Name: ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたゲノム修飾の生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 学ぶCRISPR-Cas9を用いたヒト多能性幹細胞のゲノム編集手法。修復テンプレートを活用し、ヘテロ接合・ホモ接合変異を効率的に導入する方法を解説。遺伝的背景の影響を排除したアイソジェニック細胞株の作製により、遺伝子機能と疾患メカニズムの研究を支援します。

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この研究は、国立心臓・肺・血液研究所(NHLBI)、国立衛生研究所(助成金U01HL099656(P.G.およびD.L.F.)およびU01HL134696(P.G.およびD.L.F.)からの資金提供によって支援されました。

1. ガイドRNA(gRNA)の設計・施工
注:各gRNAは、100 bpの二本鎖(ds)オリゴヌクレオチド(図1A-C)を生成するためにアニールされた2つの60塩基対(bp)オリゴヌクレオチドで構成されています。gRNAの設計、生成、試験の効率は約2週間です(図2)。
<ol><li>ゲノム編集対象のDNA領域を選択し、フォーマットに適合する3-4 23 bp配列を同定し、5'-G(N 19)NGG-3'を同定する。これらのシーケンスは、対象地域の 20 bp 以内に配置する必要があります。 注:ターゲティングは、センスまたはアンチセンスストランドで実行することができます。</li>
	<li>CRISPOR(http://crispor.tefor.net)などのリソースを使用して、ゲノムの冗長性とオフターゲット確率のgRNA配列を評価します。</li>
	<li>20 bpターゲット配列(プロトスペーサー隣接モチーフまたはPAMを除く)を2つの60merオリゴヌクレオチドに組み込みます(シーケンスは5'~3'、赤と緑は図1Cに示すように逆補数です)。</li>
	<li>選択したベンダーから2つの60 bpオリゴヌクレオチドを注文します。オリゴヌクレオチドを受け取ったら、それぞれをddH2Oで100μMの最終濃度に再中断し、10μMの作業ストックを作ります。</li>
	<li>2つのオリゴヌクレオチドをアニールし、DNAポリメラーゼ(材料の表)を使用して100 bp dsDNA断片を生成する。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)ストリップチューブで10μM前方オリゴヌクレオチドの5μLと10μM逆オリゴヌクレオチドの5μLを組み合わせ、95°Cで5分間インキュベートし、室温(RT)で10分間反応を冷却します。</li>
	<li>表 1に説明するように PCR をセットアップします。表 2で概説したパラメータを使用して、サーマル サイクラーで PCR 増幅を実行します。</li>
	<li>1.5%(w/v)エチジウム臭化(EtBr)のアガロースゲルエレクトロフォアでPCR製品を可視化し、80-100Vで40分間、100bp帯(図3A)を切除し、LEDライトボックス上で可視化し、カミソリブレードを用いてゲルを使用して精製する。抽出キット(材料の表)。</li>
</ol>2. スクリーニング用PCRプライマーの設計
<ol><li>目的の遺伝子の400-500 bp領域を増幅するように特別に設計された前方および逆PCRプライマーを用いて編集されたDNAのスクリーニングを行う(表2)。任意の対照iPSCラインから単離されたDNAを使用して、スクリーニングPCRを実行する際にクリーンアンプリコンを確認します。</li>
	<li>1時間80-100Vで電気泳動後1.5%(w/v)ゲルでPCR製品を可視化します。 注: 編集されたクローンのシーケンスは、スクリーニングプライマー・セットの確認後に設計されたネストされたプライマーを使用して実行されます。サンプルは、シーケンス用の商用ソースに送信されます。</li>
</ol>3. gRNA_クローニングベクタープラスミドの調製
<ol><li>クローニングベクターを線形化するには、1.5 mL遠心管を取り、gRNA_クローニングベクターのDNAの1-5 μgを加え、AflII制限酵素バッファーの4μLとAflII制限酵素の1.5 μLを加えます。ddH2Oの24 μLに反応を持ち上げる. 上下にピペッティングして反応を混合します。一晩37°C(O/N)でインキュベートします。</li>
	<li>1%のアガロースゲルを1時間80-100Vで、物品バンド(予想バンドサイズは〜3519 bp)。</li>
	<li>ステップ1.6のように抽出し、精製します。</li>
</ol>4. gRNAベクターの組み立て
<ol><li>反応を設定し、表3に記載されているように、AflII消化gRNAクローニングベクターの1:5比で組み立てキット(材料の表)を用いてDNA断片を組み立てます。</li>
	<li>50°Cで反応を15分間インキュベートし、ddH2Oで反応を1:3に希釈し、メーカーの指示に従って3μLを使用して細菌変換を行います(材料の表)。カナマイシンLB/寒天プレート上のプレート細胞。</li>
	<li>gRNAあたり3-5コロニーを選びます。各コロニーをLBの4mLで接種し、軌道揺れインキュベーターで37°CでO/Nを成長させる。</li>
	<li>ミニプレッププラスミド単離キットを使用してプラスミドDNAを精製し、以下のプライマーを使用して各gRNAを配列してクローニングを成功させました: フォワード: GTACAAAAAAAAGGAGGCTAAGGAAGGAAGGAAGGAAGG;リバース: TGCCAACTTTAGAAAGCT.</li>
</ol>5. gRNA切断効率のテスト
<ol><li>前述の21を用いた6ウェルプレートに照射されたマウス胚線維芽細胞(MEF)上のプレートhESC。細胞が70-80%の合流に達したら、表4に概説されたトランスフェクションマスターミックスを準備する。</li>
	<li>ピペッティングで混合し、RTで15分間インキュベートし、細胞にドロップワイズを追加し、37 °Cで48時間(24時間後にメディアが変化する)でインキュベートします。</li>
	<li>48時間後に選別するための細胞を収穫する。<ol>
<li>3分RTインキュベーションでMEFを酵素的に取り除きます。</li>
		<li>hESC培地(表5)で細胞を1xをすすいで、hESC培地+10μM Y-27632二塩化物(材料表)に削り取る。</li>
