a> Developmental Biology. 244 (1), 155-169 (2002).</li>
<li>Miquelajauregui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIM-homeobox+gene+Lhx5+is+required+for+normal+development+of+Cajal-Retzius+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">LIM-homeobox gene Lhx5 is required for normal development of Cajal-Retzius cells.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (31), 10551-10562 (2010).</li>
<li>Garcia-Pena, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurophilic+Descending+Migration+of+Dorsal+Midbrain+Neurons+Into+the+Hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Neurophilic Descending Migration of Dorsal Midbrain Neurons Into the Hindbrain.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 96(2018).</li>
<li>Ngo-Muller, V., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+and+exo+utero+surgery+on+rodent+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">In utero and exo utero surgery on rodent embryos.</a> Methods in Enzymology. 476, 205-226 (2010).</li>
<li>Whitman, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+CXCR4%2FCXCL12+Signaling+Causes+Oculomotor+Nerve+Misrouting+and+Development+of+Motor+Trigeminal+to+Oculomotor+Synkinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 59 (12), 5201-5209 (2018).</li>
<li>Brachmann, I., Tucker, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+culture+of+GFP-expressing+mouse+embryos+for+real-time+imaging+of+peripheral+nerve+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice culture of GFP-expressing mouse embryos for real-time imaging of peripheral nerve outgrowth.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (49), e2309(2011).</li>
<li>Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+ligase+Phr1+regulates+axon+outgrowth+through+modulation+of+microtubule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics.</a> Neuron. 56 (4), 604-620 (2007).</li>
<li>Easter, S. S., Ross, L. S., Frankfurter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+tract+formation+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Initial tract formation in the mouse brain.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 285-299 (1993).</li>
<li>Michalak, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+Motor+Nerve+Development+in+the+Presence+and+Absence+of+Extraocular+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Ocular Motor Nerve Development in the Presence and Absence of Extraocular Muscle.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 58 (4), 2388-2396 (2017).</li>
<li>Lewellis, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+SDF1-mediated+cell+guidance+is+achieved+through+ligand+clearance+and+microRNA-mediated+decay%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Precise SDF1-mediated cell guidance is achieved through ligand clearance and microRNA-mediated decay.</a> The Journal of cell biology. 200 (3), 337-355 (2013).</li>
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</ol>

著者は何も開示していない。

このex vivoスライス培養プロトコルは、従来の軸ゾンガイダンスアッセイ23に対して大きな利点を提供します。各頭蓋運動核の大きさは制限因子ではなく、困難な解剖は必要ありません。軸が移動する内因性微小環境は維持され、他のシグナル伝達経路を維持しながら1つのシグナル伝達経路の修正を可能にする。さらに、効果は軸ゴン軌道に沿って異なるポイントで評価することができます。軸ゴンガイダンスは複数の手掛かりと、パス29に沿った手掛かりの組み合わせを必要とするため、これは大きな利点を提供します。解離または植生培養とは異なり、この調製物では軸ゴンの成長は切断されないため、軸ゾン再生ではなく初期軸ゾンの成長を評価することができます。他のほとんどのガイダンスアッセイでは、アクソン再生は初期軸ゾンの成長ではなく、実際に評価されています。軸筋を避けることもニューロンが損傷していないか、ストレスの下でないため、重要な潜在的な交絡因子を回避します。
2つの最も重要なステップは、母親の安楽死とインキュベーター内のスライ...

