ゼブラフィッシュにおけるin situハイブリダイゼーション染色のジェノタイピングと定量化
January 28th, 2020
遺伝子編集技術により、研究者はゼブラフィッシュ変異体を生成して遺伝子機能を比較的容易に調べることができます。ここでは、ゼブラフィッシュにおけるin situハイブリダイゼーションシグナルの並列的な胚ジェノタイピングおよび定量化を行うガイドを提供する。この公平なアプローチは、in situハイブリダイゼーションに基づくフェノタイプ解析においてより高い精度を提供します。
遺伝子発現に対する突然変異の結果は、しばしばその際のハイブリダイゼーションによって定性的に評価され、一般的に視覚的に採点され、主観的であり、研究者の期待に偏っている。この方法は、画像の強度を定量化することで、situ実験でより一貫した比較方法を提供し、そのバイアスを除去します。また、遺伝子発現のリーダーとして、その遺伝子ハイブリダイゼーションに使用する他のモデルシステムにも容易に適応できます。
in in ハイブリダイゼーションまたはISH染色胚を画像化して開始する。グリセロール溶液を調製し、均質化するためにそれを混合します。3ミリリットルのパスツールピペットで胚をグリセロール溶液に移し、少なくとも5分間落ち着かせます。
イメージング後にISH染色胚を転写するのに十分なPCRチューブを準備し、ラベルを付け、3ミリリットルのパスツールピペットを使用して、ガラスうつ病スライドのウェルの底に100%グリセロールを追加します。単一のISH染色胚をガラススライドに移し、デジタルカメラと底部と上の照明を備えたステレオ顕微鏡の下に向けます。最初の胚を使用して、希望の倍率で照明と露光時間を調整します。
必要な数の胚を画像化し、各画像に一意の番号を付けます。イメージング後、各胚を同じ数で標識されたPCRチューブに移し、必要に応じてPCRチューブから余分なグリセロールを吸引します。DNAを抽出するには、HoTSHOTなどのアルカリ性リシスバッファーの40~75マイクロリットルを各チューブに加えます。
約30分間摂氏95度でチューブをインキュベートし、摂氏4度に冷却します。等量の中和バッファーを追加し、目的の変異のジェノタイピングを進めます。画像解析を実行するには、フィジーで画像を選択して開き、[編集] をクリックして[反転]をクリックし、[イメージ]タブをクリックして[タイプ]を選択し、[8ビット]を選択して、画像タイプを8ビットに変換します。
ポリゴン ツールを選択し、計測対象の ISH 信号を含む領域の周囲の画像に対象領域または ROI を手動で描画します。T キーを押して ROI マネージャを開き、対象地域を選択して、[測定] をクリックします。[結果] ウィンドウの平均値をスプレッドシートにコピーします。
背景の強度を測定するには、染色のない胚の領域に ROI を移動し、ROI マネージャで [追加] をクリックします。背景領域を選択して[メジャー]をクリックし、スプレッドシートに平均強度の値を記録します。NC2ハイブリダイゼーション信号の平均ピクセル強度を、染色領域の背景から背景の平均強度を差し引いて求める。
各サンプルの平均ピクセル強度を決定した後、各サンプルに遺伝子型を割り当てます。遺伝子型を特定できない場合は、そのサンプルを後続の分析から除外します。平均サンプル強度値を遺伝子型に基づいてソートし、統計検定を進めます。
この技術の有用性は、dnmt3bbのISHで実証されています。runx1ヘテロ接交インクロスからの胚の1。dnmt3bb の減少。
1発現は、ランx1ホモ接合変異体で検出され、ヘテロ接合性胚はdnmt3bbに有意な差を示さなかった。1 式。ランx1発現に対するlmo4突然変異の影響を判定しようとした場合、この分析は野生型とホモ接合lmo4変異体の発現に有意な差を示さなかった。
しかし、単一胚qPCRによりrunx1発現のわずかな減少が検出された。runx1-probed胚の約0.4%で、ISHは高いバックグラウンドを持ち、シグナルから差し引かれたときに負の数をもたらした。このような場合、胚は分析から除外された。
胚上の4つの異なる領域は、バックグラウンド補正を最適化するためにテストされています。背景領域のいずれでもROIの強度に比較的安定した差がありましたが、R3は常にROIよりも高い強度を示し、バックグラウンド補正には使用しないでください。R1 と R4 は、バックグラウンド補正に最も適した領域であることが判明しました。
イメージングに最適な条件を見つけ、実験全体を通してそれらを変更しないことが重要です。また、各サンプルに遺伝子型を割り当てる前に、ピクセルの強度を定量化することをお勧めします。
概要
この記事では、ゼブラフィッシュの胚の遺伝子型決定とin situ ハイブリダイゼーション信号の並行定量化の方法を紹介します。この偏りのないアプローチを利用することで、研究者は表現型分析においてより高い精度を達成できます。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 遺伝学
- 発生生物学
背景
- 遺伝子編集技術はゼブラフィッシュ変異体の生成を促進します。
- in situ ハイブリダイゼーションは遺伝子発現を評価する一般的な方法です。
- 従来のスコアリング方法は偏りや主観性を導入する可能性があります。
- この研究は、より一貫性のある定量的アプローチを提供することを目指しています。
研究の目的
- ゼブラフィッシュにおける表現型分析の精度を向上させること。
- 胚の遺伝子型決定のための標準化された方法を提供すること。
- in situ ハイブリダイゼーション信号を客観的に定量化すること。
使用した方法
- 立体顕微鏡を用いてISH染色した胚の画像化。
- 胚移植のためのグリセロール溶液の調製。
- DNA抽出のためのアルカリ溶解バッファーの使用。
- 画像分析と定量化のためのFijiソフトウェアの使用。
主要な結果
- runx1 ホモ接合体変異体で dnmt3bb.1 の発現減少を実証しました。
- 画像分析のための適切な背景補正領域を特定しました。
- 野生型と lmo4 ホモ接合体変異体の間に発現に有意差がないことを示しました。
- ピクセル強度に基づいて遺伝子型を割り当てるための信頼性の高い方法を提供しました。
結論
- この方法は遺伝子発現分析の信頼性を向上させます。
- 他のモデルシステムにも適用可能です。
- 正確な結果を得るためには一貫した撮像条件を維持することが重要です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantitative in situ hybridization analysis reduces subjectivity in gene expression assessment, improving data reliability for target validation in zebrafish models. This approach supports mechanistic de-risking by enabling unbiased correlation of genotype with phenotypic expression patterns. The method enhances predictive confidence in early discovery by providing standardized, replicable measurements across mixed-genotype samples.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through unbiased quantification of spatially restricted gene expression signals.
