Name: 多能性幹細胞からの3次元ヒト肝球の血清自由産生 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: 学ぶ 多能性幹細胞から3次元ヒト肝球を血清自由で産生する手法。アガロースマイクロウェルを用いた細胞自己組織化により、壊死中心の形成を抑制し、長期間機能を維持する肝球を作製します。

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この研究は、英国再生医療プラットフォーム(MRC MR/L022974/1)およびチーフサイエンティストオフィス(TCS/16/37)の賞を受賞しました。

1. アガロースマイクロプレート金型の調製
注:これらの実験に使用される培地は、細胞培養のために無菌および室温(RT)でなければならない。
<ol><li>
2%アガロースカビを準備します。
	<ol>
<li>低溶融温度アガロースの2gを殺菌蒸留水の100mLに溶解します。電子レンジで注意深く加熱し、間隔を振って完全に溶解させます。</li>
		<li>溶かしたアガロースの520 μLを256ウェルフォーマットの金型に加え、固化させる。</li>
		<li>各アガロースマイクロプレートを12ウェルプレートの単一のウェルに移します。</li>
		<li>各ウェルにCa2+/Mg2+を付けた1xダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)の1.5 mLを追加し、P1000ピペットチップを使用して数回上下にゆっくりとピペッティングしてマイクロウェルから気泡を除去します。これは、均一な細胞播種を確保するために行われる。 注:アガロースマイクロプレートは、1x DPBSで4°Cで最大6ヶ月間保存できます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ヒト多能性幹細胞をアガロースマイクロウェルプレートに播種する
<ol><li>
細胞懸濁液の調製
	<ol>
<li>前述の8.hPSCの未分化培養から培地を吸引する。 注:hPSCはmTeSR1のLN-521上で培養され、培地は24時間ごとに変化し、細胞が前述の8のように合流の75%から85%に達すると定期的に通過する。</li>
		<li>Ca2+/Mg2+なしで RT 1x DPBS の 5 mL でセルをすすいで、バッファーを除去します。</li>
		<li>細胞に1x細胞解離試薬(材料表)の5mLを加え、37°Cで細胞を6~8分間インキュベートして細胞解離を可能にします。 注:反応を止めるには、顕微鏡下で細胞剥離を調べます。セルはプレートから部分的に切り離す必要があります。より長い時間が必要な場合は、余分な1-2分のインキュベーションを延長します。</li>
		<li>細胞解離試薬を除去して反応を停止し、10μM Rho関連キナーゼ(ROCK)阻害剤Y27632を添加した新鮮なmTeSR1培地を5mL添加する。P1000ピペットチップを使用して、上下に数回ピペットによって細胞を解離します。</li>
		<li>ヘモサイトメーターとトリパンブルー染色除外を使用して生存細胞を数えます。これに続いて、必要な濃度で細胞懸濁液を調出す。</li>
		<li>必要なセルの合計数を計算します。3D肝球分化の場合、アガロースマイクロプレート当たり3.84 x 105細胞をシードし、直径100~150μmのスフェロイドを生成します。</li>
		<li>必要な数の細胞を無菌15 mLまたは50 mL遠心分離管に移し、RTで5分間200 x gでチューブを遠心分離し、細胞をペレットします。</li>
		<li>mTeSR1培地に上清を吸引し、細胞を再懸濁し、10 μM ROCK阻害剤Y27632を再懸濁する。細胞ペレットを適量の培地で希釈し、2.1 x 106細胞/mLの最終濃度にする。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
調製したアガロースマイクロプレートに細胞を播種する 注:冷蔵庫に保存されたアガロースマイクロプレートを使用する場合は、使用前に少なくとも1時間37°Cのセルインキュベーターに入れ、細胞播種前の井戸から1x DPBSを吸引します。<ol>
<li>アガロースマイクロウェルに190μLの細胞懸濁液を加えます。</li>
		<li>播種後、プレートを37°Cでセルインキュベーターに戻し、2時間5%CO2で細胞を定着させます。 </li>
		<li>2時間後、10μM ROCK阻害剤Y27632を各ウェルに添加した新鮮で温かいmTeSR1培地を1mL加える。</li>
		<li>37°Cと5%CO2で24時間でプレートをセルインキュベーターに戻し、翌日の球体の形成を調べて細胞が付着できるようにします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. アガローズマイクロウェルズの3D肝球にhPSCを分ける
<ol><li>ポリ2-ヒドロキセチルメタクリレート(ポリHEMA)コーティングウェルの調製
	<ol>
<li>95%エタノールの100mLでポリHEMAの2gを溶解する。55°Cでホットプレートを使用して一晩溶液をかき混ぜます。24ウェルプレートのウェルあたり250 μLのポリHEMA溶液を加え、オーブンを使用して60°Cで一晩乾燥させます。</li>
	</ol></li>
	<li>分化媒体の調製
