Name: 免疫細胞刺激のためのヒトS100A12とそのイオン誘発オリゴマーの精製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: 学ぶヒトS100A12タンパク質とイオン誘発オリゴマーの精製法。サイズ排除クロマトグラフィーと化学架橋を用いて高純度・無エンドトキシンタンパク質を調製し、単球刺激アッセイへの応用を可能にする。

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この研究は、ミュンスター大学医学部(KE121201からC.K.)とドイツ研究財団(DFG、Fo354/3-1からD.F.)の内壁内革新的な医学研究プログラムからの助成金によって支援されました。

注:バッファーおよびストックソリューションの準備については、補足表1を参照してください。
1.大腸菌におけるタンパク質発現
<ol><li>
クローニング
	<ol>
<li>クローンタグフリーヒトS100A12(NCBI基準配列:NP_005612.1)を細菌発現ベクターpET11bに分けます。タンパク質を発現させるには、大腸菌BL21(DE3)に分解物を変換する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
文化
	<ol>
<li>14 mLの丸底チューブに成長培地(LBブロス100μg/mLアンピシリン)を5mLで接種してスターター培養を調製する。220 rpmで振りながら37°Cで一晩インキュベートします。2Lエルレンマイヤーフラスコで成長培地の400mLに一晩培養の2−4 mLを移し、220rpmで振盪して37°Cで培養する。 注:主培養の初期密度は、600 nm (OD600)= 0.1 の光学密度でなければなりません。</li>
		<li>成長中にOD600を監視します。1 Mイソプロピル-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)をOD600= 0.5−0.6で1mMの最終濃度に添加してタンパク質発現を誘導する。37 °C および 220 rpm で 4 時間を追加でインキュベートします。 注:一般に、0.6 の OD600は、37 °C で 1.5~2.5 h の後に到達します。</li>
		<li>脱イオン水の40mLで50mMトリス、50mM NaClおよび1mMエチレンディアミンテトラ酢酸(EDTA)を溶解することにより、50 mLの超音波処理バッファーを調圧します。HClでpHを8.0に調整し、最大50 mLにします。プロテアーゼ阻害剤(50 mL溶液当たり1錠)を追加し、バッファを4°Cに平衡化します。</li>
		<li>細菌培養を適切な遠心ボトルに移し、3,200 x gで30分間30分間細胞を収穫します。上清を廃棄し、25 mLの氷冷超音波処理バッファーでペレットを再懸濁します。これからは細胞を氷の上に置いておく。 注:再懸濁細胞は、短期的には-20°C、長期は-80°Cで保存できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
超音波処理/リシス
	<ol>
<li>氷の上で30sの6サイクルのために細胞を超音波処理します。各サイクルの後、細胞を30−60秒の休止し、細胞が過熱するのを防ぐ。</li>
		<li>セルサスペンションを予め冷やされた50 mLの高速遠心分離管と遠心分離機に15,000 x gの固定角度ローターに移し、4°Cで30分間使用します。可溶性サイトソリックタンパク質を含むクリアされた溶解物を新鮮な50 mLチューブにデカントし、ペレットを廃棄します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. タンパク質精製
<ol><li>アニオン交換クロマトグラフィー
	<ol>
<li>透析<ol>
<li>20mMトリス、1mM EDTAおよび1mMエチレングリコールビス(2-アミノエチルトラー)-N、N'、N'、N'-テトラセチン酸(EGTA)を脱イオン水中に溶解することにより、イオン交換クロマトグラフィー(AIEX)バッファーAを調製し、pHを8.5Hに調整する。透析用は2x5L、クロマトグラフィー用はAIEXバッファAの2x1 Lを調出します。 注:透析液量は、サンプル体積の約100倍である必要があります。クロマトグラフィーに使用されるすべてのバッファーは、濾過(0.45 μm以下)および脱気(例えば、超音波浴または真空脱気によって)にする必要があります。</li>
			<li>透析チューブ(分子量カットオフ[MWCO]:3.5 kDa)を適切な長さにカットし、回転撹拌バーの上のサンプル浮力を確保するために空気のための追加のスペースを持つ。 注:グリセロールは、膜を保持し、使用する前に除去する必要があります。.</li>
			<li>ステップ1.3.2からクリアされたタンパク質溶液の粘度を低下させるために、AIEXバッファーAの25 mLで溶液を希釈し、クロマトグラフィーカラムへの後続の適用を容易にする。最初の閉鎖をチューブに取り付け、サンプルを膜にロードし、チューブの上端から少なくとも1cmの第2の閉鎖を取り付けます。</li>
			<li>AIEXバッファーAを入れた5L容器を攪拌板に置き、攪拌棒とタンパク質溶液で満たされた膜を加える。回転撹拌バーとの干渉を避けて、サンプルを回転させる速度を調整します。4°Cで12−24hの透析を行い、次いで透析液バッファー(AIEXバッファA)を新鮮な予冷製調物に置き換え、少なくとも4時間は継続します。透析タンパク質溶液を50 mLチューブに移し、0.45 μmフィルターユニットを通してフィルターを通します。 注:可能なストレージ。</li>
		</ol>
</li>
		<li>クロマトグラフィー</li>
		<li>液体クロマトグラフィーシステム(FPLC)を一般メンテナンスで起動し、カラムバッファAIEX AとAIEX B(AIEXバッファA、1M NaCl)、およびイオン交換樹脂を含むカラムを接続します。一般的なクロマトグラフィーパラメータについては、表1を参照してください。 注: バッファー、カラム、および FPLC 装置は、実行を開始する前に同じ温度に平衡化する必要があります (表 1、表 2、表 3、表 4、および表 5のクロマトグラフィー パラメータを参照)。</li>
