プローブエレクトロスプレーイオン化質量分析のためのサンプル調製
2020年2月19日
この記事では、周囲質量分析に基づく独自のリアルタイム分析方法のサンプル調製方法を紹介します。この方法により、特別な前処理を行うことなく生体内の生体分子のリアルタイム分析を行うことができます。
したがって、これはユニークな周囲質量分析であり、特に生体外および生体内の両方の生物学的サンプルの分析に適しています。これは、細胞の並べ替え、分画、および濃度などのサンプルの特別な前処理を定期的に必要としないので、生物学的成分、特に非常に少量として存在するものの最小損失でサンプルを分析することができます。この技術により、質量分析法により、原料物質を1分間で直接分析することができます。
迅速性は、システムの堅牢性、この技術に固有の主な利点で妨げられない。あなたがしなければならないのは、シリカ、10ミリグラムの組織標本、および10マイクロリットルの増殖を準備することだけです。そして、使い捨てカートリッジにそれらを入れてください。
これは、PESI-MSマシンに設定され、数分で結果が得られます。適切な質量分析計を選択することで、分子の同一性にアポイントニングすることができます。まず、冷凍庫から肝臓または腎臓組織を取り出します。
コルク板で、メスやナイフを使って組織標本を約2個2×2ミリメートルに切ります。または、サンプルをトレパンでパンチアウトし、カラムの長さを2ミリメートルにトリミングします。組織が血液で汚染されている場合は、氷冷リン酸緩衝生理食塩水で短時間洗います。
約10ミリグラムの切り取りまたはパンチアウトサンプルをプラスチックマイクロチューブに入れ、100マイクロリットルの50%エタノールを加えます。サンプルを均質化するためにマイクロペステスルを使用してください。次にピペットマンとともに、ホモネートの10マイクロリットルを質量分析計のカートリッジのウェルに入れる。
直接プローブイオン化質量分析計のイオン化チャンバーにカートリッジを置き、サンプルイオン化に使用するステンレススチールニードルプローブを取り付けます。チャンバーの蓋をしっかりと閉じて、安全装置を自動的に作動させます。画面上のパネルを使用して、分析するスタートアイコンをクリックしてオンボードコンピュータを起動し、エレクトロスプレーを生成し、針の周波数が3ヘルツであることを確認するために針に2.3キロボルトの電圧を適用します。
測定が完了するまで30秒待ちます。各サンプルを測定した後、カートリッジと針をバイオハザード・プロジャーに入れて配置します。質量スペクトルを解析するには、質量分析計に関連付けられたソフトウェアを開きます。
ソフトウェアのデータファイルブラウザウィンドウでL-C-Dファイルをクリックします。マススペクトルウィンドウの単一のピークをクリックして選択し、自動的にE-I-Cを描写します。T-I-CとE-I-Cを確認し、平均スペクトルアイコンをクリックして、マススペクトルを生成する時間枠の範囲を選択します。
マススペクトルテキストデータをエクスポートします。体液を分析するには、最大10マイクロリットルの血清サンプルを採取し、1.5ミリリットルのマイクロチューブに分配します。50%エタノールの190マイクロリットルをチューブに加え、室温で2分間渦を加えます。
すべての赤血球を排除するために、液体を摂氏4度で1〜5分間Gの15,000倍に遠心分離する。上清の10マイクロリットルをカートリッジのウェルに移し、以前のように質量分析計で測定に進みます。このプロトコルは、固体試料、液体サンプル、および生きている動物に対するPESI-MSのサンプル調製物を示す。
ヒト腎細胞癌は、中性脂質の特徴的なピークを示す。周囲の非癌組織では同定されなかったヒト腎細胞癌組織からの900の質量電荷比でスペクトルに比較的強いピークがあった。これらのピークは主にトリアシルグリセロールを表す。
正常な肝組織で取得したデータの例は、慢性肝炎および肝硬変を有する患者からの新生性病変を描写した。3人体からのヒト血清をPESI-MSを用いて分析し、個体間のスペクトルパターンに明確な違いがあった。マウスの尾血管に静脈内に注入された5-FdUの代謝変化については、インセクツ中の肝臓において、5-FdUの非常に迅速かつ敏感な検出が肝臓で達成された。
組織の部位からの針先端の深さは、データ取得の成功を読み取るイオン化において最も重要な役割を果たし、指示に従うようにしてください。分子種を識別するには、商用データベースを調べています。これは、病気の分子メカニズムを修飾する方法です。
多くの研究者は、病気の繁栄を予測するためのこの技術の応用に興味を持つようになり、予後です。特にくる病生検を使用する。ただ、プローブ針に刺されないようにしてください。
これは機械から針を取除く特定の器械によって単に避けることができる。
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概要
本論文では、生体内の生物学的試料をリアルタイムで分析するためのユニークな環境質量分析法を紹介します。この手法により、特別な前処理を行うことなく生の組織材料を分析することが可能となり、生物学的成分の損失を最小限に抑えることができます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 質量分析法
- 生物学的分析
- 分析化学
背景
- 環境質量分析は、in vitroおよびin vivoの両方の分析に適しています。
- この手法では、広範な試料の前処理を必要としません。
- 生物学的成分の損失を最小限に抑えた試料分析が可能です。
- 迅速な分析が可能であることは、本手法の大きな利点です。
研究目的
- 生物学的分子をリアルタイムで分析する方法を提示すること。
- 未処理の組織試料を分析する効率性を実証すること。
- アンビエント質量分析を用いる利点を強調すること。