	<ol>
<li>ヒトアクチビンA凍結性タンパク質を無菌0.2%ウシ血清アルブミン(BSA)/DPBSで溶解してヒトアクチビンAの1,000倍のストック溶液を100μg/mLの最終濃度に調剤する。-20 °Cを小さなアリコートで保管してください。1:1,000 で使用します。</li>
		<li>マウスWnt3a凍結乾燥タンパク質を無菌0.2%BSA/DPBSに溶解してWnt3aの1,000倍のストック溶液を10μg/mLの最終濃度に調製する。-20 °Cを小さなアリコートで保管してください。1:200で使用します。</li>
		<li>ヒトHGF凍結性タンパク質を無菌0.2%BSA/DPBSに溶解してヒト肝細胞増殖因子(HGF)の1,000倍のストック溶液を10μg/mLの最終濃度に調質させる。-20 °Cを小さなアリコートで保管してください。1:1,000 で使用します。</li>
		<li>OSMを無菌0.2%BSA/DPBSで溶解し、20 μg/mLの最終濃度に溶解することにより、オンコスタチンM(OSM)の1,000倍のストック溶液を調調えます。-20 °Cを小さなアリコートで保管してください。1:1,000 で使用します。</li>
		<li>凍結性成長因子(EGF)の1000倍のストック溶液を無菌0.2%BSA/DPBSに溶解して10μg/mLの最終濃度に調質する。-20 °Cを小さなアリコートで保管してください。1:1,000 で使用します。</li>
		<li>塩分化タンパク質を無菌0.2%BSA/DPBSに溶解して、基本線維芽細胞増殖因子(bFGF)の1,000倍のストック溶液を10μg/mLの最終濃度に溶解させる。-20 °Cを小さなアリコートで保管してください。1:1,000 で使用します。</li>
		<li>凍結乾燥タンパク質を0.2%BSA/DPBSに溶解して血管内皮増殖因子(VEGF)の1,000倍のストック溶液を10μg/mLの最終濃度に溶解させる。-20 °Cを小さなアリコートで保管してください。1:1,000 で使用します。</li>
		<li>ロズウェルパーク記念研究所1640(RPMI 1640)基底培地からなる内皮分化媒体を作る 2% B27サプリメント(50x、インスリンなし)、および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(最終濃度:100 IU/mLおよび100μg/mL)それぞれ)。指示がない限り、各培地変化において、必要な体積をWnt3aおよびアクチビンAでそれぞれ50 ng/mLおよび100 ng/mLの最終濃度で補う。 注:4°Cで保存し、2週間以内に使用してください。</li>
		<li>20%ノックアウト血清置換(KOSR)を持つノックアウトダルベッコの改変イーグル培地(KO-DMEM)からなる肝芽芽細胞分化媒体を作り、L-グルタミンに対する代替サプリメントの0.5%、1%非必須アミノ酸(NEAA)を補充し、0.1 mM β-メルカプトエタノール、1%ジメチルスルホキシド(DMSO)、および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(それぞれ100 IU/mLおよび100 μg/mLでの最終濃度)。真空下でフィルターをします。 注:4°Cで保存し、2週間以内に使用してください。</li>
		<li>肝細胞性成熟培地を作る肝細胞培地は、L-グルタミン、10μMヒドロコルチゾン21-ヘミコンチン酸ナトリウム塩(HCC)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(100 IU/mLおよび最終濃度および100ΜMLの代替サプリメントの1%を補充した。それぞれ100 μg/mL)。各媒体変化について、OSMおよびHGF(それぞれ20 ng/mLおよび10 ng/mLの最終濃度)で必要な体積を補う。 注:在庫を4°Cに保管し、2週間以内に使用してください。</li>
		<li>L-グルタミンに対する代替サプリメントの1%、ペニシリン/ストレプトマイシン(100 IU/mLおよび100 μg/mLの最終濃度)からなる10%ノックアウト血清置換物を補充した肝細胞維持培地を作る。それぞれ)。各培地変化について、HGF、EGF、bFGFおよびVEGF(各成長因子の最終濃度10ng/mL)で必要な体積を補う。 注:在庫を4°Cに保管し、2週間以内に使用してください。</li>
	</ol></li>
	<li>肝球形成24hポストシードをチェックし、肝細胞分化を開始します。慎重にmTeSR1培地を取り外し、100 ng/mLアクチビンAと50 ng/mL Wnt3aを補充した新鮮な内皮分化培地の1 mLに置き換えます。</li>
	<li>hESCに対して24時間毎に24時間毎に補充された内皮プライミング培地を変更する。hiPSC で作業する場合は、アクチビン A (100ng/mL) だけでメディアを補完するさらに 2 日間このステージを拡張します。</li>
	<li>決定的な内皮誘導に続いて、2日ごとに培地を交換する5日間の肝芽細胞分化媒体に切り替え、肝芽細胞仕様の最終日に最後の変更を行う。</li>
	<li>肝球をポリHEMAコーティングウェルに移します。
	<ol>
<li>KSR/DMSO培地を除去した後、サプリメントなしで肝細胞成熟培地で細胞を一度洗浄し、10 ng/mL HGFおよび20 ng/mL OSMを添加した肝細胞成熟培地を1mL添加する。</li>