		<li>AIEXバッファーAでカラムを平衡化し、その後、サンプルをカラムにロードし、0%から100%の高塩バッファー(AIEX B)に線形勾配でタンパク質を溶出させます。詳細な方法プロトコルについては、表 2を参照してください。</li>
		<li>溶出中に2mL分画を収集し、クーマッシー染色された15%のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)で各画分の10μLを分析します。透析用のS100A12タンパク質を含む分数をプールします。 注:S100A12の分子量は10,575 Daである。</li>
	</ol></li>
	<li>カルシウム依存性疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)
	<ol>
<li>透析<ol>
<li>20 mMトリス、140 mM NaCl、pH 7.5に対してタンパク質溶液を透析し、セクション2.1.1に記載の手順に従います。</li>
		</ol>
</li>
		<li>クロマトグラフィー<ol>
<li>脱イオン水中に20mMトリス、140mM NaClおよび25 mM CaCl2を溶解することにより、クロマトグラフィーバッファーHIC Aの1Lを調作し、pHを7.5に調整します。HICバッファBの場合、20 mMトリス、140 mM NaClおよび50 mM EDTAを溶解します。pH を 7.0 に調整し、バッファをフィルタリングして脱気します。25 mMの最終濃度にCaCl2を加え、0.45 μmを通して濾過し、HICバッファーを平衡化し、サンプルを4°C(カラム温度)にします。</li>
			<li>液体クロマトグラフィーシステムを一般的なメンテナンスで起動し、カラムバッファHIC AとBとカラムを接続します。さらなるクロマトグラフィーパラメータについては、表3を参照してください。</li>
			<li>カラムを平衡化し、サンプルをロードし、UV信号が再びベースラインレベルに達するまで「バインドされていないサンプルを洗浄」ブロックを拡張します。次に、緩衝液(EDTA)を含むカルシウムキレート器で溶出を開始する。詳細な方法プロトコルについては、表 4を参照してください。 注:これまでの実験では、S100A12をクロマトグラフィー樹脂に結合させるにはカルシウムの過剰が有益であると考えられることが示されている。</li>
			<li>2 mL のピーク画分を収集し、クマシー染色された 15% SDS-PAGE 上の各画分の 10 μL を分析します。プール純粋なS100A12分画およびヘペスバッファ化生理生理に対する透析(HBS;20 mM Hepes、140 mM NaCl、pH 7.0)に対してセクション2.1.1に記載されている。 注:モノマーS100A12の消滅係数は2980 M-1 cm-1です。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. エンドトキシンの検出と除去
<ol><li>
エンドトキシンの検出
	<ol>
<li>エンドトキシン汚染を決定するには、ステップ2.2.2.4から希釈タンパク質の濃度を測定します。(例えば、HBSで1:10および1:100)酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)ベースの蛍光エンドトキシン検出アッセイ(材料表)を用いて)製造元のプロトコルに従って、このアッセイを実行します。 注:超純粋な脱イオン水に溶解した新たに調製されたHBS溶液を使用して、バッファーによる(新しい)エンドトキシン汚染を回避します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
エンドトキシンの除去とタンパク質の濃度
	<ol>
<li>サンプルの15 mLを50 kDa遠心フィルターユニットに積み込み、遠心分離機を3,200 x gおよび10°Cで約10分間、フロースルーを新鮮な容器(氷上)に移し、必要に応じて50kDaフィルターチューブを補充し、遠心分離します。フィルター膜をHBSで2回洗浄し、各工程の後にできるだけ多くのタンパク質を回収します。</li>
		<li>S100A12含有フロースルーは、3 kDa 遠心フィルターを使用して、体積が初期荷積量の 5 分の 1 に減少するまで(遠心分離は 3,200 x g、10 °C で約 30 分間)まで縮小します。必要に応じてフィルターを補充し、膜をすすいで、各補充後に濃縮溶液を新しいチューブに移します。フロースルーを破棄します。前述のように50 kDaを通して再度フィルタリングします。 注:この手順の間、タンパク質の損失は顕著である(最大50%)が、残りのタンパク質製剤はLPSから完全に枯渇する。この方法は、400 mL培養から約10−15mgのタンパク質を得る。</li>
		<li>エンドトキシンフリーHBSでタンパク質溶液を1mg/mLに調整し、ステップ3.1.1に記載されているLPS含有量を測定します。タンパク質溶液がまだLPSフリー(<0.1 EU/mL)としてテストされていない場合は、エンドトキシン除去樹脂を使用して残留汚染を排除します。 注:タンパク質濃度が 1 mg/mL の場合、0.1 EU/mL LPS の汚染は約 0.01 pg LPS/μg タンパク質に相当します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 化学架橋とオリゴマー分離
<ol><li>
化学架橋
	<ol>
<li>超純脱イオン水中(材料の表)で1M CaCl2および100 mM ZnCl2の非常に純粋な(エンドトキシンフリー)ストック溶液を調製する。次の手順では、このバッファーを新しく作り上げたバッファーを使用します。</li>
		<li>精製されたエンドトキシンフリーS100A12(HBS中の濃度1mg/mL)を室温(RT)で30分間インキュベートし、ダイメリック/テトラメリック用に25 mM CaCl2、または25 mM CaCl2および1 mM ZnCl2をヘマテリック/テコメリックS100A12オリゴマー。</li>
		<li>使用直前にエンドトキシンフリー水の500μLでBS3の8mgを溶解して架リンカーを調製する(10mLイオンスパイクタンパク質溶液に対する8mgの架リンカーは、1.4mMの最終濃度に等しい)。ピペッティングによる架け出しとサンプルを混合し、RTでさらに30分間インキュベートし、1 Mトリス-HCl、pH 7.5を50mMの最終濃度に加え、0.45 μmを通して濾過して反応をクエンチします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
