Name: クロマチンドメインのノボ形成を研究する方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: 学ぼう PRC2媒介クロマチンドメインの動的な形成と拡散をマウス胚性幹細胞でリアルタイムに追跡する方法。このシステムは一時停止して詳細解析が可能で、様々な細胞過程の研究に応用できます。

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原稿の改訂に感謝します。D.R.ラボは、ハワードヒューズ医学研究所と国立衛生研究所(R01CA199652およびR01NS100897)によってサポートされています。

誘導性EEDレスキューMESCの生成
1. 細胞培養
<ol><li>4-ヒドロキシタモキシフェン(4-OHT)13の投与時に核に転移することができる安定に統合されたCreERT2トランスジーンを有するフィーダーフリーC57BL/6マウス胚性幹細胞(MESC)を使用する。</li>
	<li>従来のESC培地14,15でMESCを成長させ、1000 U/mL LIF、1μM ERK阻害剤PD0325901および3μM GSK3阻害剤CHIR99021を補充した。従来のESC培地では、15%の胎児ウシ血清(FBS)、2mM L-グルタミン、1Xペニシリン/ストレプトマイシンおよび0.1mM 2-メルカプトエタノールを含むノックアウトDMEMを使用する。</li>
	<li>mESCを培養するための0.1%ゼラチン溶液でコーティングされたプレートを使用してください。</li>
</ol>2. クローンEEDノックアウト(KO)MESCの生成
<ol><li>設計ガイドRNA(gRNA)は、ベンチリング16のCRISPR設計ツールを使用して、MESCでEEDの内因性コピーのエクソン10とエキソン11を削除します。EED-KO-gRNA-1は、エキソン10の直下流のイントロンを標的とし、EED-KO-gRNA-2はエキソン11の直下流のイントロンを標的とする。これらのgRNAの同時適用は、非相同エンド結合(NHEJ)によってExon 10とExon 11の両方を削除する。</li>
	<li>ran et al., 201317.</li>
	<li>6ウェルプレート形式では、トランスフェクション試薬を使用して、各EED-KO-gRNA-1およびEED-KO-gRNA-2(材料の表を参照)の1mgを持つトランスフェクト2 x 105 MESCを、メーカーの指示に従ってトランスフェクション試薬を使用します。トランスフェクション後にメディアを24時間変更します。</li>
	<li>トランスフェクションの2日後、蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いてGFP陽性細胞を単離する。トランスフェクションの効率は10~30%程度変化すると予想されます。5 x 105セルの周りを並べ替えて、めっきに十分な GFP 陽性細胞をキャプチャします。</li>
	<li>単離されたGFP陽性MESCを15cmプレートにプレートし、コロニーピッキング用に0.1%ゼラチン(1皿あたり10~20 x 103細胞)をあらかじめコーティングします。</li>
	<li>単一のコロニーが見えるまで約1週間ESC培地で細胞を成長させる。2 日ごとにメディアを変更します。</li>
	<li>20 μL マイクロピペットチップを使用して、48個以上のコロニーを選びます。マイクロピペット先端に吸気しながらコロニーの上にこすりつけます。コロニーを単一の細胞に分割しないでください。コロニーをアキュターゼ含有(20mL)96ウェルプレートに移す。</li>
	<li>すべての細胞が解離されるまで、37°Cで10分間コロニーをインキュベートします。</li>
	<li>マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルにESCメディアの200 mLを追加します。</li>
	<li>よく混合し、マルチチャンネルピペットを使用して2つの別々の96ウェルプレートに細胞をプレート。</li>
	<li>ジェノタイピングに 96 のウェルプレートのいずれかを使用し、ジェノタイピングが終了するまでもう 1 つを成長させ続けます。DNA抽出溶液を使用して、製造元の指示に従って96ウェルプレートからDNAを抽出します。</li>
	<li>ジェノタイピングプライマーGnt_EED-KO-upとGnt_EED-KO_downを使用して、削除されたサイトにまたがるし、メーカーの指示に従ってTaq DNAポリメラーゼでジェノタイピングPCRを実行します。 注:他のタイプのDNAポリメラーゼもジェノタイピングに使用できますが、着色反応バッファーを使用するとPCR反応をゲルに直接ロードできるため、Taq DNAポリメラーゼは利便性を提供します。<ol>