		<li>P1000ピペットを使用して、溶液を上下に数回ピペットでアガロースマイクロプレートから肝球を持ち上げます。</li>
		<li>肝球を含む培地を十分に被覆されたポリHEMAに移す。</li>
		<li>10 ng/mL HGFおよび20 ng/mL OSMを補充した肝細胞成熟培地の1mLを用いてアガロースマイクロプレートを洗浄し、培地をポリHEMAコーティングによく移す。</li>
		<li>アガロースマイクロプレートからすべての肝球を転送するために、ステップ3.6.4を可能な限り何度も繰り返します。 注:肝球を含む溶液を慎重に上下にピペットし、損傷を避ける必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>P100ピペットを用いて肝球を除去せずに過剰培地を慎重に吸引し、肝球を含む培地の〜1mLがポリHEMAに十分に被覆されたままになるまで。</li>
	<li>12日間48時間ごとに媒体を変更します。</li>
	<li>hiPSCを使用する場合は20日目または22日目に、培地を肝細胞維持培地に切り替える。
	<ol>
<li>肝細胞成熟培地を除去し、サプリメントなしで肝細胞維持培地で一度細胞を洗浄します。HGF、EGF、FGFおよびVEGFの10 ng/mLを補充した肝細胞維持培地の1 mLを添加する。</li>
	</ol></li>
	<li>新鮮な肝細胞維持培地の培地を48時間ごとに変更します。</li>
</ol>4. 長期培養3D肝球の機能解析
<ol><li>機能分析を行う前に、10 μM HCC、L-グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(それぞれ100 IU/mLおよび100 μg/mLでの最終濃度)および10 ng/mL HGF 48hを補充した肝細胞成熟培地に切り替える。</li>
	<li>
サイトクロム(CYP)P450アッセイを用いて肝細胞代謝機能を分析する。
	<ol>
<li>50 μMルシフェリン-6'-ペンタフルオロベンジルエーテル(ルシフェリン-PFBE)基板を補充した新鮮な肝細胞成熟培地の1mLで培地を置き換え、CYP3A基底活性または100μMルシフェリンメチルエーテル(ルシフェリン-ME)を検出する。基底活動(反復数= 3)。組織培養培養培養培養を陰性対照として使用する。 注:クロス反応性を避けるために、異なるCYP P450活性をテストするために3D肝球を含む同じウェルを使用せず、個々のウェルでそれらを実行することをお勧めします。</li>
		<li>37°Cで24時間細胞をインキュベートする。</li>
		<li>P100ピペットチップを使用して上清を収集し、メーカーの指示に従ってアッセイを行います。</li>
		<li>基底活性の相対レベルを測定し、ビシンコニン酸アッセイ(BCA)によって決定されるmgタンパク質当たりに正規化する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を用いて血清タンパク質産生を試験する。
	<ol>
<li>10 ng/mL HGFおよび20 ng/mL OSM(反復数=3)を補充した新鮮な肝細胞成熟培地の1 mLで培地を置き換える。組織培養培養培養培養を陰性対照として使用する。</li>
		<li>37°Cで24時間細胞をインキュベートする。</li>
		<li>P100ピペットチップを使用して上清を収集し、メーカーの指示に従って血清タンパク質産生の相対的なレベルを測定します。</li>
		<li>BCAアッセイによって決定されるmgタンパク質当たりに正規化する。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 免疫細胞化学
<ol><li>
肝球を含むパラフィンセクションの調製。
	<ol>
<li>1x DPBSで肝球を3回洗います。</li>
		<li>肝球を氷冷メタノールで30分間固定します。</li>
		<li>1x DPBSで3回洗浄します。</li>
		<li>24ウェルプレートの空の井戸を金型として使用してH2Oに溶解した2%アガロースの強化溶液の300μLに肝球を埋め込み、30分間固化させるためにそれを残します。</li>
		<li>肝球を含むアガロースをパラフィンに埋め込みます。</li>
		<li>固定肝圏を含むパラフィンブロックをマイクロトームを用いて4μm厚いセクションに切り分ける。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
セクションの脱ワックスおよび水分補給。 注:可能な場合はいつでも新しいソリューションを使用してください。1週間以上染色トラフにあった溶液を使用しないでください。<ol>
<li>断面をスライド ラックに配置します。</li>
		<li>300 mLのキシレンを含む染色トラフに5分間、断面を含むスライドラックを浸します。</li>
		<li>手順 5.2.2 を繰り返します。</li>
		<li>絶対エタノールを20sに浸します。</li>
		<li>95%エタノールを20sで浸します。</li>
		<li>90%エタノールを20sで浸します。</li>
		<li>80%エタノールを20sで浸します。</li>
		<li>70%のエタノールを20sで浸します。</li>