		<li>ペレット細胞を3分間3分間300xgで再濁させ、hESC培地+10 μM Y-27632二塩酸塩の0.5mLで再中断する。 </li>
		<li>35 μmのセルストレーナーキャップを通して5 mLチューブにフィルターを入れます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いて、生細胞上にゲートを付け、緑色蛍光タンパク質(GFP)陽性細胞をソートする。</li>
	<li>最大1.5×104個分の細胞を10cm2皿に直接移し、Y-27632ジヒドロ塩化物を含むhESC培地(表5)に1:3基基膜マトリックス(材料表)を塗製した。</li>
	<li>Y-27632二塩酸塩を使用せずにhESC培地(表5)を使用して毎日培地を変更し、コロニーが直径が約1mmの場合、10-15日後に手動でクローンを選びます。<ol>
<li>P200ピペットと顕微鏡を使用して、慎重に単一のクローンを掻き取り、ピペットに細胞を引き込みます。</li>
		<li>コロニーで描かれた培地に96ウェルプレートに3〜4倍を穏やかに配管して細胞を分散させる。</li>
		<li>スクリーニング用のPCRストリップチューブに分配し、10,000 x gで細胞を5分間遠心分離してペレットし、gRNA当たり20個のコロニーを選びます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. クローンスクリーニング
<ol><li>細胞ペレットを20μLのプロテアーゼKバッファー(表5)(55°Cで1時間、95°Cで10分)で細胞ペレットをインキュベートし、渦を強く分離する。10,000 x gで5分間遠心分離機を採取し、上清を回収する。</li>
	<li>目的領域を増幅するように設計されたプライマーと、プロテアーナーゼKダイジェストの5μLを含むマスターミックスを用いて、総体積20μLでPCR(セクション2)のスクリーニングを行う。対照として遺伝子編集した細胞株から分離したゲノムDNAを用いる。</li>
	<li>2.5%(w/v)のアガロースゲル(図3B,C)で70-90Vで1時間電気泳動後のPCR産物のサイズ変化を評価する。任意のサイズの違いは、切断を示しています。</li>
</ol>7. 一本鎖オリゴDNA(sSODN)を用いて多能性幹細胞で正確なゲノム編集
<ol><li>最も効率的なgRNA配列を中心とした100 bp ssODNを設計し、最高の切断効率を実現します。</li>
	<li>gRNA配列にサイレント変異を導入することにより、再結合されたODNの再切断を防ぎます。PAM 配列の単一のサイレント変異で十分ですが、不可能な場合は 3~ 4 のサイレント変異が機能します。 注:標的クローンのスクリーニングを容易にするために、gRNA配列の約20bp以内の制限部位の導入が理想的である。</li>
	<li>目的の基本変更を使用して 1 つの ODN を設計し、基本変更なしで関心の突然変異を作成し、1 つの ODN を作成します。 注: これらの変更は、組み換えがより遠い距離でかなり低下するので、予測された CRISPR/CAS9 カット サイトから約 20 bp 以下にする必要があります。</li>
	<li>選択したベンダーから2つのsSODNを注文し、1 μg/μLの株式を作るために水で再中断します。-20 °Cで在庫を保管してください。</li>
</ol>8. トランスフェクションのセットアップ
<ol><li>ssODNとCRISPR-CAS9プラスミドをトランスフェクトするには、照射されたMEFの6ウェル皿にターゲット細胞株をプレート化し、O/Nインキュベーション後に70-80%の合流性に達する。</li>
	<li>表6に記載されているようにトランスフェクション反応を設定する。ピペッティングで反応を混合し、RTで15分間インキュベートします。</li>
	<li>48h後、セクション5.3に記載されているように細胞ソート用の細胞を調合する。</li>
	<li>200 μLピペットを使用して単一細胞をめっきした後、コロニー~10日後に選びます。100 μLの細胞を、以前にゼラチンで被覆した24または48ウェルプレートの1つのウェルに、Y-27632二塩酸塩を用いたhESC培地で照射したMEFを移す。セクション6で説明するように、残りの100 μLをDNA単離に使用します。</li>
</ol>9. 単一コロニーにおける変異のチェック
<ol><li>ssODNの正常な統合を確認するには、セクション2で設計されたスクリーニングプライマーを使用してPCRを実行するために、各コロニーから単離されたDNAの5 μLを取ります。PCR製品(材料表)を精製し、ssODNで作成された独自の酵素部位を用いて制限酵素消化を調製します。 注:この消化には、制限酵素バッファーと40 μLの体積における制限酵素のメーカー推奨濃度も含まれます。</li>
	<li>ピペッティングで反応を混合し、1-3 hのメーカーの推奨温度でインキュベートします。</li>
	<li>消化されたPCR製品を1.5%(w/v)EtBrアガロースゲル電気泳動で40分間80-100Vで可視化します。ssODN の統合が正常に行われた場合は、ネストされたプライマーを使用して特定の突然変異を配列します。</li>
</ol>

<ol><li>Srivastava, D., Dewitt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+In+Vivo+Cellular+Reprogramming%3A+The+Next+Generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation.</a> Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Review Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Embryonic+Stem+Cells+to+Relevant+Populations%3A+Lessons+from+Embryonic+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development.</a> Cell. 132 (4), 661-680 (2008).</li>
<li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells%3A+from+2D+to+3D+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), 1-6 (2018).</li>