<li>野生型(WT)の場合に対してホモ接合性欠失を有する細胞における低分子量のDNA産物を観察する。 注:PRC2ヌル細胞を生成するには、コアPRC2 13の必須サブユニットであるEEDを不安定化および分解するために、エキソン10および11のホモ接性欠失が必要である。CRISPRのターゲティング効率は約10%です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>EEDエキソン10および11の欠失と、サンガーシーケンシングおよびウェスタンブロッティングによるEEDタンパク質の喪失をそれぞれ検証する。</li>
	<li>H3K27me2/me3およびEEDに対する抗体を用いたChIP-seqによるEED KO細胞中のクロマチンからのEEDおよびH3K27me2/me3の枯渇を確認する。2017年15月のOksuz et al.で与えられたプロトコルを使用して、ChIP-seq実験を行います。</li>
</ol>3. EEDノックアウトMESCをエンジニアリングし、Cre-ERT2ベースの誘導性EED式を保有する
<ol><li>ベンチリング16のCRISPR設計ツールを用いてEEDのエキソン9に続くイントロン内のカットを導入するgRNA(EED-gRNA誘導性)を設計する(材料の表を参照)。</li>
	<li>ran et al., 201317.</li>
	<li>エキソン9の後にEED cDNA配列を含むドナーテンプレートDNAを設計し、T2A-GFP配列の上流にC末端フラグ-HAタグを、内因性遺伝子配列に対してすべて逆方向に設計する。<ol>
<li>カセットをスプライスアクセプターと、不一葉のloxPサイト(lox66およびlox71)18の間にネストされたポリアデニル化配列で側面にする。</li>
		<li>両端から少なくとも500 bpの相同兵器を含める。ドナーテンプレートをgBlocks遺伝子断片の2つのセグメントに分割します(gBlock-1、gBlock-2-WT「https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI」およびgBlock-2-ケージ変異体「https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM」を参照)製造元の指示に従ってギブソンのクローンを使用する PCR ブラント ベクトル。 注:gblock-2は、H3K27me312との相互作用に重要なEEDのケージ内に芳香族残基(Y365)を含んでいます。gBlock-2-Wtには野生型残渣が含まれていますが、gblock-2-ケージ変異体にはEED(Y365A)のケージ変異体が含まれており、H3K27me3に結合することができません。誘導性WT EED救助はi-WT-rとして示され、誘導可能なケージ変異体EED救助は便宜上i-MT-rとして示される。</li>
	</ol>
</li>
	<li>6ウェルプレート形式では、トランスフェクション試薬を用いてgRNA(EED-gRNA誘導性)およびドナーテンプレートの1mg(i-WT-rまたはi-MT-r)を1mgのトランスフェクト2 x 105 MESCをトランスフェクトし、FACSを用いてGFP陽性細胞を単離する。</li>
	<li>手順 2.3-2.11 に従って、ターゲティングを成功させるためにジェノタイピングの準備ができている個々のコロニーを分離します。</li>
	<li>挿入されたカセットにまたがるジェノタイピングプライマー誘導可能_遺伝子型FW-1および誘導可能なジェノタイプ-REV-1を使用し、Taq DNAポリメラーゼを使用してジェノタイピングPCRを実行します。 注: CRISPR のターゲティング効率は約 10% です。<ol>
<li>相同アームの外側にある誘導可能な_遺伝子型-FW-2および誘導可能な_ジェノタイプ-REV-2プライマーを使用して、PCR によるカセットの正しい統合を確認します。 注:カセットのホモ接性統合は、EEDの効率的な救助を達成するために必要です。ホモ接合体を有する細胞は、WT EEDと比較して単一の大きなDNA産物を産生し、短い製品を生成することに注意してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>サンガーシーケンシングによるカセットの統合を確認します。</li>
	<li>カセットの反転とEEDおよびその他のPRC2コアコンポーネント(例えば、EZH2およびSUZ12)の発現を、ウェスタンブロッティングによる4-OHT投与時に確認する。</li>
	<li>T2A-GFPの発現とフローサイトメトリーによるフリップの割合を確認する。なお、GFPの発現はカセットの反転とEEDの発現を示す。</li>
</ol>4. クロマチンに対する中国の核化と拡散に続く
<ol><li>i-WT-r および i-MT-r MESC がフローサイトメトリーによる GFP の漏れやすい発現を持たないことを確認します。GFPの漏れ発現の場合、実験を開始する前にFACSによりGFP陰性細胞を単離する。</li>
	<li>i-WT-r および i-MT-r MESC を 5 つの 15 cm プレート (プレートあたり 5x 106セル) に展開します。</li>
