原発性ニューロンにおける神経質の増殖を研究するための強化された緑色蛍光タンパク質ベースのアッセイ
2019年10月19日
本報告では、EGFPと目的のタンパク質との共トランスフェクトにより、胚ラット皮質ニューロンにおける神経伝達の増殖を研究するための簡単なプロトコルについて述べる。
トランスフェクション効率の低さは、タンパク質が一次ニューロンの神経突起成長を再活性化する方法を決定する上で大きな障害です。私たちのプロトコルは、EGFPの共同トランスフェクションによってこの問題を克服し、正常にトランスフェクトされた細胞を同定します。EGFPの高い共同トランスフェクション速度と関心のあるタンパク質は、アッセイの精度を保証します。
その結果、免疫蛍光染色が必要になりました。神経再生中に神経突起の伸長が起こるので、この方法は、脳外傷または神経変性疾患における損傷した神経ネットワークを回復するための新しい標的の同定に適用することができる。手順を開始する前に、滅菌18ミリメートルの円形カバースリップを12のウェル組織培養プレートの各ウェルウェルに入れ、各カバースリップにポリD-リジン溶液を1ミリメートル当たり5マイクログラムでコーティングし、少なくとも1時間は加湿した37°Cのインキュベーターに入れます。
インキュベーションの終わりに、ポリ-D-リジン溶液を吸引し、滅菌水でカバーリップをすすいします。胚性の日に18日目に、時を取った妊娠中のスプレイグ・ドーリーラットから収穫した子宮を10センチメートルのペトリ皿に入れ、小さな解剖ハサミを使って子宮と羊膜嚢を開きます。はさみを使用して胎盤を取り除き、鉗子を使用して1つの胚全体を冷やしたPBSグルコースを含む新しい10センチメートルのペトリ皿に移します。
頭蓋骨の矢状縫合に沿って切断し、新鮮な氷冷PBSグルコースを含む新しい10センチメートルペトリ皿に胚脳を転送するために小さな平らなへらを使用するためにはさみを使用してください。2つのナンバー5ピンセットと解剖顕微鏡を使用して、小脳と脳幹から2つの大脳半球を分離し、髄液を取り除く。その後、大脳半球から皮質を分離し、新鮮な氷冷PBSグルコースを含む15ミリリットルのチューブに皮質を入れる。
原皮質ニューロン培養の場合、クラスIIバイオセーフティキャビネットでは、PBSグルコースを0.05%トリプシンEDTAに置き換える前に、摂氏4度で5分間重力で皮質を沈着させる。穏やかなタッピングと混ぜ、2分ごとに追加の穏やかなタッピングで10分間摂氏37度の水浴で組織をインキュベートします。インキュベーションの終わりに、4ミリリットルの維持培地で消化を止め、1ミリリットルのピペットを使用して穏やかなトリチュエーションで組織を解きほしい。
遠心分離によって細胞を沈め、2回目の遠心分離のために1ミリリットルの維持培地中のペレットを再懸濁する。2回目の遠心分離後に形成されたペレットをカウントするための新鮮な維持培地の1ミリリットルで再懸濁し、12ウェルプレートで1ミリリットルの維持培地で4センチメートル平方濃度の6.5倍の10倍の位置で単離されたニューロンをプレートする。摂氏37度と二酸化炭素5%で2日間後、EGFPを希釈し、タンパク質プラスミドのドナとトランスフェクション試薬を2つの別々の1.5ミリリットルチューブで混合します。
EGFPを用いて細胞をトランスフェクション構造に添加し、そのトランスフェクションミックスをウェルに添加します。24時間後、37°CのPBSで細胞を洗浄し、室温で暗闇の中で10分間PBSで4%パラホルムアルデヒドで固定します。インキュベーションの終わりに、固定細胞を洗浄ごとに新鮮なPBSで3回洗浄し、サンプル当たりの顕微鏡ガラススライド1枚に最小限の蛍光実装媒体を加えます。
次に、コーティングされたカバーリップを慎重に、ガラススライドに面したサンプルで取り付けメディアに移します。神経突起の成長を画像化するには、蛍光顕微鏡上で40Xの目的を選択し、トランスフェクションごとに少なくとも40の無傷のEGFP陽性ニューロンからの画像をキャプチャするために開始をクリックします。すべての神経突起が画像化されたら、キャプチャした画像をNeuronJプラグインでImageJで開き、細胞体から成長コーンの先端までの各ニューロンの最長の神経突起の長さを測定します。
次に、ソフトウェアで得られたデータを分析し、対象タンパク質が神経突起増殖に及ぼす影響を調べます。サイトカラシンDは、神経成長因子で治療されたニューロンにおいて神経突起の伸長が増強されている間、用量依存的に神経突起の延長を抑制する。さらに、ニューロン成長アダプタータンパク質FE65は、未感染ニューロンと比較して神経突起伸長を2倍に有意に刺激する。
低いトランスフェクション効率にもかかわらず、免疫蛍光分析は、2日間の細胞培養の80%以上がEGFPおよびFE65との共感染に成功することを明らかにした。EGFP発現はトランスフェクション後6時間で検出され、FE65は最初に12時間で検出され、両方の信号はトランスフェクション後最大7日間検出されます。FE65プラスミドDNAの異なる量を有する一次ラット皮質ニューロンのトランスフェクションは、FE65プラスミドの0〜0.5マイクログラムの神経突起拡張における用量依存的増加を明らかにする。
しかし、0.5または1マイクログラムのプラスミドをトランスフェクトしたニューロンでは、増殖に有意な差は認められない。プロトコルを試みる際には、胚性脳から適切な領域を分離することが重要である。また、再生医療に有用なツールを持つヒトiPSC由来ニューロンの神経成長の研究にも応用できる。
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概要
本レポートでは、EGFPと目的タンパク質を共導入することで、ラット胎児皮質ニューロンにおける神経突起伸展を解析するためのプロトコルを提示します。この手法により、導入効率が向上し、導入に成功した細胞を正確に特定することが可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 神経再生