サイズ除外クロマトグラフィー
	<ol>
<li>架橋されたサンプルを12~15°C(カラム温度)に平衡化し、液体クロマトグラフィーシステムを一般的なメンテナンスで開始します。列バッファ(HBS)とサイズ除外列を接続します。詳細については、表 5を参照してください。</li>
		<li>HBSでカラムを平衡化し、サンプルをロードし、実行中にピーク画分(1−2 mL)を収集します。4−20%の勾配SDS-PAGEでこれらの画分を分析し、所望のタンパク質複合体の主要なバンドを持つプール画分を分析します。 注:水溶液中のBS3のようなNHSエステル試薬の加水分解は、280nmで強い吸光度をもたらします。非結合架本体(分子量:572g/mol)は、実行の終わりに溶出し、強いピークをもたらします。</li>
		<li>10 kDa(ダイマー)、30 kDa(テトラマー)または50 kDa(ヘキサ)のMWcOsを使用して遠心フィルタユニットを使用して、ソリューションを集中させます。セクション 3.1 で説明されているように、エンドトキシン汚染を確認します。必要に応じて、製造元の勧告(材料の表)に従ってエンドトキシン除去樹脂で残りのLPSを取り除きます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 単球の機能試験
<ol><li>単球の調製
	<ol>
<li>磁気ビーズ分離キット(材料の表)を使用して、密度勾配遠心分離およびその後の単球濃縮によってヒトバフィーコートから単球を分離します。 注:このプロトコルは、純度83−95%で約5−7 x 107単球(1バフィーコート)になります。数は、また、細胞の応答性がドナーに強く依存するので、プロトコルは(必要な細胞数に応じて)スケールアップする必要があります。</li>
		<li>密度遠心分離の場合は、分離液(密度 = 1.077 g/mL)をRTに平衡化し、20 mLを50 mL遠心管(バフィーコートあたり2チューブ)に移します。ハンクの緩衝塩溶液(HBSS)を用いたヒトバフィーコートから、この混合物の総体積60mLと層30mLを分離媒体の上に慎重に希釈する。遠心分離機はRTで35分間550 x gで、遠心ブレーキを無効にします。</li>
		<li>遠心分離後、単核末梢血細胞(PBMC)は分離媒体の上に直接位置する。これらの細胞を新鮮な50 mL遠心チューブに移し、HBSSで最大50 mL、遠心分離機を170 x gで10分間吸引し、ピペッティングにより少量のHBSSで細胞ペレットを再ステージェントします。</li>
		<li>チューブを最大50 mLで充填し、遠心分離機を290 x gで10分間吸引し、HBSS(50 mL)で細胞を再度再中断し、遠心分離機を170 x gで10分間再度使用し、細胞を細胞を数え、細胞バッファー分離(材料の表)でそれらを再中断します(材料の表)/c9>) 5 x 107細胞/mL の濃度に。 注:HBSSの代わりに、リン酸緩衝生理食べ物(PBS)を使用して細胞を洗浄することができます。</li>
		<li>PBMCからの単球単球単離の場合は、磁気陰性細胞絶縁キットを使用し、製造元のプロトコルに従ってください。単球をカウントし、単球培地(RPMI 1640、15%熱不活性化胎児子牛血清[FCS]、4mM L-グルタミン、100 U/mLペニシリン/ストレプトマイシン)を2 x 106細胞/mLの濃度に再ステージする。</li>
		<li>単球を培養するために、コート培養皿(例えば、100mm)を疎水性、ガス透過性フィルムで、懸濁細胞に適した(材料の表)。約30分間UVライトを使用してプレートを殺菌し、これらの培養プレートに細胞を移し、37°Cと5%CO2で一晩休ませてください。 注:コーティングされた皿ごとに15−25 mLのセル懸濁液を使用してください。</li>
	</ol></li>
	<li>単球刺激
	<ol>
<li>S100A12による刺激(ワイルドタイプ) 注:未処理のS100A12(セクション2.2.2からの最終産物)を架橋タンパク質と区別するために、以下のS100A12を「ワイルドタイプ」と呼ぶ。<ol>
<li>残りの細胞を50mL遠心管と遠心分離機に350 x gで10分間移し、刺激媒体で細胞ペレットを再停止(RPMI 1640、5%熱不活性化FCS、4mM L-グルタミン、100 U/mLicペニン/ストレプトマイシン)を2 x 106細胞/mLの濃度で。</li>
			<li>刺激のために、24の井戸懸濁液板を使用し、ウェルあたり250 μLの細胞懸濁液を加える(0.5 x 106細胞/ウェル)。目的のウェルに50 μg/mLポリミキシンBを加え、次に異なる濃度(25、50、100、200 pg/mL)またはワイルドタイプS100A12(10、20、40、60 μg/mL)のいずれかのLPSを加えます。また、タンパク質を未処理または熱変性(99°C、10分)で細胞に異なる濃度で塗布する。 注:短い熱処理はS100A12タンパク質を変性させるが、LPSへの影響は少ない。</li>
			<li>37 °C および 5% CO2で 4 時間のプレートをインキュベートします。各ウェルの細胞懸濁液を1.5mL反応管に移して細胞を収穫する。500 x gで 10 分間遠心分離機を新しいチューブに移し、製造元の推奨に従ってヒト TNFα ELISA キットを使用して、異なる希釈(例えば、1:2、1:5、1:10)でTNFα放出を測定します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>S100A12オリゴマーによる刺激<ol>
<li>上述したように24ウェル懸濁液板に単球を調作し、種をまく。ステップ4.2.3からS100A12オリゴマーを添加して細胞を刺激する。異なるモル濃度(125 nM、250 nM、500 nM、1000 nM)で。 注:異なるオリゴマーの能力を比較して単球を刺激するために、オリゴマーを同等のモル濃度で細胞に適用した。</li>
			<li>37°Cおよび5%CO2で4時間インキュベートし、細胞を収穫し、上述のように上清中のTNFα放出を測定する。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