	<li>0.5mM 4-OHTを0h、12h、24h、36hおよび8日間(条件当たり15cmプレート)の投与によりWTまたはケージ変異EEDの発現を誘導する。12時間を超える治療のために12時間後に培方を変更し、GFPを用いてFACSによって正常に再結合された細胞を分離する。すべての条件が一度に収集されるような治療の時間を調整します。</li>
	<li>H3K27me2,H3K27me3のChIP-seqを実行し、WTまたはケージ変異EEDの再発現に応答してクロマチンへの経時的沈着を調べる。Oksuz et al., 201715.</li>
	<li>各サンプルでスパイクインコントロールを使用して、異なるタイムポイント19間の定量的な比較を可能にします。<ol>
<li>スパイクインコントロールでは、ショウジョウバエメラノガスター(mESC由来クロマチンに対する1:50比)およびショウジョウバエ特異的H2Av抗体(ドロソフィラクロマチンの4μg当たりH2Av抗体の1μL)を使用します。各サンプルの製造元の指示)。</li>
		<li>Oksuz et al., 201715. </li>
	</ol>
</li>
	<li>デフォルトパラメータ20を使用して、Bowtie 2を使用してChIP-seqの読み取りシーケンスをmm10ゲノムにマッピングします。</li>
	<li>ChIP-seqが読み込みしたマウスを正規化して、ショウジョウバエの読み取りカウントを21にする。次の式を使用してスパイクイン正規化係数を計算します: 1 x 106/ユニークなショウジョウバエ読み取りカウント。1 x 106ショウジョウバエ読み取りカウントと 20 x 106マウス読み取り回数を実験ごとに取得することを期待します。<ol>
<li>入力サンプルをシーケンシングする際には、ショウジョウバエクロマチンを含めません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ベッドツールからゲノムコフツールを使用して、bamファイルをベッドグラフ22に変換します。次に、USCS23、24からbedGraphToBigWigツールを使用して、ベッドグラフを bigwig ファイルに変換します。次のスクリプトを参照してください。 gen=「mm10ゲノムへの道」 chr=「mm10染色体サイズへの道」 inp_bam="入力バムファイルへのパス" 乗算=「スパイクイン正規化係数を計算する」 ベッドツールゲノムコフ -bg -スケール $multiply -ibam $inp_bam -g $gen > output.bedGraph 並べ替え -k1,1 -k2,2n 出力.bedGraph > 出力ソート.bedGraph bedGraphToBigWig出力_ソート.bedGraph $chroutput.bw
</li>
	<li>USCSゲノムブラウザ24にビッグウィッグファイルをアップロードすることにより、ChIP-seq読み取り密度を視覚化します。</li>
</ol>5. MESC核におけるH3K27me3病巣の出現と増殖のモニタリング
<ol><li>プレート1x 104 mESCを8ウェルチャンバースライドに0.1%ゼラチンであらかじめコーティング。</li>
	<li>翌日、示された時点(0時間、12時間、24時間および36時間)に対してEEDを発現する細胞を集集めるために連続した4-OHT(0.5mM)誘導を行い始める。12時間より長い治療のために12時間後にメディアを変更します。</li>
	<li>室温(RT)でリン酸緩衝生理食べ物(PBS)に4%のパラホルムアルデヒドを4%のパラホルムアルデヒドで10分間固定します。</li>
	<li>PBS/0.25% トリトンX-100で細胞を透過化し、RTで30分間使用します。</li>
	<li>PBS/5%ロバ血清/0.1%トリトンX-100(ブロッキングバッファー)で30分間RTで細胞をブロックします。</li>
	<li>ブロッキングバッファー中のH3K27me3一次抗体1:500を希釈し、細胞に添加する。</li>
	<li>一次抗体で細胞を一晩4°Cでインキュベートします。</li>
	<li>翌日、PBS/0.1%トリトンX-100で3つの洗い流しを行います。</li>
	<li>希釈二次抗体(Alexa fluor 595)1:1000をブロッキングバッファーに含め、細胞に添加する。<ol>
<li>Alexa Fluorと共役した二次抗体は光に敏感であるため、次のステップで暗闇の中ですべてのインキュベーションを実行します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>RTで2時間二次抗体をインキュベートする。</li>
	<li>PBS/0.1%トリトンX-100で3つの洗い流しを行います。</li>
	<li>希釈 DAPI (1 mg/mL) 1:4000 PBS/0.1% トリトン X-100 と細胞に追加します。</li>
	<li>RTで10分間DAPIで細胞をインキュベートします。</li>
	<li>アクアマウントでセルをマウントします。</li>
	<li>63倍の倍率で共焦点顕微鏡で細胞を画像化します。</li>
	<li>ImageJ、フィジー25の分布を使用して画像を処理し、擬似色を付けます。</li>
</ol>