		<li>5分間水でセクションを水分補給します。 注:スライドを同じスライドラックに保持し、1 つの染色トラフから次のスライド ラックに移動します。使用される体積(一般に〜300 mL)は、染色トラフの大きさに依存する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
肝球を含むパラフィンセクションの抗原検索。
	<ol>
<li>800 Wの電子レンジで15分間1xトリス-EDTA(TE)pH 9.0バッファ溶液でワックスを脱ワックスおよび再水和したセクションを熱します。</li>
		<li>5分間水道水に浸してサンプルを冷却します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
免疫染色。
	<ol>
<li>RTで0.1%ポリソルベート20(PBS/T)/10%BSAでPBS製のブロッキング溶液でスライドをインキュベートします。</li>
		<li>ブロッキング溶液をPBS/T/1%BSAで希釈した適切な一次抗体に置き換え、4°Cで一晩穏やかな撹拌でインキュベートします。</li>
		<li>PBS/Tで5分間洗浄し、3回繰り返します。</li>
		<li>PBS/T/1%BSAで希釈した適切な二次抗体を用いてインキュベートし、穏やかな撹拌で1時間RTで暗闇の中でインキュベートする。 注:最適化された一次抗体および二次抗体は、材料の表に記載されています。</li>
		<li>PBS/Tで5分間洗浄し、3回繰り返します。</li>
		<li>4',6-diamidino-2-フェニリンドール(DAPI)を製造元の指示に従ってセルに追加し、ガラスカバースリップを穏やかに配置して気泡を減らします。暗いところで4°Cで固定細胞を保管してください。適切なフィルターと蛍光灯で顕微鏡下で染色を観察します。 注:イメージングまで暗闇の中で4°Cでプレートを保存します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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デビッド・C・ヘイは、ステムノベート社とハイアーステーキ社の共同創設者であり株主です。著者の残りの部分は、彼らがこの記事で議論される主題や材料に利益相反がないことを証明します。

インビトロとインビボの両方で、ヒト肝圏を3Dで生成する定義済みおよび異種フリーシステムの開発が必要である。現在、ヒト多能性幹細胞からのヘパトサイト分化アプローチのほとんどは、2次元の付着培養において行われている。これらの環境は、組織の発生と恒常性に関与する環境手がかりの多くを欠いている;不一因な細胞相互作用、マトリックス産生および改造、生体内生物学18、19への翻訳が不十分な結果となった。
その結果、多能性幹細胞から肝球を生成する代替アプローチに焦点を当てた研究が行われました。多くの3D研究は、この分野を進歩させたが、それらはサポートを提供し、および/または複雑にするヒト組織21、22の使用を必要とする動物製品20、22、24に依存している技術スケールアップと妥協実験的な再現性とアプリケーション。
私たちの記事(図1)に記載されている手順は、インビトロで1年以上機能し、重要な肝臓サポートを提供する機能的な肝臓球の生産を可能にし、効率的で、非常に再現性が高く、費用対効果が高いと定義されています。ビボ14.重要なことに、このプラットフォームは、ユーザーが3D肝球のサイズを制御することができ、密な壊死中心の形成と表現型の損失を制限します。
3D肝球をポリHEMAコーティングプレートに移すのは、このプロトコルの重要なステップを表します。球を損傷しないように手順のこの段階で穏やかにピペットすることが重要です。さらに、点気応力や球体構造の歪みを避けるために、メディアの変更を慎重に行う必要があります。
これらの研究では、3D肝球は組織化された構造(図2および図3)、シトクロムP450機能(図4)およびアルブミンおよびα-フェトプロテインを含む分泌された肝タンパク質を示した(図5)。この手順は、同等の結果を有する4つの多能性幹細胞ラインで正常に行われている。今後、この技術は、複雑なアーキテクチャを持つさらに内皮組織と間葉組織を開発するためのプラットフォームとして採用される可能性があります。

ヒト多能性幹細胞(hPSC)が自己更新する能力は、多能性を保持しながら、オンデマンドでヒト細胞の種類および組織を生産する機会を提供する。hPSCは、2次元(2D)付着培養系1、2、3、4、5、6を用いて肝細胞様細胞(HLC)に効率的に分化した。 ,7,8,9,10.これらのシステムは、単原性疾患、ウイルスライフサイクル、薬物誘発肝損傷(DILI)、毒素および非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)への胎児暴露を正常にモデル化するために使用されてきた11,12,13 、14、15.ただし、これらのモデルには、日常的な使用を制限するいくつかの欠点があります。それらは、胎児マーカー発現、不安定な表現型および貧弱な組織構造16、17、18、19を含み、生体内の器官機能への外挿を制限することもできる。
これらの限界を克服するために、生体内組織アーキテクチャを模倣するために3次元(3D)分化プラットフォームが開発されました。有効にするが、これらのアプローチは、組織発生20、21、22を駆動するために動物由来製品とマトリックスの使用に依存し、スケールアップと広範な適用を制限する。