著者は何も開示していない。

このプロトコルでは、ヒトS100A12のタグフリー細菌発現およびその精製、ならびに免疫細胞刺激のための異なるイオン誘発オリゴマーへの分離について説明する。S100A12タンパク質精製8、23、24に関する文献と比較して、疎水性相互作用クロマトグラフィーにおける高CaCl2(25mM)の使用は我々の知識に特有である。1から5 mMまでの濃度を適用するいくつかのプロトコルは純粋なタンパク質を産生しますが、代わりに25 mM CaCl2を使用して我々のアプローチに続いて数倍高い収率を観察しました。これは、カラム材料とのタンパク質相互作用の階層によって説明されるかもしれません:S100A12はカラム材料に直接結合することができますが、Ca2+の過剰は、既にカラム結合タンパク質へのS100A12-ダイマーの間接的な結合を促進する可能性があります。8....

S100A12は、主にヒト顆粒球によって産生されるカルシウム結合タンパク質である。タンパク質は(全身性)炎症およびその血清レベルの間に過剰発現され、特に全身性若年性特発性関節炎(sJIA)、家族性地中海熱(FMF)または川崎病(KD)などの(自動)炎症性疾患において、疾患活動と治療への反応。トール様受容体(TCR)などのパターン認識受容体(PRR)に応じて、自然免疫系は、リポ多糖類(LPS)のような病原体関連分子パターン(AmpP)または損傷関連分子パターン(AmpP;「アラームイン」とも呼ばれます)。DamPは、細胞タンパク質、脂質または核酸1などの内因性分子である。DAMP機能は、カルグラヌリンタンパク質ファミリーのメンバー、S100A8/A9およびS100A122のメンバーについてよく記載されており、これはまた、解数金属イオンキレート系抗菌ペプチド3、4、として動作することが報告されています。5,6.利用可能なイオン強度S100A12は、S100ファミリーの他のメンバーと同様に、異なるホモマルチマーに配置し、最近までPrR相互作用、特にTLR4に対するS100A12オリゴマーライゼーションの影響は不明であった。
タンパク質の単量体形態(92アミノ酸、10.2 kDa)は、柔軟なリンカーによって接続された2つのEFハンドらせんループ-らせん構造から構成されています。C末端EFハンドは古典的なCa2+-結合モチーフを含み、N-末端EF-handはS100タンパク質特異的拡張ループ構造(「擬似EF-hand」)を示し、Ca2+-親和性の低下を明らかにする。S100A12によるCa2+結合は、タンパク質のC-終端の大きな立体構造変化を誘発し、各モノマー上の疎水性パッチの曝露を引き起こし、ダイメナライゼーション界面を形成する。したがって、生理学的条件下では、S100A12によって形成される最小の四分円構造は、個々のモノマーが反平行方向にある非共有ダイマー(約21 kDa)である。ダイマーとして配置された場合、S100A12は、Zn2+ならびに他の二価金属イオン、例えば、高い親和性7を持つCu2+を隔離すると報告される。これらのイオンは、1つのサブユニットおよびH85のアミノ酸H15およびD25、ならびに反並列他のサブユニット8、9、10のH89によってS100A12ダイマー界面で調整される。以前の研究では、Zn2+-loaded S100A12がタンパク質の組織をホモテトラマー(44 kDa)に誘導し、Ca2+-親和性11、12、最近の金属滴定を増加させる可能性があることを提案しています。研究6は、Zn 2+に対するタンパク質の親和性を高めるためにS100A12によるCa2+-結合を示唆している。S100A12 EF-handsがCa2+によって完全に占有されると、追加のCa2+はダイマー間で結合すると考えられ、ヘキサ形成(約63 kDa)をトリガする。ヘメザリック四半期構造のアーキテクチャは、テトラマーの構造とは明らかに異なります。テトラマーインターフェイスは、ヘキサー形成10に利益をもたらす新しいダイマーダイマーインターフェイスを生み出すために破壊することが提案されています。S100A12は、全ての細胞質タンパク質13の約5%を構成するヒト顆粒球によってほぼ排他的に発現される。そのDAMP機能S100A12では、歴史的に高度な糖化最終産物(RAGE)に対するマルチリガンド受容体のアゴニストとして記述され、次いで細胞外同定されたRAGE結合タンパク質(EN-RAGE)14と呼ばれる。我々は以前にRAGEとTLR415の両方に生化学的S100A12結合を報告したが、我々は最近、TLR4依存的な方法16でS100A12刺激に応答するヒト単球を実証した。これには、Ca2+/Zn2+-誘発されたヘメザリック四半期構造 16 に S100A12 を配置する必要があります。
ここでは、組換えヒトS100A12およびその免疫細胞刺激のためのイオン誘発オリゴマーの精製手順を説明する 16,17.これは、最初にタンパク質を単離して濃縮し、バルク汚染(例えば、エンドトキシン/リポ多糖類)18を除去するアニオン交換カラムを含む2段階のクロマトグラフィー戦略に基づいています。イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、異なる正味表面電荷に基づいてタンパク質を分離します。S100A12(等電点5.81)のような酸性タンパク質の場合、pHが8.5と強いアニオン交換樹脂を持つ緩衝系が良好な分離につながります。結合タンパク質を高塩バッファー勾配でタンパク質でタンパク質化した。溶出バッファー内のイオン強度マイナスイオンの増加に伴い、樹脂表面の荷当量に対するタンパク質と競合する。タンパク質は、その正味電荷に応じて個別に溶出し、その結果、ここに記載される緩衝液は、過剰発現したS100A12タンパク質を単離および濃縮することを可能にする。リポ多糖類の負の荷電基のために、これらの分子はまた、アニオン交換樹脂に結合します。しかし、その正味電荷は、適用された高塩勾配で後で溶出します。精製手順の第2段階は、研磨のために導入されている。これはS100A12のカルシウム結合能を利用し、疎水性相互作用カラム上の残りの不純物を除去する。S100A12のカルシウム結合は、タンパク質の表面に立体構造変化および疎水性パッチの曝露につながる。その条件下で、S100A12は樹脂の疎水性表面と相互作用する。EDTAによるカルシウムキレートでは、この相互作用が逆転する。イオン、特にカルシウムおよび亜鉛の存在下で、S100A12はホモメリックオリゴマーに配置する。異なるオリゴマーの構造機能関係を研究するために、化学架リンカーでダイメリック、四面体およびヘメダリック組換えS100A12を安定化させ、サイズ排除クロマトグラフィーカラム上の複合体を分離した。最後に、精製タンパク質とそのイオン誘発オリゴマーの機能性および生物学的活性を分析するために、S100A12およびLPS刺激単球のサイトカイン放出を比較することができる。
S100A12を精製するための種々の方法は、これまでに説明されている。Jackson et al.19は、例えば、アニオン交換カラムおよびその後のサイズ排除クロマトグラフィーを介して精製したプロトコルを公開した。サイズ除外列の精製研磨は良好な結果につながりますが、例えば荷重量が限られているため、スケーラビリティの柔軟性が低くなります。Kiss et al.20によって公開された別のアプローチは、最初の精製ステップとしてNi2+アフィニティカラムを介してタグ付けされたタンパク質の精製を記述し、続いてタグを除去し、さらに精製ステップを酵素切断する。前述の研究19、20とは対照的に、このプロトコルに記載されているように産生されたタンパク質は、免疫細胞上の実験のために決定される。従って、細菌培養物からの残存エンドトキシン汚染が課題である。エンドトキシン除去のための異なるアプローチはこれまで説明されているが、任意の与えられたタンパク質溶液21、22に対して同等に機能する均一な方法はない。
要約すると、我々のプロトコルは、効率的なエンドトキシン除去と純粋なタンパク質の高収率と細菌系におけるタグフリー発現の利点を兼ね備えています。