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</ol>

D.R.は、コンステレーション医薬品とフルクラム治療薬の共同創設者です。著者は、彼らが競合する利益を持っていないと宣言します。

特定のクロマチンドメインの形成中に機械的な詳細を理解するための強力なアプローチは、最初にドメインを破壊し、細胞内で進行中のその再構成を追跡することです。プロセスは、再構築中にいつでも一時停止して、進行中のイベントを詳細に分析できます。クロマチンドメインに関する以前の研究では、このような事象を解決することはできず、安定した状態下で行われました(例えば、野生型と遺伝子ノックアウトを比較する)。ここでは、細胞内のPRC2媒介性抑圧ドメインの募集と広がりによって強調されているように、クロマチンドメインの動的形成を評価するシステムを概説する。
この誘導可能なシステムの最も重要なステップは、細胞からのそれぞれの欠失後に所望のタンパク質(またはRNA)を再発現するDNA構築物の正確な設計です。下流のアプリケーションに応じて、これらの構造内に様々な変異、タグ、蛍光マーカーが導入される可能性があります。例えば、GFPの直前に自己切断T2Aペプチドを使用して目的のタンパク質から切り離す代わりに、高解像度イメージングおよび/または単粒子追跡実験のために様々な蛍光融合タンパク質を生成することができ、生細胞...

真核生物ゲノムは高度に組織化されており、クロマチンアクセシビリティの変化は遺伝子転写1を直接制御する。ゲノムには、転写活性および複製タイミング2、3と相関する異なるタイプのクロマチンドメインが含まれている。これらのクロマチンドメインのサイズは数キロベース(kb)から100kb以上の範囲であり、異なるヒストン修飾4の濃縮によって特徴付けられます。中心的な問題は、これらのドメインがどのように形成され、どのように伝播されるかということです。
最もよく特徴付けられたクロマチンドメインの1つは、ポリコム抑圧複合体2(PRC2)の活性を通じて促進される。PRC2は、タンパク質5、6のポリコムグループ(PcG)のサブセットで構成されるマルチサブユニット複合体であり、ヒストンH3(H3K27me1/me2/me3)7、8、リジン27のモノ、ディ、トリメチル化を触媒する。 9,10.H3K27me2/me3は抑圧的なクロマチン状態に関連しているが、H3K27me1の機能は不明6,11である。PRC2のコアコンポーネントの1つである胚性エクトダーム開発(EED)は、その芳香族ケージを介してPRC2触媒、H3K27me3の最終産物に結合し、この特徴はPRC212、13のアロステリック刺激をもたらす。PRC2酵素活性は、特定の系統に対して禁忌である特定の発達遺伝子の不適切な発現が有害であるとして、発達中に細胞同一性を維持するために重要である5,6.したがって、中国が哺乳類における抑圧的なクロマチンドメインの形成を促進するメカニズムを解明することは、細胞同一性を理解する上で根本的に重要である。
PRC2媒介クロマチンドメインを含むクロマチンドメイン形成を調査するように設計された過去の実験システムのすべては、クロマチンドメイン形成の展開イベントを追跡することができない定常状態条件下で行われた。細胞。ここでは、クロマチンドメインの初期募集と伝播を監視する誘導性細胞系を生成するための詳細なプロトコルを提示する。具体的には、H3K27me2/3を含むPRC2媒介性抑圧クロマチンドメインの形成を追跡することに焦点を当てる。クロマチンドメイン形成の機械的詳細を捕捉できるこのシステムは、H2AK119ubまたはH3K9meのいずれかを含む広く研究されたドメインのような他のクロマチンドメインを組み込むことに適合させることができる。ゲノミクスやイメージング技術と組み合わせることで、クロマチン生物学における様々な重要な問題にうまく対処する可能性があります。