眼モーターシステムは軸の指導メカニズムを調査するための優雅なシステムを提供する。眼を動かす6つの眼外筋肉(EOEM)を抑える3つの頭蓋神経と、まぶたを持ち上げるレベーター・パルペブラー・エクセピアス(LPS)からなる、比較的単純である。オキュロモーター神経は、LPSと4つのEOEMを刺激する - 劣った斜めと中間、劣った、および優れた直腸筋。他の2つの神経は、トロクレアとアブデューセン、それぞれ1つの筋肉、優れた斜めおよび横直腸筋をそれぞれインビナートする。目の動きは、内向きが適切であるか、欠落しているか、または異常であるかどうかを示す、容易な読み出しを提供します。さらに、神経発達または軸次指導の欠損に起因するヒト眼球運動障害があり、総称して先天性頭蓋骨減少障害(CCDDs)1と呼ぶ。
これらの利点にもかかわらず、眼モーターシステムは、アクソンガイダンス研究2、3、4、5、6、7、8でほとんど使用されない9,10、技術的な欠点のため。インビトロ軸ゴンガイダンスアッセイは、多くの欠点を有する 11.共培養アッセイは、ニューロン移植が標的組織12またはトランスフェクト細胞13の移植と共に培養されるもので、移植の対称性と移植組織と標的組織との間の正確な位置決めの両方に依存する。ストライプアッセイ14、15、交互のストライプに2つのキューが置かれ、軸が1つのストライプ上で優遇成長のために評価されるが、一方の基板が他方よりも好ましいことを示すだけで、どちらかが魅力的であるわけではないまたは反発的、または生理学的に関連する。マイクロ流体室は、正確な化学勾配を形成することができますが、被験者は、その成長に影響を与えることができる応力16、17、18をせん断する軸を成長させる。さらに、これらのアプローチのそれぞれにおいて、移植または解離細胞を採取するには、生育軸子が軸化され、したがって、これらのアッセイは、初期軸子の増殖ではなく、実際に軸の再生を調べる必要があります。最後に、これらのインビトロアプローチは、軸が軸に影響を与える微小環境を除去し、そのコースの異なるポイントに沿って手がかりに対する応答を除去し、従来は1つのキューを単独でテストするだけです。これらの欠点を複合化すると、眼モータシステム内の各核のサイズが小さいため、移植または解離培養物の解剖は技術的に困難になります。さらに、眼運動ニューロンの一次培養は、通常、不均一であり、有意な細胞死を有し、密度依存性であり、複数の胚からの細胞のプールを必要とする(藤木良樹、個人的なコミュニケーション)。しかし、ノックアウトマウスモデルを含む生体内法では、必要な時間と費用を考えると、スクリーニングに使用することは不適切です。
胚全体を培養するために開発された方法19は、移動細胞20または特定の分子の遮断の標識を可能にするが、胚培養全体は、標識のリアルタイムイメージングを妨げるローラーボトル内のインキュベーションを必要とする構造。胚の操作を可能にし、その後、子宮または母親の腹部のいずれかのさらなる発達を可能にする外科的技術(胎盤接続を維持する)22も可能であるが、これらはまた、時間経過を可能にしないイメージング。
インビトロアッセイの障害を克服し、シグナル伝達経路の迅速なスクリーニングを可能にするために、exvivo胚スライス培養技術が23を開発し、末梢神経の成長24に関する以前に公表されたプロトコルから適応した。このプロトコルを使用して、発達するオキュロモーター神経は、EOMターゲットを含む軌道に沿った周囲の構造の多くが存在する場合に、時間の経過とともに画像化することができる。培養培地に低分子阻害剤、成長因子、またはガイダンス手がかりを加えることで、軸ゾン軌道に沿った複数の点でガイダンス摂動を評価し、潜在的な成長因子とガイダンス因子をより迅速に評価することができます。

<table><tbody><tr><td>24ウェル組織培養プレート</td><td>ジェネシー・サイエンティフィック</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>6ウェル組織培養プレート</td><td>ジェネシー・サイエンティフィック</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>ディスポーザブル・パスツール(フリントガラス)</td> <td>VWR</td><td>14672-200</td><td></td></tr><tr><td>ファイン・フォーセプス</td><td>ファイン・サイエンス・ツール</td><td>11412-11</td><td></td></tr><tr><td>フルオロブライト DMEM</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィ</td><td>ック A1896701</td><td></td></tr><tr><td>グルコース (200 g/L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (1X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550H</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer Solution (1M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (250 nM)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25030081</td><td></td></tr>ロック<tr><td>タイト瞬間接着剤</td><td>ロックタイト</td><td></td><td></td></tr><tr><td>低融点アガロー</td>ス<td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>ミリセル細胞培養インサート(30mm、親水性PTFE、0.4 um)</td><td>ミリポアシグ</td><td>マPICM03050</td><td></td></tr><tr><td>モリアミニ穴あきスプーン</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>10370-19</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン (10,000 U/mL)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15140122&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿 (100 x 15mm)</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-107G</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (1X、pH 7.4)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>カミソリ刃</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>手術用ハサミ - Blunt</td><td>Fine Science Tools</td><td>14000-12</td><td></td></tr><tr><td>Ti Eclipse パーフェクトフォーカス TIRF</td><td>ニコン</td><td></td><td></td>付き</tr><tr><td>ビブレータ(VT 1200S)</td><td>Leica</td><td>1491200S001</td><td></td></tr><tr><td>ビブレータブレード(両刃、ステンレススチール)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>121から6</td><td></td></tr></tbody></table>