使用方法
- シリカおよび組織検体の調製。
- サンプル分析用使い捨てカートリッジの使用。
- 質量分析法による生物学的サンプルの直接分析。
- 1分以内での迅速なサンプル処理。
主な結果
- この手法により、成分の著しい損失なく迅速な分析が可能になります。
- ごく少量の生物学的材料を含むサンプルの分析に有効です。
- リアルタイム分析において、堅牢性と信頼性が実証されています。
- 生物学的分子を天然の状態（ネイティブ状態）で研究することを容易にします。
結論
- 環境質量分析は、生物学的解析において有用なツールです。
- この技術は、生物学的プロセスの理解を深めます。
- リアルタイム解析のための、迅速かつ効率的な手法を提供します。
よくある質問
産業界における重要性
プローブ電何も噴霧イオン化質量分析（PESI-MS）は、最小限の前処理で生物学的サンプルのリアルタイム分子分析を可能にし、初期探索段階における迅速なターゲット検証およびメカニズムのリスク低減を支援します。この手法では、わずか 10 mg の組織または 10 µL の血清で十分であるため、低容量の前臨床サンプルに適しており、生物学的成分の損失を低減できます。この機能により、生体システムから代謝物および薬物動態のダイレクトな in situ データが得られるため、リード化合物同定における予測の信頼性が向上します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期発見とターゲット検証
- 科学的価値：腎細胞癌などの固体組織から中性脂質および代謝物を直接検出することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用の価値：50%エタノール中での組織ホモジナイズのみという最小限のサンプル調製で済むため、ワークフローの複雑さとばらつきを低減できる。
- 予測的価値：商用データベースとの照合による分子メカニズムの適格性評価をサポートし、ターゲットの信頼性評価に寄与する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：簡単なエタノール沈殿と遠心分離後のヒト血清を直接分析でき、液体ベースのバイオマーカー・スクリーニングを可能にする。
- 運用上の価値：使い捨てカートリッジとステンレス製プローブを使用することで、標準化を確保し、クロスコンタミネーションのリスクを低減する。
- 拡張性：数分で結果が得られるため、迅速なサンプル処理が可能であり、ハイスループット・スクリーニングへの対応を支援する。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性：マウスの肝臓における5-FdU検出など、生体動物の特定の臓器内における代謝物や薬剤のリアルタイムなダイナミクスの追跡を可能にする。
- メカニズムによるリスク軽減：組織を破壊することなくin situの分子データを提供し、生理学的コンテキストを維持することで、前臨床から臨床へのトランスレーションを向上させる。
- リスク調整済み推進：疾患に関連するスペクトルパターン（例：肝硬変肝における新生物病変）を検出し、go/no-go判断の根拠とする。
パイプラインおよびワークフローの統合
PESI-MSは、初期の生物学的研究からリード化合物の同定に至る創薬の連続的なプロセスに適合し、仮説検証やアッセイの準備を支援する迅速かつ定量的な分子解析データを提供します。
- 探索生物学：分画操作を行うことなく、組織特異的な分子シグネチャー（例：癌におけるトリアシルグリセロール）を検出することで、仮説検証を支援します。
- スクリーニング：標準化されたカートリッジベースの試料導入により、アッセイ可能な状態で体液および組織の分析を可能にします。
- 分析学：条件間および個体間での定量比較のため、マススペクトルデータ（m/zピーク、EIC、TIC）を生成します。
- トランスレーショナルリサーチ：マウス尾静脈への5-FdU静脈内投与など、in vivoで薬物代謝物をモニタリングすることにより、前臨床検証へと繋げます。
- 企業における再利用：再利用可能なハードウェア（プローブ、チャンバー）と使い捨て消耗品を併用することで、プロジェクトをまたいだ標準化を可能にします。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 無傷の生物学的システムから直接的な分子データを提供することで、メカニズム上の曖昧さを低減します。
- 運用的価値： 標準化されたサンプル調製（組織10 mg、血清10 µL、50% ethanol）および固定された電圧/周波数設定（2.3 kV, 3 Hz）により、再現性を確保します。
- 戦略的価値： 疾患モデルにおける代謝物や薬剤の迅速な検出を可能にし、go/no-go判断を改善します。
- ポートフォリオへの影響： コントロール群には存在しない疾患特異的なピーク（例：癌におけるm/z 900）の検出を通じて、リスク調整後の優先順位付けを支援します。
実施上の検討事項
- 溶媒調製（50% ethanol）および血清処理のための遠心分離機の使用を含む、質量分析装置の操作に関する専門知識が必要である。
- 互換性のあるカートリッジシステムおよびステンレス製ニードルプローブを備えた直接プローブイオン化質量分析計が必要である。
- データの整合性を確保するため、組織の切断、ホモジナイズ、および上清の転送といったサンプル処理について、チーム間での標準化が求められる。
- in vivoでの適用において、イオン化効率とデータ品質に影響を与える重要な変数として、ニードルチップの刺入深さを考慮しなければならない。
- 環境イオン化に対応したサンプルに限定される。複雑な生体試料の場合、マトリックス効果の最適化が必要になる可能性がある。