<table><tbody><tr><td>(Z)-4-ヒドロキシタモキシフェン (5 mg)</td><td>シグマ</td><td>H7904-5MG</td><td>EED 発現の誘導用</td></tr><tr><td>16% パラホルムアルデヒド水溶液 (10x10 ml)</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15710</td><td>免疫蛍光法</td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>LifeTechnologies</td><td>21985-023</td><td>mESCs 培養</td></tr><tr><td>用 2% ゼラチン溶液</td><td>Σ</td><td>G1393-100ml</td><td>mESC用培養</td></tr><tr><td>Accutase 500 ML</td><td>の革新的な細胞技術/FISHER</td><td>AT 104-500</td><td>mESCsの文化</td></tr><tr><td>のための Alexa Fluor 594 AffiniPureのロバの反ウサギIgG (H+L)</td><td>ジャクソンのimmunoresaerch</td><td>711-585-152</td><td>免疫蛍光</td></tr>性の<tr><td>アクアマウントの封入媒体</td><td>FISHER/VWR</td><td>41799-008</td><td>免疫蛍光</td></tr><tr><td>性のための CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK</td><td>Fisher Sci</td><td>177445PK</td><td>免疫蛍光</td></tr><tr><td>用 DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩) - 10 mg</td><td>Life Tech</td><td>D1306</td><td>免疫蛍光</td></tr><tr><td>ERK阻害剤、PD0325901</td><td>Stemgent</td><td>04-0006</td><td>mESCs培養用</td></tr><tr><td>ESGRO組換えマウスLIFタンパク質</td><td>ミリポア/フィッシャー</td><td>ESG1107</td><td>mESCs培養用</td></tr><tr><td>FBS幹細胞認定</td><td>Atlanta</td><td>S10250</td><td>mESCs培養用</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611L</td><td>ドナーテンプレートクローニング</td></tr><tr><td>用 GSK3阻害剤, CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004</td><td>mESCs培養</td></tr><tr><td>用 H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB</td><td>Cell Signaling</td><td>9728S</td><td>Antibody for ChIP-seq</td></tr><tr><td>H3K27me3</td><td>Cell Signaling</td><td>9733S</td><td>Antibody for ChIP-seq</td></tr><tr><td>Histone H2Av抗体 (pAb)</td><td>活性モチーフ</td><td>39715</td><td>Spike-in control for ChIP-seq</td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829-018</td><td>For mESCs culture</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>For mESCs culture</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>LifeTech</td><td>11668019</td><td>For transfection</td></tr><tr><td>MangoTaq DNA Polymerase</td><td>Bioline</td><td>BIO-21079</td><td>For Genotyping PCR</td></tr><tr><td>正常なロバの血清 (10 mL)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>免疫蛍光法</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Sigma/Roche</td><td>P0781</td><td>mESCs培養</td></tr><tr><td>用 pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)</td><td>Addgene</td><td>48138</td><td>gRNAクローニング用</td></tr><tr><td>QuickExtract DNA抽出液</td><td>Lucigen</td><td>QE0905T PCR</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100用</td><td>Sigma</td><td>T8787-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Zero Blunt PCR Cloning Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>K270020</td><td>For Donor template cloning</td></tr><tr><td>Primers/gBlocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EED-KO-gRNA-1</td><td></td><td></td><td>Sequence: ctctggctactgtcaactag. i-WT-r および i-MT-r システム用の C57BL/6 ESCs では、gRNA は EED をノックアウトします。</td></tr><tr><td>EED-KO-gRNA-2</td><td></td><td></td><td>配列: i-WT-r および i-MT-r システム用の C57BL/6 ESC では、gRNA がペアになって EED をノックアウトします。</td></tr><tr><td>EED-gRNA誘導性</td><td></td><td></td><td>配列:atggcaccccgaaattagaa. gRNAとドナーは、EED-KOバックグラウンドでi-WT-rシステムを生成します。</td></tr><tr><td>i-WT-r ドナー</td><td></td><td></td><td>https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA とドナーは、EED-KO バックグラウンドで i-WT-r システムを生成します。</td></tr><tr><td>EED-gRNA誘導性</td><td></td><td></td><td>配列:atggcaccccgaaattagaa. gRNAとドナーは、EED-KOバックグラウンドでi-WT-rシステムを生成します。</td></tr><tr><td>i-MT-r ドナー</td><td></td><td></td><td>https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA とドナーは、EED-KO バックグラウンドで i-MT-r システムを生成します。</td></tr><tr><td>Genotyping Primers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gnt-EED-KO-FW-1</td><td></td><td></td><td>配列: ctgtaggctgccatgtga.野生型対立遺伝子は1.9kbの産物を産生します。ノックアウト対立遺伝子は200bpの生成物を生成します。</td></tr><tr><td>Gnt-EED-KO-REV-1</td><td></td><td></td><td>配列: agccagggctacacagagaa.野生型対立遺伝子は1.9kbの産物を産生します。ノックアウト対立遺伝子は200bpの生成物を生成します。</td></tr><tr><td>Inducible_Genotype-FW-1</td><td></td><td></td><td>シーケンス:tgcagtgaaacaaatttggaa。カセットを挿入すると、プライマーは1863 bpを生成します。野生型の対立遺伝子は、~200 bp の生成物を生成します。</td></tr><tr><td>Inducible_Genotype-REV-1</td><td></td><td></td><td>シーケンス:gagaggggtggcactgtaaa。カセットを挿入すると、プライマーは1863 bpを生成します。野生型の対立遺伝子は、~200 bp の生成物を生成します。</td></tr><tr><td>Inducible_Genotype-FW-2</td><td></td><td></td><td>シーケンス:ccccctctttctccttttct。カセットが挿入されると、プライマーは3200 bpを生成します。野生型対立遺伝子は1560 bpの生成物を生成します。</td></tr><tr><td>Inducible_Genotype-REV-2</td><td></td><td></td><td>配列: atgcctgggtgaatgaaaaa.カセットが挿入されると、プライマーは3200 bpを生成します。野生型対立遺伝子は1560 bpの生成物を生成します。</td></tr></tbody></table>

