手動多重蛍光免疫組織化学における最適化、設計、および落とし穴の回避

多重蛍光免疫組織化学は、無傷のホルマリン固定パラフィン埋め込み組織内の複数の細胞タイプとその位置を同定し、細胞同定だけでなく細胞間空間解析も可能にする。この手作業の技術の主な利点は、交差反応性のない同じ種の複数の抗体の使用である。この技術は、腫瘍微小環境における免疫細胞と癌細胞の相互作用を詳細に見ることができます。

このテクニックを初めて試す場合は、約3~4日間の染色を可能にし、プロセス中に各ステップを完全に追跡します。染色プロセスとマルチプレックス設計の弱い方法は、一般的な落とし穴を減らすのに不可欠です。スライドを脱パラフィン化し、水分補給から始めます。

ティッシュサイドを上にしてハイブリダイゼーションオーブンに置き、摂氏60度で1時間焼きます。スライドをオーブンから取り出し、垂直スライドラックで5〜10分間冷却します。次にスライド染色セットを使用して、スライドをキシレンで3回、1回100%エタノール、95%エタノール、70%エタノールで10分間処理します。

脱イオン水でスライドのラックを洗い、30分間中性緩衝ホルマリンに浸してスライドを固定します。スライドを水で2分間洗浄し、抗原の取り出しを進めます。pH 6.0またはpH 9.0抗原検索バッファを充填した耐熱ボックスにスライドのラックを置きます。

ラップで箱を覆い、ゴムバンドで固定します。回転板の端にインバータを装備したマイクロ波に箱を入れ、スライドを100%の電力で45秒間加熱し、続いて20%の電力で15分加熱します。マイクロウェーブ後にスライドを15〜20分間冷まします。

一方、抗体および蛍光体の働く溶液を準備する。TBSTまたは1X PBSの50ミリリットルに0.5グラムのウシ血清アルブミン顆粒を溶解して一次抗体希釈液を調製する。各一次抗体作動溶液を、事前に決定された最適化された濃度に希釈します。

フルオロフォア希釈液中の各フルオロフォアを1~100の濃度で希釈します。染色の最終日に、DAPIを3滴ずつTBSTの1ミリリットルに加えて、DAPI作業溶液を調製します。スライドが冷めたら、電子レンジから取り出し、ラップを外します。

脱イオン水で2分間洗い、続いてTBSTで2分間洗浄します。洗浄後、繊細な作業ワイプで組織の周りのスライドを乾燥させ、疎水性バリアペンで組織の外側をトレースし、組織に触れたり乾燥させたりしないように注意します。各スライドを加湿器室に入れ、約4滴のブロッキング溶液を組織に加えます。

次に、スライドを室温で10分間インキュベートし、一次抗体の適用を進めます。ペーパータオルの積み重ねのスライドの側面をタップして、各スライドからブロッキング溶液を取り除き、残りの溶液を取り除くために繊細なタスクワイプを使用します。スライドを加湿したチャンバーに戻し、働く一次抗体の約200マイクロリットルを加え、1時間インキュベートします。

インキュベーション後、スライドをTBSTに2分間浸して3回洗浄します。各スライドから残りのTBSTを取り除き、約3〜4滴の二次抗体を適用する。加湿チャンバーにスライドを10分間インキュベートします。

TBSTでスライドを再度洗い、約100マイクロリットルのフルオロフォア作動液を塗布してください。スライドを加湿したチャンバーに戻し、10分間インキュベートします。TBST洗浄を繰り返し、原稿の指示に従ってスライドをマイクロ波処理して抗体を除去します。

この複数日の染色プロセス中に覚えておくべきことは、マイクロウェーブステップの後に停止し、一晩抗原検索バッファーにスライドを残して、組織および染色完全性を確保することです。抗原検索溶液で最後の抗体アプリケーションを除去し、脱イオン水でスライドを洗浄し、続いてTBSTを洗浄ごとに2分間洗浄します。残りの抗体フルロフォアペアの染色手順を繰り返し、DAPIアプリケーションを続行します。

各スライドに約150マイクロリットルの作業DAPI溶液を塗布し、加湿チャンバー内で10分間インキュベートします。インキュベーション後、約30秒間TBSTでスライドを洗い、カバースリップを取り付けます。取り付け培地が乾燥したら、カバースリップの四隅にクリアな指の爪磨きを適用して固定します。

モノプレックスを解析するには、DAPIを使用して250ミリ秒の露出を持つ顕微鏡上のスライドを画像化して焦点を合わせます。染色されたマーカーの蛍光強度を見て、各モノプレックススライドを評価し、この強度を背景と比較します。染色されたマーカーの強度が背景の 5 倍以上以上の場合は、最終的なマルチプレックスでスライド位置を使用します。

マルチプレックスを染色する場合は、各抗体に適した順序を選択し、各フルオロフォアを抗体に割り当てます。先に説明したように多重化を染色し、一次抗体、フルオロフォア、またはDAPIの代わりに、抗体希釈液、フルオロフォア希釈剤、およびTBSTを受け取るブランクスライドを調製する。顕微鏡上で多重化を画像化する準備ができたら、すべてのチャンネルに対して露出を250ミリ秒に設定し、DAPIを使用して各画像をキャプチャしてフォーカスを設定します。

次に、分析ソフトウェアを使用して、蛍光偽色と病理図で各多重化を評価し、各マーカーの特異性を確認します。多重アッセイの成功を確実にするために、モノプレックスアッセイを実行して各抗体の順序を決定する必要があります。例えば、Foxp3が配列の3番目の位置にある場合、CD3との特定の堅牢な染色および共局在化が実証される。

対照的に、Foxp3が最初の位置にある場合、Foxp3の非特異的染色が起こる。スライドの大部分に赤の粒状およびエフューズ領域が存在し、これらの領域の蛍光強度が低い。このアッセイのもう一つの重要なステップは、細胞同定およびさらなる分析の基礎であるDEPIカウンターステインである。

DAPI が動作しているイメージと非作業型の DAPI の間には、明確なコントラストが見られます。多重アッセイの場合、美しい合成画像は必ずしも正確な染色を反映するとは限りません。CD3は可視化され、特定の染色を示すが、CD163の病理明視野は抗体が非特異的であることを証明する。

最適な多重画像は、合成画像における特定の染色を示し、CD3およびCD163特異性は、病理明視野図で確認される。この手順に従って、自己平素化と空間解析の計算を行い、セル間の相互作用をさらに解析することができます。この技術は、研究者が細胞と無傷組織の空間的パターニングを探求する道を開き、腫瘍免疫微小環境の理解を深めました。