ここでは、定義された材料とセル自己組立を使用して、hPSCから大量の3D肝球を生成する手順を詳しく説明します。特に、我々の手順によって生成された組織は、細胞培養において1年以上機能し続け、生体内23における肝機能を支持することができる。
要約すると、我々の定義された分化アプローチは、ヒト胚性幹細胞(hESC)と誘導多能性幹細胞(iPSC)の両方から安定したヒト肝圏の生成を可能にする。我々は、記述された手順は、基礎的および応用的な科学的研究のための3D肝球の生成における重要なブレークスルーを表すと信じています。

<table><tbody><tr><td>細胞培養および機能アッセイ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>10766834</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement&nbsp;</td><td>ライフテクノロジーズ&nbsp;</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>β-メルカプトエタノール</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>31350</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A2058&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>インビトゲン</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>DPBS、カルシウム、マグネシウムなし</td>、<td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>14190250 DPBSとカルシウムおよびマグネシウム</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>14040133</tr><tr><td>穏やかな細胞解離試薬</td><td>STEMCELL Technologies&nbsp;</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>グルタマックス&nbsp;</td><td>ライフテクノロジーズ&nbsp;</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>HepatoZYME-SFM</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>&nbsp; 17705021</td><td></td></tr><tr><td>ヒューマンアクティビンA&nbsp;</td><td>ペプロテック&nbsp;</td><td>120-14E</td><td></td></tr><tr><td>の人間のアルファのフェト蛋白質ELISA</td><td>のアルファ診断</td><td>500</td><td></td></tr><tr><td>の人間の基本的なFibrobasltの成長因子</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>ヒト上皮Gropwth因子</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>ヒト肝細胞増殖因子</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>100-39</td><td></td></tr><tr><td>ヒトオンコスタチン M&nbsp;</td><td>ペプロテック&nbsp;</td><td>300-10</td><td></td></tr><tr><td>ヒト組換えラミニン 521&nbsp;</td><td>バイオラミナ&nbsp;</td><td>LN521-02</td><td></td></tr><tr><td>ヒト血清アルブミン ELISA</td><td>Alpha Diagnostics</td><td>1190</td><td></td></tr><tr><td>ヒト血管成長因子</td><td>Bio-techne</td><td>293-VE</td><td></td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン 21-ヘミスコハク酸ナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>H4881</td><td></td></tr><tr><td>ノックアウトDMEM&nbsp;</td><td>ライフテクノロジーズ&nbsp;</td><td>10829</td><td></td></tr><tr><td>ノックアウトセラムリプレイスメント&nbsp;</td><td>ライフテクノロジーズ&nbsp;</td><td>10828</td><td></td></tr><tr><td>マイクロモールドスフェロイド&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td></td><td></td>Z764000</tr><tr><td>mTeSR1 