クロマチンドメインのノボ形成を研究する方法

A Method to Study de novo Formation of Chromatin Domains

クロマチンドメインの組織および構造は、個々の細胞系統に固有である。彼らの誤った規制は、細胞同一性および/または病気の損失につながる可能性があります。多大な努力にもかかわらず、クロマチンドメインの形成と伝播に関する我々の理解は依然として限られている。クロマチンドメインは、確立中の最初の事象に従うことを助長しない定常状態条件下で研究されている。ここでは、クロマチンドメインを誘導的に再構築し、時間の関数として再形成する方法を提示する。しかし、最初にPRC2媒介性抑圧クロマチンドメイン形成の場合に適用されるが、それは容易に他のクロマチンドメインに適応することができる。この方法をゲノミクスおよびイメージング技術と組み合わせることで、クロマチンドメインの確立を詳細に研究する貴重なツールが提供されます。この方法は、クロマチンドメインがどのように形成され、相互作用するかについての我々の理解に革命をもたらすと信じています。

条件付き救助システムの一般的なスキーム 図1は、内因性EED遺伝子座から発現されるWTまたはケージ変異体(Y365A)EEDを用いたEED KO細胞を条件付きで救出するターゲティングスキームを示す。その安定性と酵素活性に不可欠なPRC2のコアサブユニットであるEEDをノックアウトした後、EEDのエキソン9に続くイントロン内のカセットが導入される(図1)。カセットは、EEDの残りの3'cDNA配列から構成され、内因性遺伝子配列に対して逆方向である。 カセットは、奇数逆loxPサイト(lox66およびlox71)18によって側面付けされています。細胞は、H3K27me2/3の完全な損失が観察されるまで伝播される。4-OHTを添加してCre組換え発現を活性化すると、カセットは、スプライスアクセプタ配列を用いてエキソン9がカセットにスプライスされるように反転される(図1)。このシス...

この方法は、細胞株におけるPRC2媒介クロマチンドメインの形成に従うように設計されており、この方法は他の多くのシステムに適応することができる。

The organization and structure of chromatin domains are unique to individual cell lineages. Their misregulation might lead to a loss in cellular identity ...