<table><tbody><tr><td>pET11b ベクトル</td><td>Novagen</td><td>&nbsp;</強い></td><td><強い>&nbsp;</td></tr><tr><td>BL21(DE3) コンピテント E. coli</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>C2527</td><td>&nbsp;</強い></td></tr><tr><td><強い>&nbsp;</強い></td><td><強い>&nbsp;</強い></td><td><強い>&nbsp;</強い></td><td><強い>&nbsp;</td></tr><tr><td>100x 非必須アミノ酸</td><td>メルク</td><td>K 0293</td><td></td></tr><tr><td>25% HCl</td><td>カール ロス</td><td>X897.1</td><td></td></tr><tr><td>4&minus;20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels</td><td>BioRad</td><td>4561093</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin ナトリウム塩</td><td>Carl Roth</td><td>HP62.1</td><td></td></tr><tr><td>BS3 (ビス(スルホスクシンイミジル)suberate) - 50 mg</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21580</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid Dihydrat</td><td>Carl Roth</td><td>5239.1</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution</td><td>BioRad</td><td>1610438</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution</td><td>BioRad</td><td>1610436</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Human Monocyte Enrichment Kit</td><td>Stemcell</td><td>19059</td><td>磁気陰性細胞単離キット</td></tr><tr><td>EDTA 二ナトリウム塩二水和物</td><td>Carl Roth</td><td>8043.1</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>EndoLISA</td><td>Hyglos</td><td>609033</td><td>Endotoxin 検出アッセイ</td></tr><tr><td>エンドトキシンフリー超純水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TMS-011-A</td><td>エンドトキシンフリー緩衝液調製用超純水</td></tr><tr>エンドトキシン除去樹脂<td>EndoTrap red</td><td>Hyglos</td><td>321063</td><td>エンドトキシン除去樹脂</td></tr><tr><td>FBS(熱不活性化)</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>HBSS、カルシウム、マグネシウムなし</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14175053</td><td></td></tr><tr><td>ヘペス</td><td>カールロス</td><td>9105</td><td></td></tr><tr><td>Hepes(高品質、エンドトキシン精巣)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>hTNF-α-OptEia ELISAセット</td><td>BD</td><td>555212</td><td></td></tr><tr><td>IPTG(イソプロピル-&szlig;-D-チオガラクトピラノシド)</td><td>カールロス</td><td>CN08.1</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン(200 mM)</td><td>メルク</td><td>K 0282</td><td></td></tr><tr><td>LB-ミディアム</td><td>カールロス</td><td>X968.1</td><td></td></tr><tr><td>大腸菌O55:B5</td><td>メルク</td><td>L6529</td><td></td></tr><tr><td>パンコール、ヒト</td><td>PAN</td><td>バイオテクノロジーP04-60500</td><td>分離溶液(密度勾配遠心分離)</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン(10.000 U / mL)</td><td>メルク</td><td>A 2212</td><td></td></tr>フェ<tr><td>ニルセファロース高性能</td><td>GEヘルスケア</td><td>17-1082-01</td><td>樹脂からのリポ多糖類疎水性相互作用クロマトグラフィー</td></tr><tr><td>ポリミキシンB</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-pmb</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤錠</td><td>ロシュ</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Q セファロース ファストフロー</td><td>GE</td><td>ヘルスケア 17-0510-01</td><td>陰イオン交換クロマトグラフィー用樹脂</td></tr><tr><td>RoboSep バッファー</td><td>Stemcell</td><td>20104</td><td>細胞分離バッファー (セクション 5.1.4)</td></tr><tr><td>RPMI 1640ミディアム</td><td>メルク</td><td>F 1215</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム (NaCl)</td><td>カール・ロス</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>カール・ロス</td><td>P031.1</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>カール・ロス</td><td>4855.3</td><td></td></tr><tr><td>塩化亜鉛</td><td>カール・ロス</td><td>T887</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Labware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,45 &マイクロ;m シリンジフィルター</td><td>Merck</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>14 mL 丸底チューブ</td><td>BD</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>2 L 三角フラスコ</td><td>Carl Roth</td><td>LY98.1</td><td></td></tr><tr><td>24 ウェル懸濁プレート</td><td>Greiner</td><td>662102</td><td></td></tr><tr><td>5 L 測定ビーカー</td><td>Carl Roth</td><td>CKN3.1</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 円錐形遠心チューブ</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 高速遠心分離チューブ</td><td>Eppendorf</td><td>3,01,22,178</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 遠心フィルターユニット MWCO 3 kDa</td><td>メルク</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 遠心フィルターユニット MWCO 50 kDa</td><td>メルク</td><td>UFC905024</td><td></td></tr><tr><td>培養皿 (100 mm)</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>透析チューブ閉鎖</td><td>Spectrum</td><td>132738</td><td></td></tr><tr><td>EasySepマグネット「The Big Easy」</td><td>Stemcell</td><td>18001</td><td></td></tr><tr><td>フラクションコレクターチューブ5 mL</td><td>Greiner</td><td>115101</td><td></td></tr><tr><td>Lumoxフィルム、25 & マイクロ;m, 305 mm x 40 m</td><td>Sarstedt</td><td>94,60,77,316</td><td>単球培養プレート用フィルム</td></tr><tr><td>Spectra/Por 透析膜 (3.5 kDa)</td><td>Spectrum</td><td>132724</td><td></td></tr><tr><td>Steritop フィルターユニット</td><td>Merck</td><td>SCGPT01RE</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg;Cインキュベーター(振とう付き)</td><td>ニューブランズウィックサイエンティフィック</td>イ<td>ノーバ42</td><td></td></tr><tr><td>&Auml;KTA清浄機 UPC 10</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>FPLC システム</td></tr><tr><td>フラクションコレクター</td><td>GE Healthcare</td><td>Frac-920</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機 (ローター A-4-81 付き)</td> <td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>固定角ローター</td><td>Eppendorf</td><td>F-34-6-38</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean Tetra Cell</td><td>BioRad</td><td>1658000EDU</td><td></td></tr><tr><td>NanoPhotometer</td><td>Implen</td><td>P330</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Brandelin</td><td>UW2070</td><td></td></tr><tr><td>蛍光リーダー</td><td>Tecan</td><td>無限 M200PRO</td><td></td></tr><tr><td>pH メーター</td><td>Knick</td><td>765</td><td></td></tr></tbody></table>

免疫細胞刺激のためのヒトs100a12とそのイオン誘発オリゴマーの精製

Purification of Human S100A12 and Its Ion-induced Oligomers for Immune Cell Stimulation