ミディアム&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies&nbsp;</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸&nbsp;</td><td>ライフテクノロジーズ&nbsp;</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>P450-GLO CYP1A2 アッセイおよびスクリーニングシステム</td><td>Promega</td><td>V8771</td><td></td></tr><tr><td>P450-GLO CYP3A4 アッセイおよびスクリーニングシステム</td><td>Promega</td><td>V8801</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>ポリHEMA(ポリ2-ヒドルキシエチルメタクリレート)&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>P3932</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウス Wnt3a&nbsp;</td><td>バイオテクネ</td><td>1324-WN-500/CF</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640&nbsp;</td><td>ライフテクノロジーズ&nbsp;</td><td>21875</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</>Microwave</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Bosch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leika</td><td>RM2125RT</td><td></td></tr><tr><td>Oven</td><td>Thermoscientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>一次抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アルブミン&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>A6684&nbsp;</td><td>1:100(マウス)</td></tr><tr><td>CYP3A4</td><td>ダンディー大学</td> ダン<td>ディー大学</td><td>1:200 (羊)</td></tr><tr><td>E-cadherin</td><td>Abcam</td><td>ab76055</td><td>1:200 (マウス)</td></tr><tr><td>HNF-4&alpha;</td><td>サンタクルス</td><td>sc-8987</td><td>1:100 (ウサギ)</td></tr><tr><td>IgG</td><td>DAKO</td><td>X0943</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>DAKO</td><td>M0725</td><td>1:100 (羊)</td></tr></tbody></table>

多能性幹細胞からの3次元ヒト肝球の血清自由産生

Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells

細胞ベースのモデリングを改善し、移植のためのヒト組織を開発するためには、肝臓組織の再生可能な供給源の開発が必要である。ヒト胚性幹細胞(HESC)およびヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)は、ヒト肝球の有望な供給源を表す。ヒト多能性幹細胞から形成された三次元ヒト肝球を生成する血清フリーで定義された細胞分化法を開発した。技術の潜在的な制限は、内部の死んだ材料を持つ密な球の生産です。これを回避するために、我々は3D球のサイズを制御するために定義された細胞密度でアガロースマイクロウェル技術を採用し、アポトーシスおよび/または壊死コアの生成を防止しています。 特に、我々のアプローチによって生成された球体は、肝機能と安定した表現型を表示し、基礎的および応用科学的研究のための貴重なリソースを表す。私たちのアプローチは、ヒトの疾患をモデル化し、治療するためのさらなる組織を開発するためのプラットフォーム技術として使用できると考えており、将来的には複雑な組織構造を持つヒト組織の生成を可能にする可能性があります。

胚性幹細胞株(H9)または誘導多能性幹細胞株(P106)からの三次元凝集体を、我々の定義した手順を用いて肝細胞系統に向けて分化した(図1)。多能性幹細胞は、肝芽細胞仕様の前に決定的な内皮に向かって最初にプライミングされた。これに続いて、肝芽細胞は3D肝球に成熟し、培養中に最大1年間23年維持することができた。