- Operational Value: Provides a consistent workflow for comparing mutant and wild-type phenotypes without observer bias.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing significant expression changes from background noise in genetic models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline expression profiles.
- Reproducibility: Standardizes image acquisition and analysis protocols to minimize inter-experiment variability.
- Quantitative Output: Generates measurable pixel intensity data suitable for statistical comparison across treatment groups.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains consistency from discovery through preclinical validation by using objective phenotypic readouts.
- Biomarker Alignment: Facilitates correlation of gene expression changes with genotypic status for translational biomarker development.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables data-driven advancement decisions by reducing false positives in target validation studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by linking genotypic confirmation with quantitative phenotypic assessment, supporting lead identification through mechanistic de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by providing quantitative mRNA distribution data to clarify gene function in developmental pathways.
- Screening: Enables assay standardization through reproducible imaging and analysis conditions for reliable compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative intensity measurements and background-subtracted values that enable statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by ensuring consistent phenotypic scoring across model systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable genotyping and quantification platform applicable to multiple genes and mutant lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in gene expression data.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized embryo handling and image analysis protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing objective data for capital allocation in early-stage programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by distinguishing true biological effects from technical variability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryo handling, microscopy, and basic genotyping techniques.
- Dependent on stereo microscopy with digital imaging capabilities and Fiji software for analysis.
- Necessitates cross-team standardization of imaging conditions, exposure times, and background correction regions.
- Involves adaptation considerations for different zebrafish strains and developmental stages.
- Includes practical limitations such as background correction optimization and exclusion of samples with indeterminate genotypes or high background noise.