本プロトコルでは、ヒトカルシウム結合タンパク質S100A12及びそのイオン誘発オリゴマーを免疫細胞刺激のための大腸菌培養から精製する方法について述べた。このプロトコルは、アニオン交換クロマトグラフィーカラム上のタンパク質事前精製および疎水性相互作用カラム上のその後の研磨工程を含む2段階のクロマトグラフィー戦略に基づいています。この戦略は、高純度のS100A12タンパク質を生成し、管理可能なコストで収量します。免疫細胞の機能的アッセイの場合、最終的に残りのエンドトキシン汚染は、エンドトキシンフリータンパク質を得るために慎重な監視とさらなる洗浄ステップを必要とします。エンドトキシン汚染の大部分は、アニオン交換クロマトグラフィーによって除外することができます。残留汚染を枯渇させるために、このプロトコルは遠心フィルターによる除去ステップを記述する。利用可能なイオン強度S100A12に応じて、異なるホモマルチマーに配置することができます。構造と機能の関係を調べるために、このプロトコルはさらにS100A12タンパク質のイオン処理について説明し、続いて化学架橋でS100A12オリゴマーを安定化させ、その後のサイズ排除による分離を行う。クロマトグラフィー。最後に、精製タンパク質の生物活性を確認し、LPSフリー製剤を確認する細胞ベースのアッセイについて説明します。

AIEXカラム(図1A-C)およびその後のカルシウム依存性HIC(図2A,B)の事前精製に続いて、高純度タンパク質が得られた(図2C)。さらに、エンドトキシンの測定は、LPS除去に成功したことを明らかにした。AIEXに続くLPS含有量は、アッセイ検出限界を超える1:10希釈、すなわち500EU/mLを超えて測定した。50 kDaフィルターユニットを介した最初の濾過の後、LPS含有量は1 EU/mLに減少した。3 kDaフィルターユニットによる濃度と50kDaによる追加濾過に続いて、測定されたLPS汚染は0.08 EU/mLであった。
追加の対照として、ヒト単球は産生された野生型タンパク質で刺激された(図3A,B)。ポリミキシンB治療は、S100A...

このプロトコルは、組換えタグフリーカルシウム結合タンパク質S100A12およびヒト単球刺激アッセイのためのイオン誘導オリゴマーの精製方法を説明する。

免疫細胞刺激のためのヒトS100A12とそのイオン誘発オリゴマーの精製

In this protocol, we describe a method to purify human calcium-binding protein S100A12 and its ion-induced oligomers from Escherichia coli culture for ...