3D球の構造を研究するために、30日前のhESC-またはiPSC由来の球を固定し、切り分けし、染色し、肝細胞および間葉細胞で発現するタンパク質の存在を検出した。肝細胞核因子4α(HNF4α)と間葉マーカービメンチンを用いて、間葉細胞のコアを取り囲む細胞のような肝細胞からなる外層の存在を明らかにした(図2)。アルブミン、CYP3A、E-カドヘリンの肝細胞で発現するタンパク質の発現を解析した実験を行った。免疫染色は、これらのタンパク質の発現が球の外層に限定されたことを明らかにした(図3)。
肝球の機能分析は、30日目の培養物で行った。CYP1A2およびCYP3Aは、機能性肝細胞内の重要な酵素である。彼らの活性は確立されたアッセイを用いて評価された。H9由来肝球は、220,375 ±74514 RLU/mL/mgタンパク質およびCYP1A2活性732,440±33,330 RLU/mL/mgタンパク質のCYP3A活性を示した(図4A)。P106由来肝球におけるCYP3A活性は132117±43,391 RLU/mL/mgタンパク質およびCYP1A2活性は409,907±121,723 RLU/mL/mgタンパク質であった(図4B)。ヒト原発性肝細胞の2つのバッチと比較した場合、3D肝球はCYP活性10の立派なレベルを示した。
アルブミンとα-フェトプロテイン(AFP)の合成と分泌の分析により、H9由来肝球が683.9±84及び159±20ng/mL/24 h/mgタンパク質のアルブミンおよびα-フェトプロテインをそれぞれ分泌することが明らかになった(図5A)。P106由来肝球は、アルブミンおよびα-フェトプロテインの497±41及び756±24ng/mL/24 h/mgタンパク質をそれぞれ分泌した(図5B)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59965/59965fig1.jpg"> 図 1: hESCから3D肝球を生成する段階的な分化手順。青い角かっこは、hiPSC の差別化の日数を表します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59965/59965fig1large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59965/59965fig2.jpg"> 図 2:3D肝球の構造再編。肝細胞核因子4α(HNF4α-緑)およびビメンチン(赤色)の表発の代表的な画像(A)H9由来3D肝球および(B)P106由来3D肝球およびそれに対応する免疫グロブリンG(IgG)対照.スケールバーは60 μmを表します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59965/59965fig2large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59965/59965fig3.jpg"> 図 3: 3D肝球圏における肝マーカー発現の評価肝細胞マーカーの発現の代表的な画像 - アルブミン、CYP3A、E-カドヘリンおよびそれに対応するIgGコントロール(A)H9-および(B)P106由来3D肝球。スケールバー = 60 μm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59965/59965fig3large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59965/59965fig4.jpg"> 図 4:3D肝球圏のシトクロムP450機能。(A)H9由来3D肝球及び(B)P106由来3D肝球におけるシトクロムP4501A2および3A活性の測定。データは3つの生物学的反復の平均を表し、誤差バーは標準偏差(SD)を表します。活性は、タンパク質のmg当たりmL当たりの相対光単位(RLU)として引用される。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59965/59965fig4large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59965/59965fig5.jpg"> 図 5: 肝圏タンパク質分泌の分析アルブミンおよびα-フェトプロテイン(AFP)の分泌を(A)H9由来3D肝球および(B)P106由来3D肝球で分析した。データは3つの生物学的反復を代表し、誤差バーはSDを表し、分泌タンパク質は、タンパク質のmg当たり24時間当たりmL当たりのタンパク質のナノグラムとして引用される。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59965/59965fig5large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、定義された培養システムおよび細胞自己組織化を用いてヒト多能性幹細胞から肝球を産生するアプローチを記述する。このプロトコルは、多くの細胞株で再現可能であり、費用対効果が高く、生物医学的応用のための安定したヒト肝圏の生産を可能にする。

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human ...