<li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).</li>
<li>Tiyaboonchai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA6+Plays+an+Important+Role+in+the+Induction+of+Human+Definitive+Endoderm%2C+Development+of+the+Pancreas%2C+and+Functionality+of+Pancreatic+%CE%B2+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic β Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).</li>
<li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+hESCs+to+Probe+the+Interaction+of+the+Diabetes-Associated+Genes+CDKAL1+and+MT1E%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E.</a> Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).</li>
<li>Zeng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Isogenic+Human+ESC+Platform+for+Functional+Evaluation+of+Genome-wide-Association-Study-Identified+Diabetes+Genes+and+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery.</a> Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+with+zinc+finger+nucleases+for+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging.</a> Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).</li>
<li>Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Modification+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells+by+Homologous+Recombination+and+CRISPR%2FCas9+System%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System.</a> Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).</li>
<li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+gene-corrected+adult+beta+globin+protein+in+human+erythrocytes+differentiated+from+patient+iPSCs+after+genome+editing+of+the+sickle+point+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation.</a> Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+detection+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas9+and+TALENs+using+integrase-defective+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors.</a> Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).</li>
<li>Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Doxycycline-Inducible+System+for+Genetic+Correction+of+iPSC+Disease+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models.</a> Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).</li>
<li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).</li>
<li>Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+human+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Genome editing in human stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).</li>
<li>Zhu, Z., González, F., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+iCRISPR+platform+for+rapid+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).</li>
<li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+engineering+in+human+pluripotent+stem+cells+using+Cas9+from+Neisseria+meningitidis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).</li>