このプロトコルは、ヒトカルシウム結合タンパク質S100A12の完全な精製手順を説明し、特に、下流の研究への影響に対する異なるイオン誘発オリゴマーです。この技術により、非常に純粋で、内毒素を含まないタンパク質の高い収率を維持することができます。サイズ排除クロマトグラフィーカラム上の化学的架橋および分離は、さらなる機能アッセイ用ホモオリゴマータンパク質を生成する説得力のある方法である。この技術により、S100A12のパターン認識受容体リガンドやアート情報としての機械化的側面が可能になり、新たな標的介入を理想的に開発し、診断アッセイを改善することができます。このビデオを見る以外に、複雑な複数ステップの手順を説明しているので、プロトコルを注意深く読むことをお勧めします。まず、透析管を適切な長さ約30センチメートルにカットし、空気のためのスペースを追加します。膜を脱イオン水に15~30分間浸し、グリセロールを除去します。クリアしたタンパク質溶液の粘度を下げるには、25ミリリットルのAIEXバッファーAで溶液を希釈し、最初のクロージャーをチューブに取り付けます。サンプルを膜に積み込み、チューブの上端から少なくとも1センチメートルの第2の閉鎖を取り付けます。冷却された部屋に摂氏4度で、AIEXバッファーAの容器を攪拌板の上に置き、攪拌棒を加え、タンパク質溶液で満たされた膜を加えます。回転するひきかき混じり棒に干渉がないように、サンプルを回転させる速度を調整します。4°Cで12〜24時間透析し、透析バッファーをフリーの事前冷却バッファAに置き換え、少なくとも4時間続けます。チューブから0.45ミクロンのフィルターユニットを介して50ミリリットルチューブに透析タンパク質溶液を移します。一般的なメンテナンスで FPLC を起動します。列バッファー AIEX A および AIEX B をバッファーバルブに接続し、列を含むアニオン交換樹脂を FPLC のカラム ポートに接続します。それに応じて、一般的なクロマトグラフィーパラメータを調整します。FPLC ソフトウェアで AIEX プログラムを起動し、バッファー A の平衡容積を選択します。溶出中に2ミリリットル分を集める。実行を終了した後、溶出した分数を分析します。このために、15%SDSのページを染色したクーマシーの各画分の10マイクロリットルをロードし、S100A12を含む画分を識別します。透析用の分数を含むこれらのS100A12をTRISバッファ状の生理液にプールします。タンパク質精製を継続するには、タンパク質透析後、サンプルに塩化カルシウムを25ミリモルの最終濃度に添加し、次のステップでS100A12の樹脂への結合を容易にする。次に、0.45ミクロンの注ぎ量のフィルターを通してサンプルをフィルターします。HICバッファーとサンプルを摂氏4度に平衡化します。次に、列バッファー HIC A と B と列をシステムに接続し、パラメーターを調整します。バッファー HIC A の 1 ~ 2 列のボリュームで列を平衡化するメソッドを開始し、サンプルをロードし、UV 信号を使用して非バインドサンプル ブロックを UV 信号で洗浄がベースライン レベルに達します。次に、バッファーEDTAを含むカルシウムキレートで溶出を開始する。溶出中に2ミリリットルのピーク画分を収集します。15%SDSのページに染色されたクーマシーの各画分の10マイクロリットルを分析した後、純粋なS100A12画分を識別します。これらの分数をプールし、HBSに対して透析します。まず、15ミリリットルのサンプルを50キロダルトン遠心フィルターユニットに積み込みます。摂氏10度で約10分間3200倍の遠心分離機。濾過されたフロースルーを氷の上の新鮮な容器に移します。さて、フィルター膜をすすぐと、フィルター先端に濃縮された溶液の希釈のためにHBSの1ミリリットルを使用してください。再び遠心分離機は、フロースルーでできるだけ多くのタンパク質を回収する。溶液をフィルタリングするには、サンプルの負荷と遠心分離を必要な回数繰り返します。次に、フロースルーを含むS100A12を濃縮し、3キロダルトン遠心フィルターと遠心分離機に3200倍g、摂氏10度で約30分間積み込みます。これで、ボリュームは初期読み込みボリュームの 1/10 まで 1/5 に減少します。濃縮溶液を新しいチューブに移します。