我々は、クロマチンドメインの動的形成を評価するシステムの概要を示す。このシステムを利用して、細胞内でのPRC2媒介クロマチンドメインの採用と普及に追随します。プロセスは、進行中のイベントを分析するためにいつでも一時停止できます。このシステムは、任意の細胞プロセスの動的変化を監視するために必要とすることができ、したがってクロマチンドメイン形成を追跡することに限定されません。CRISPRデザインツールを使用してマウス胚性幹細胞における胚外胚発生(EED)の内因性コピーのエキソン10と11を削除するガイドRNAを設計することから始めます。原稿の指示に従って、ガイドRNAをCRISPR/Cas9プラスミドにクローンします。6ウェルプレート形式では、トランスフェクト200,000マウス胚性幹細胞、またはmESCを、メーカーの指示に従ってトランスフェクション試薬を使用して各ガイドRNAのマイクログラムを1マイクログラムずつ使用します。トランスフェクションの24時間後にメディアを交換します。トランスフェクションの2日後、FACSを用いてGFP陽性細胞を単離する。トランスフェクション効率は約10~30%の範囲で、500,000個の細胞を選別して、めっきに十分なGFP陽性細胞を捕捉します。単離されたGFP陽性細胞を、コロニー摘みのために0.1%ゼラチンで事前にコーティングされた15センチメートルプレートにプレートします。ESC培地中の細胞を、単一のコロニーが見えるまで約1週間増殖させ、2日ごとに培地を変更するようにします。20マイクロリットルのピペットチップを使用して、20マイクロリットルのピペットチップを使用して、少なくとも48個のコロニーを選び、吸引しながらコロニーを削ります。コロニーを単一細胞に分解することなく、アキュターゼ含有96ウェルプレートに移します。細胞を解約するために10分間摂氏37度でコロニーをインキュベートします。その後、200マイクロリットルのESCメディアをマルチチャンネルピペットで各井戸に加えます。よく混ぜて、2つの別々の96ウェルプレートに細胞をプレートします。ジェノタイピング用のプレートの一方を使用し、ジェノタイピングが終了するまでもう一方を成長させ続けます。市販の試薬を使用して、製造業者の指示に従ってプレートからDNAを抽出します。Taq DNAポリメラーゼを用いて遺伝子型化 PCR を実行するために、削除された部位にまたがるジェノタイピングプライマーを使用します。野生型細胞に対してホモ接合欠失を有する細胞内の低分子量のDNA産物を観察する。CRISPRデザインツールを使用してEEDのエキソン9に続くイントロン内の切り傷を導入し、原稿の指示に従ってCRISPR/Cas9プラスミドにクローン化する設計ガイドRNA。エキソン9後のEED cDNA配列とT2A-GFP配列の上流のC末端Flag-HAタグを含むドナーテンプレートDNAを、内因性遺伝子配列に対して逆向きに設計します。異種反転loxPサイトの間にネストされたスプライスアクセプターとポリアデニエーションシーケンスでカセットを横切り、両端から少なくとも500塩基体の腕を含む。ドナーテンプレートをgBlocks遺伝子断片の2つのセグメントに分割し、メーカーの指示に従ってギブソンクローニングを使用してPCR Bluntベクターに組み立てます。6ウェルプレート形式では、トランスフェクト200,000 mESCsは、ガイドRNAの1マイクログラムとドナーテンプレートの1マイクログラムを備えています。次にFACSを用いてGFP陽性細胞を単離する。原稿の方向に従ってジェノタイピングのための個々のコロニーを分離します。フローサイトメトリーを使用して、mESCがGFPの漏れ発現を持たないことを確認し、もしそうであれば、実験を開始する前にFACSによってGFP陰性細胞を単離する。細胞を5つの15センチメートルプレートに拡大し、5マイクロモル4-ヒドロキシタモキシフェンをゼロ時間から8日間の5つの時間の期間に投与することによって野生型またはケージ変異体EEDの発現を誘導する。それよりも長く続く治療のために12時間後にメディアを変更します。GFPを用いてFACSによって正常に再結合された細胞を単離し、H3K27me2およびH3K27me3に対してChIP-seqを行い、野生型またはケージ変異体EEDの再発現に応答してクロマチンへの時間的沈着を調査する。誘導可能な野生型の救助および誘導可能な突然変異体救助システムを検証するために、ウェスタンブロットは、4-ヒドロキシタモキシフェン処理を用いて野生型またはケージ変異体EEDの誘導後に抽出物全体に対して行われた。フローサイトメトリー分析は、4-ヒドロキシタモキシフェン処理前後のi-WT-r細胞におけるT2A-GFP発現の効率を確認するために使用され、反転カセットの反転が成功したことを示す。H3K27me3のChIP-seqは、野生型またはケージ変異体EEDの再発現後に行った。H3K27me3の出現は、離散核形成部位で野生型EED発現後12時間、そして初期核形成部位から離れた領域で24時間で観察される。ChIP-seqはH3K27me3沈着の前に見えるH3K27me2の経時的な沈着を追跡するためにも使用されました。H3K27me3病巣およびそれらの成長はまた蛍光顕微鏡で視覚化された。野生型EED発現の12時間後、H3K27me3病巣形成の証拠がある。これらの病巣は数とサイズが24時間増加し、最終的には核の大きな領域に36時間広がった。DNA構築物の正確な設計は、望ましい誘導可能な救助システムを生成するために非常に重要です。この方法は、マウスにおけるタンパク質の変異を時間的かつ特別に制御することができる。このようにして、特定の組織または特定の発達段階における突然変異の影響を決定することができる。我々は現在、別のクロマチンドメイン、ポリコム抑制複合体1の動的確立を監視するためにこのシステムを使用しています。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