オキュロ運動神経増殖のタイムラプスイメージングのための胚性gfp発現マウスからのex vivo oculomotorスライス培養

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

正確な眼の動きは視力にとって重要であるが、眼運動システム、特に軸ゴンガイダンスを制御する分子経路の開発は完全には解明されていない。これは、従来の軸ゾンガイダンスアッセイの技術的な制限が原因の一部です。眼球運動神経に影響を与える追加の軸方向ガイダンスキューを同定するために、眼に向かって成長するにつれてリアルタイムで眼球運動神経を画像化するex vivoスライスアッセイが開発された。E10.5 IslMN-GFP胚は、アガロースに埋め込み、ビブラートにスライスし、24-72 hのタイムラプスフォト顕微鏡でそれらを成長させることによって、ex vivoスライスを生成するために使用されます。核から軌道への軸索の成長の生体内のタイミング。低分子阻害剤または組換えタンパク質を培養培養培養剤に添加し、異なる軸子誘導経路の役割を評価することができる。この方法は、成長する軸子を軸視するのではなく、軸が通過する局所的な微小環境の多くを維持し、その軌道に沿った複数のポイントで軸を評価するという利点があります。また、軸ゴンの特定のサブセットに対する影響を識別することもできます。例えば、CXCR4の阻害は、心室ではなく、中脳内の軸ゴンが依然として経体的に成長する原因となるが、既に心内から出ている軸ゴンは影響を受けない。

通常の結果:図 1は実験の概略図を提供します。マウスのE9.5の早い段階から始まり、最初の軸索は、オキュロモーター核26から出現し始める。E10.5では、初期の開拓ニューロンを含む筋状のオキュロ運動神経が間葉内で見られる。E10.5の胚間には、神経が軌道に向かってどの程度進歩したか(同じゴミの中でも)に大きなばらつきがあり、数時間の発達差が原因である可能性が高い。子宮発達の正常な間に、最初のGFP陽性眼球軸星は次の18-24時間(E11.5によって)の軌道/目に達し、そして最終的な目標27に分岐を開始する。スライスカルチャでは、このタイミングが要約されます (図2,ビデオ1)。スライスは72時間まで(すべての方向に)成長し、拡大し、軸索は、核から目に向かって伸びているのが見えます。我々は、オキュロモーター軸ソンの成長を評価するのに最も有用な最初の36-48時間を発見した。運...

ex vivoスライスアッセイは、オキュロ運動神経の成長をリアルタイムで画像化することを可能にします。スライスは、E10.5 IslMN:GFP胚をアガロースに埋め込み、ビブラートームをスライスし、ステージトップインキュベーターで成長することによって生成されます。軸ゾン誘導経路の役割は、培養培養培養物に阻害剤を添加することによって評価される。

オキュロ運動神経増殖のタイムラプスイメージングのための胚性GFP発現マウスからのEx Vivo Oculomotorスライス培養

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon ...