背景
- トランスフェクション効率の低さは、神経突起伸展に対するタンパク質の影響を研究する上での妨げとなります。
- EGFPとの共トランスフェクションにより、トランスフェクトされた細胞の同定が容易になります。
- 神経突起の伸展は、神経再生において極めて重要です。
- 本手法は、脳外傷や神経変性疾患における神経ネットワーク回復のための標的同定に寄与します。
研究目的
- 神経突起伸展を研究するための信頼性の高いプロトコルを開発すること。
- 初代ニューロンにおけるアッセイの精度を向上させること。
- 新規の治療標的の同定を促進すること。
使用方法
- ラット胎児皮質ニューロンへのEGFPおよび目的タンパク質の共導入。
- 神経突起伸展を可視化するための免疫蛍光染色。
- 細胞培養用のPoly-D-Lysineコーティング済みカバーガラスの調製。
- コーティング済みカバーガラスの加湿環境下でのインキュベーション。
主要な結果
- 高い共 transfection 効率により、transfected ニューロンを正確に識別できます。
- 免疫蛍光染色による神経突起伸長の可視化に成功しました。
- このプロトコルは、目的とするさまざまなタンパク質に適応させることが可能です。
- 神経変性疾患の研究への応用が期待されます。
結論
- 開発されたプロトコルにより、トランスフェクション効率が大幅に向上します。
- この手法は、神経突起伸展のメカニズムを研究する上で有用です。
- これにより、神経修復戦略の研究に向けた道が開かれます。
よくある質問
産業界における重要性
初代ニューロンにおける神経突起伸展の定量的評価は、神経変性および再生パイプラインにおけるターゲットバリデーションおよびメカニズムのリスク低減において極めて重要です。EGFPを用いた共導入アッセイにより、ニューロン形態に対するタンパク質特異的な影響を正確に特定することが可能となり、初期探索段階における予測の信頼性が向上します。このアプローチは、神経修復および疾患修飾の候補ターゲットに対する堅牢な評価を可能にすることで、ポートフォリオの意思決定を強化します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 初代ニューロンを用いて、ニューライト伸展におけるタンパク質機能の直接的な検証が可能になります。
- 特定のタンパク質がニューロンの成長に与える影響を単離することで、メカニズムの低リスク化を支援します。
- 神経再生および神経保護戦略のための機能的なターゲットバリデーションを促進します。
- ターゲットを前臨床モデルへ移行させる際の予測的な信頼性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 遺伝学的または薬理学的な摂動に応答した神経突起伸展を定量化するための、検証済みシステムを提供します。
- 候補分子の比較スクリーニングに適した、再現性のある定量的な出力結果を提供します。
- アッセイ条件の標準化を可能にし、研究間およびチーム間での再現性を確保します。
- iPSC由来システムを含む、他の神経細胞モデルへの拡張可能な適応をサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 哺乳類一次ニューロンを用いることで、神経変性および外傷に関する疾患関連モデルとの整合性を確保します。
- 定量的なニューライト測定により、トランスレーショナルなバイオマーカーの開発を可能にします。
- 分子介入をニューロンの機能的アウトカムに結びつけることで、創薬から前臨床検証までの連続性をサポートします。
- メカニズムに基づいた早期データを提供することで、後期の脱落リスクを低減します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このEGFPを用いたアッセイは、初代培養ニューロンにおけるタンパク質機能の仮説駆動型検証を可能にすることで、ターゲットバリデーションとリード化合物同定の両方を支援し、創薬から前臨床に至る連続的なプロセスへと統合されます。
- 探索生物学：神経突起伸展に対するタンパク質の効果について帰無仮説検定を容易にし、パスウェイの役割を解明します。
- スクリーニング：化合物または遺伝子スクリーニングキャンペーンにおいて、定量的な再現性のある読み取り値を提供します。
- 分析：実験条件間で統計的に比較可能な測定可能な出力（神経突起の長さ）を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：in vitroでの知見を疾患関連モデルに橋渡しし、バイオマーカーの整合性をサポートします。
- 企業内での再利用：継続的なターゲットおよびパスウェイの解析に向けた、標準化され適応可能なプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：神経系ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を高め、メカニズムの曖昧さを低減します。
- 運用的価値：創薬チーム間での再現性と標準化を向上させます。
- 戦略的価値：Go/No-Go判断の根拠となり、機能的根拠のあるターゲットを優先順位付けします。
- ポートフォリオへの影響：神経治療プログラムにおけるリスク調整後の推進およびリソース配分を支援します。
実施上の検討事項
- 一次ニューロン培養および蛍光イメージングの専門知識が必要です。
- エピ蛍光顕微鏡および定量的な画像解析ツール（例：NeuronJプラグインを導入したImageJ）を利用できる環境が必要です。
- 再現性を確保するため、トランスフェクションおよびイメージングプロトコルのチーム間での標準化が求められます。
- より広範なトランスレーショナルな妥当性を持たせるため、ヒトiPSC由来ニューロンへの適応が可能です。
- 堅牢なアウトプットを得るには、ニューロン分離の質とトランスフェクション効率に依存します。