クロマチン剪断法:酵素消化法を用いてクロマチンフラグメントを生成する方法

生体内でゲノムにどのような影響を与えるかクロマチン制御因子とクロマチンの状態の問題は、細胞運命決定が発生中の胚になっている様子を、早期の我々の理解の鍵である。 ChIPの-SEQ-グローバルレベル-さアフリカツメガエル胚のためにここで概説でクロマチンの機能を調査するための最も一般的なアプローチ。...

クロマチンレギュレータと米国でのゲノムワイドスナップショット<em&gt;アフリカツメガエル</emChIPの-配列によって&gt;胚

クロマチン結合タンパク質のシーケンシャル塩抽出は大きい蛋白質の複合体の結合特性を決定するための便利なツールです。このメソッドは、個々...

クロマチン複合体を変更するのプロパティをバインド一括クロマチンの分析の逐次塩抽出

提案するミクロコッカスヌクレアーゼ (MNase) のアクセシビリティを統合ヌクレオソーム密度チップ seq 解析フレームワークに適したシーケンス データセットの生成 (チップ seq) 方法論をシーケンス変更されたネイティブ...

ネイティブのクロマチン免疫沈降のヌクレオソーム密度解析ライブラリをシーケンスの生成

核内構造の可塑性は、非コード Rna、DNA メチル化、ヌクレオソーム再配置と同様ヒストン組成および変更を含む動的なエピジェネティックな機構によって制御されます。ここで再現可能な安価で、簡単な方法でクロマチン接近性の定量を可能にする Formaldehyde-Assisted の分離の規制要素 (放任)...

哺乳類細胞におけるメジャー クロマチン アクセシビリティ規制要素のホルムアルデヒドによる分離

このプロトコルは、スナップ凍結組織からのクロマチン調製に焦点を当てており、架橋クロマチン免疫沈降(X-ChIP)とそれに続く定量的PCR分析(X-ChIP-qPCR)または次世代シーケンシングアプローチ(X-ChIP-seq)のいずれかに適しています。...

クロマチン免疫沈降分析のための凍結キメラ肝臓組織からのクロマチン抽出

このプロトコルは、事前埋め込みEdU-ストレプトアビジン-ナノゴールド標識とChromEMTの組み合わせを採用した、構造的に保存されたクロマチンin in situにおける...

電子断層撮影による超構造保存クロマチン中の複製ドメインのイメージング

このプロトコルは、トポロジー的会合ドメイン(TAD)の境界や、調節と他のDNA配列要素との間の長距離クロマチン相互作用など、メガベースサイズの標的ゲノム領域の3D組織を高解像度で特徴付けるために使用されるCapture Hi-C法について説明しています。...

キャプチャHi-C による 高分解能3Dクロマチン構成の解読

ここでは、染色体立体構造捕捉(3C)技術の適応を、学部生の関与と学習に重点を置いて詳細に紹介します。...

3CでAを取得する:学部生のための染色体コンフォメーションキャプチャ

私たちは、ユークロマチン、ヘテロクロマチン、RNAP...

高密度核環境下のクロマチン調査のための多ラベル単分子局在顕微鏡プロトコル

学ぼう PRC2媒介クロマチンドメインの動的な形成と拡散をマウス胚性幹細胞でリアルタイムに追跡する方法。このシステムは一時停止して詳細解析が可能で、様々な細胞過程の研究に応用できます。

クロマチンドメインのノボ形成を研究する方法

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