必要に応じて、濃度ステップを繰り返します。化学架橋後、原稿に従って、サイズ排除クロマトグラフィーを行う。HBSでカラムを平衡化し、サンプルをロードし、走行中に1〜2ミリリットルのピーク分率を収集します。これらの画分を4〜20%の勾配SDSページで分析した後、目的のタンパク質複合体の主要バンドと画分をプールする。次に、前に行ったソリューションを集中します。密度勾配遠心分離によりヒトバフィーコートから単球を分離するために、まず分離溶液を室温に平衡化する。20ミリリットルを15ミリリットルの遠心分離チューブに移し、1つのバフィーコートにつき2本のチューブを入れ替えます。HBSSでヒトのバフィーコートから血液を60ミリリットルの総体積に希釈し、この混合物の30ミリリットルを分離媒体の上に慎重に塗布します。室温で35分間550回gで遠心分離機。遠心分離機のブレーキを切ります。遠心分離後、単核末梢血細胞は分離培地の上に直接配置される。ピペットを使用して、これらの細胞を新鮮な50ミリリットルの遠心分離管に移します。チューブに50ミリリットル、遠心分離機を170倍の10分間充填します。上清を吸引し、ピペット処理により少量のHBSSで細胞ペレットを再懸濁する。その後、チューブを最大50ミリリットル、遠心分離機を290倍gで10分間充填します。再び上清を吸引する。HBSSと遠心分離機の50ミリリットルで細胞を10分間170倍に再懸濁します。上清を吸引し、細胞ペレットを1ミリリットルの分離バッファーの少量で再懸濁し、細胞を数え、1ミリリットル当たり7個の細胞に5倍の10の濃度にバッファーを加える。単核末梢血細胞からの単球分離のためには、磁気陰性細胞分離キットを使用し、製造業者の議定書に従ってください。自動化された細胞カウンターを使用して単球をカウントし、1ミリリットル当たり6細胞に対して2倍の濃度に単球培地で再懸濁する。単球を培養するために、懸濁細胞に適した疎水性ガス透過性フィルムを用いた細胞培養皿をレイアウトする。プレートをUV光下に約30分間置き、滅菌します。これらの培養プレートに細胞懸濁液の15〜25ミリリットルを移し、摂氏37度と5%の二酸化炭素で一晩休ませます。AIEXカラム及びそれに続くカルシウム依存性HICに対する予精製後、高純度タンパク質が得られた。さらなるコントロールとして、ヒト単球をLPSで刺激し、野生型タンパク質を産生した。異なるイオンへのタンパク質暴露は異なるS100A12オリゴマーの配置で生じる。亜鉛濃度を上げると、4~20%のクーマシー染色SDSページで分離した際に、S100A12を四量体とヘキサマーに配置することが必要になります。過剰なイオンを架橋前に適用すると、オリゴマー平衡の顕著なシフトを誘導した。S100A12は、25ミリモルカルシウムまたは25ミリモルカルシウムおよび1ミリモル亜鉛の存在下で架橋された。25ミリモル塩化カルシウムと塩化亜鉛1ミリモルとHBS緩衝液中で架橋した後、六重体と四量体を分離した。四量体と二量体を、25ミリモルクロライドでHBS緩衝液中で分離した。クーマシー染色した後にプール及び濃縮オリゴマーの一例は、4〜15%の勾配SDSのページに染色され、二量体、四量体、およびヘキサマーを示す。六方体S100A12による単球刺激は顕著なTNFα放出をもたらした。内毒素除去後、オリゴマーの後の発生および精製中にサンプルに汚染を再導入しないことが重要である。S100A12オリゴマー化に関する任意のプロセスの下流分析が考えられる。同様に、オリゴマー化プロセス自体に影響を与えるアミノ酸およびイオン条件を分析することができる。現在、記載されているプロトコルに従って分離されたS100A12オリゴマーを使用して、特定のペプチドリガンドと抗体を開発して、TLF4を介してタンパク質のシグナル伝達を遮断し、診断アッセイを開発および改善しています。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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免疫細胞刺激のためのヒトS100A12とそのイオン誘発オリゴマーの精製

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