このプロトコルは、眼神経神経で活性な軸索誘導経路を同定し、リアルタイムで神経軌道に沿った異なる点での役割を評価することを可能にする。この手法は、軸索が移動するローカル環境と最終目標を維持します。成長する軸索は切断されないので、再生ではなく最初の軸索の成長を評価することができます。この方法は、眼運動系における軸索誘導に関する洞察を提供するが、他の神経の軸索誘導の研究に適応することができる。このテクニックは、習得するために練習を必要とし、迅速に作業することは非常に重要です。初めて試すときは、ゴミ全体ではなく、わずか数個の胚を使用してください。処置を開始する前に、まず、時交から胚10.5日目に超音波で妊娠を確認する。胚を収穫し、妊娠中のマウスの腹部に70%エタノールを吹き付け、そしてはさみを使って腹腔を開けて子宮を抽出する。新鮮な氷冷HBSSの第二のペトリ皿に臓器を入れる前に、氷冷HBSSのペトリ皿で子宮を洗います。解剖スコープの下で、子宮角とその個々の羊膜嚢から胚を取り除き、各胚を12ウェルプレートの蓋の下側に置き、収穫する。濾紙を使用して、胚自体に触れることなく、各胚を取り巻く液体を除去し、4%低融解アガロースの液体中に胚を水没させます。氷の上にプレートの蓋を置き、アガロースを固めます。アガロースが硬化したら、胚をひっくり返し、各サンプルの反対側を追加のアガロースで覆う。アガロースの第2の体積が固まったら、各胚がビブラートの段階で適切に配向されるように、各胚の周りにアガロースをトリミングするために蛍光解剖顕微鏡を使用する。オキュロモーター核と初期軸索の成長は蛍光であるべきである。各胚を整列させ、核、成長する軸索、および目が線を形成するようにし、カミソリの刃を使用してこの線に平行にアガロースをトリミングする。次に、ビブラートメチャンバーに氷冷スライスバッファーを充填し、最初の胚をビブラームステージにスーパーグルーして、ブレードが眼球運動核および眼と平行になるようにします。スーパーグルーが乾燥したら、ビブラートのステージを浸し、胚がブレードから離れて向くようにし、新しいビブラートメブレードを使用して400〜450マイクロメートルのスライスを得る。滅菌移動ピペットを使用して、各スライスを取得時に冷たいスライスバッファーに移し、蛍光解剖顕微鏡を使用して、オキュロモーター核および眼を含むスライスを選択します。滅菌移動ピペットを使用して、1.5ミリリットルの培養培地を含む6ウェルプレート内の細胞培養インサートにスライスを移し、プレートを37°Cインキュベーターに入れる。ビブラートメステージから残ったアガロースを取り除き、次の胚をステージにスーパーグルーし、すべての胚が切り離されメッキされるまでスライスを収集し続けます。次に、目的の阻害剤または組換え分子の適切な濃度を加え、適切な溶媒に希釈し、各ウェルの培地に添加する。線量応答曲線を作成します。スライスを相コントラストと蛍光顕微鏡で30分ごとに最大72時間画像化します。子宮内正常な開発中に、この代表的なスライス培養で観察されるように、最初の緑色蛍光タンパク質陽性眼運動軸索は、最終標的に分岐する前に胚性11.5日目までに軌道に到達する。ビブラートのステージ上のスライスの向きは、それらが正しく向いていない場合、スライスが解釈できないので、重要です。例えば、胚がその側に傾いている場合、スライス内で1つの眼運動核のみが観察される。埋め込まれた胚が背中に向かって傾き過ぎると、目はスライス内に存在せず、代わりに上肢と後脳または脊髄が含まれる可能性があります。また、スライスを培養膜に配置する際に、組織が折り畳まれないように注意することも重要です。有機溶剤中の阻害剤や成長因子を溶解する際には注意してください。例えば、この実験では、スライスは培地にエタノールを添加した後に死んだ。氷の上にすべてを維持し、胚の抽出とインキュベーターにスライスを配置する時間を最小限に抑えることを忘れないでください。この技術を用いて、眼運動システムで働く軸索誘導機構を同定し始めた。カミソリの刃を扱うときは注意して、一部の阻害剤は危険であり、安全プロファイルに従って慎重に取り扱う必要があります。

ex-vivo-oculomotor-slice-culture-from-embryonic-gfp-expressing-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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オキュロ運動神経増殖のタイムラプスイメージングのための胚性GFP発現マウスからのEx Vivo Oculomotorスライス培養

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