このメトジェネティクスは、アセンブリの微細な材料と細胞を使用して、ヒト多能性幹細胞の3D肝圏を大量に含んでいます。この技術の主な進歩は、壊死性の中心の形成および表現型の喪失を制限し、3D肝臓球のサイズを制御することができるということです。私と一緒に手順を実証することは、私たちの研究室の博士号を持つユ・ワンです。100ミリリットルの殺菌蒸留水に2グラムの低温アガロースを溶解してアガロース型を提示する準備をします。慎重にアガロースを完全に溶解するために間隔振盪で電子レンジで混合物を加熱します。溶かしたアガロースの520マイクロリットルを256のウェルフォーマット型の型に加え、固化させます。次に、各アガロースマイクロプレートを12ウェルプレートの単一のウェルに移します。各ウェルにカルシウムとマグネシウムを含むDPBSの1.5ミリリットルを追加し、気泡を取り除くために上下にピペット。細胞懸濁液を調製するために、ヒト多能性幹細胞、またはHPSCの未分化培養物から培地を吸引することから始める。室温DPBS、カルシウム、またはマグネシウムを5ミリリットル加えて細胞を洗い流し、バッファーを取り除きます。細胞に5ミリリットルの細胞解離試薬を加え、摂氏37度で6~8分間インキュベートします。顕微鏡下で細胞剥離を観察し、必要に応じて1〜2分間インキュベーションを延長します。細胞解離試薬を除去し、新鮮なMTの5ミリリットルを添加することによって反応を停止し、10マイクロモルロック阻害剤、Y27632を添加した1つの培地を提供する。ピペットは、細胞の解化のために数回上下します。血球計とストリーパンブルー染色で生存細胞を数え、必要な細胞の総数を計算します。所望の数の細胞を無菌15または50ミリリットル遠心分離管に移し、遠心分離機を200回Gで5分間ペレット化する。上清を捨て、MTの細胞を再中断すると、1ミリリットル当たり210万細胞の最終濃度に対して10ミクロモルロック阻害剤を用いて1つの培地に作用する。次に、アガロースマイクロウェルあたり190マイクロリットルの調製細胞懸濁液を添加し、アガロースマイクロプレートを5%の二酸化炭素で2時間インキュベートして細胞を保存します。インキュベーションの後、新鮮で暖かいTサーブ1培地をロックインヒビターで1ミリリットルずつ各ウェルに加えます。プレートをインキュベーターに戻し、24時間そこに残します。翌日、形成の球を調べる。ポリ2ヒドロキサーチルメタクリレートまたはポリヘマコーティングウェルを100ミリリットルの95%エタノールに溶解し、55°Cのホットプレートで一晩攪拌して、コーティングされたウェルを調製します。翌日、24ウェルプレートの各ウェルに溶液250マイクロリットルを加え、60°Cのオーブンで一晩プレートを乾燥させます。慎重にMTを除去し、前に播種した細胞から1培地を除去し、新鮮な内胚分化培地の1ミリリットルに置き換えることによって、肝細胞分化を開始します。ヒト胚性幹細胞の場合、24時間ごとに3日間培地をリフレッシュする。自発的な細胞分化を避けるために、播種後24時間で肝細胞分化を開始することが重要です。決定的な内胚葉誘導の後、培地を肝芽細胞分化培地に5日間切り替える。2日ごとに培地を交換し、肝芽細胞仕様の最終日に最後の変更を行います。準備されたポリヘマコーティングされた井戸に肝球を移すために、肝細胞成熟培地で細胞を洗浄し、1ミリリットルHGFあたり10ナノグラムと1ミリリットルOSMあたり20ナノグラムを添加した培地の1ミリリットルを加える。溶液を数回上下にピペットして、アガロースマイクロプレートから肝球を持ち上げ、よくコーティングされたポリヘマに移します。アガロースマイクロプレートを1ミリリットルの添加肝細胞成熟培地で洗浄し、ポリヘマによくコーティングした培地に移します。P-100ピペットを用いて、ウェルに約1ミリリットルの培地が残るまで肝球を除去せずに余分な培地を慎重に吸引する。12 日間、48 時間ごとにメディアを更新します。胚性幹細胞を用いて作業する場合は、成熟培地を除去し、維持培地で細胞を洗浄し、次に1ミリリットルの補充維持培地を添加することにより、20日目に培地を肝細胞維持培地に切り替える。この後、48 時間ごとにメディアを更新します。このスフェリック構造の深刻なストレスや歪みを避けるために、即時変更は慎重に行う必要があります。間葉系マーカーにおける肝細胞の染色は、この技術を用いて形成された肝球が間葉細胞の核を取り囲む肝細胞様細胞で構成されていることを明らかにする。肝細胞で典型的に発現する他のタンパク質も、球の外層に見られる。30日間の肝球培養におけるシトクロムP450酵素またはCYPの機能解析は、3D球がヒトの原発肝細胞と比較してCYP活性の立派なレベルを示すことを示した。さらに、肝圏がアルブミンやアルファフェトタンパク質などの肝臓タンパク質を分泌することを実証できる。このプロトコルで覚えておくべきことは、ポリヘマコーティングされたプレートに移すときに、3D肝球を含む溶液を上下に穏やかにピペットすることです。これは、彼らに損傷を与えることを避けるのに役立ちます。一度習得すると、この方法論は、deceaseモデリングと薬物スクリーニングで複数のアプリケーションで1年間インビトロで機能し続ける3D肝球の生成を可能にします。将来を見据えて、この技術は複雑なアーキテクチャを持つ更なる内皮組織と間葉組織を開発するためのプラットフォームとして採用される可能性がある。

serum-free-production-three-dimensional-human-hepatospheres-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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多能性幹細胞からの3次元ヒト肝球の血清自由産生

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