<li>Cong, L., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using CRISPR-Cas9 system.</a> Methods in Molecular Biology. 1239, Clifton, N.J. 197-217 (2015).</li>
<li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).</li>
<li>Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+homology+directed+genome+editing+by+catalytically+active+and+inactive+CRISPR-Cas9+using+asymmetric+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).</li>
<li>Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+crispr+cas9-mediated+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64(2019).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

このプロトコルでは、CRISPR-CAS9と2つのssODN修復テンプレートを使用して、ヒト多能性幹細胞において特定のヘテロ接合性またはホモ接合ゲノム変化を生成することが実証されている。この方法により、10%に近い効率でヘテロ接合ゲノム変化を発現する等元細胞株の生成に成功した。このプロトコルは、細胞選別後に低密度で細胞を培養した後の細胞増殖と生存をサポートする照射MEF上で成長したヒトESCとiPSCの両方に最適化されています。細胞死は10 ng/mL bFGFおよびY-27632二塩酸塩を持つ細胞を維持することによって最小にすることができる。このプロトコルはフィーダーフリー培養システムに適合する可能性がありますが、さらなる最適化が必要な場合があります。
トランスフェクション効率は細胞株から細胞株まで可変ですが、脂質トランスフェクション試薬のDNA3μgと3μLの使用は、一般的に0.5~2%のトランスフェクション効率の最良の結果を与えました。しかしながら、トランスフェクション効率が低ければ、DNAや脂質試薬の量の最適化が行うことができる。他のトランスフェクション試薬も研究者によって...

ヒト胚性幹細胞(HESC)および誘導多能性幹細胞(iPSC)は、異なる系統の細胞型を生成する能力を維持しながら、更新能力のためにヒト疾患をモデル化するための貴重なツールである1,2 、3、4.これらのモデルは、遺伝子機能を調知する可能性を開き、特定の変異および文言型が様々な疾患5,6にどのように関連しているかを理解する。しかしながら、特定の変化が特定の表現型にどのように連結されるかを理解するためには、対同原性制御および変異細胞株の使用は、線対線変動性7、8を制御するために重要である。転写活性化剤様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)および亜鉛フィンガーヌクレアーゼは、原発細胞を含む多様な遺伝モデルにおける挿入または欠失(インデル)変異を生成するために使用されてきた。しかし、これらのヌクレアーゼは、使用し、高価な9、10、11、12、13、14を使用するのが面倒なことができます。クラスター化された定期的に間隔をあけた短いパリンドロミックリピート(CRISPR)-CAS9ヌクレアーゼの発見は、ゲノムの事実上あらゆる領域におけるインデル形成の効率、使用の簡素化、およびコストの削減により、フィールドに革命を起こしました15,16歳,17歳,18歳,19.
CRISPR-CAS9ベースのゲノム編集技術を用いる上での課題は、第2対立遺伝子20にインデル変異を作成することなく、1つの対立遺伝子における特定の突然変異の生成または補正であった。このプロトコルの主な目標は、2本鎖オリゴヌクレオチド(ssODN)修復テンプレートを使用して、第2対立遺伝子のインデル形成を減少させるために、この課題を克服することです。両方のssODNは、CAS9ヌクレアーゼによる再切断を防ぐために無声突然変異を含むように設計されていますが、目的の変化が含まれているのは1つだけです。この方法は、第2対立遺伝子におけるインデル形成を誘導することなく、特定のヘテロザイゴウス遺伝子改変を生成する効率を高める。このプロトコルを用いて、6つの独立したゲノム位置における遺伝子編集実験は、第2対立遺伝子におけるインデル形成なしで1つの対立遺伝子における所望のゲノム変化の正確な導入を実証し、〜10%の全体的な効率で起こる。記載されたプロトコルは、Maguireらら21から適応されている。

<table><tbody><tr><td>5mlポリスチレン丸底チューブ、セルストレーナーキャップ付き</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルポリスチレン組織培養皿</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>AflII制限エンドヌクレアーゼ</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0520</td><td></td></tr><tr><td>アガロー</td>ス<td>VWR</td><td>N605</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12培地</td><td>サーモフィッシャー</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Roche</td><td>11969064001</td><td></td></tr><tr><td>蛍光活性化セルソーター(FACS)装置</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ゲル抽出キット</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2611 gRNA_Cloning</td><td></td></tr><tr><td>Vector</td><td>Addgene</td><td>41824</td><td></td></tr><tr><td>LB 寒天プレート 50 &mu;g/ml カナマイシン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン ステム試薬</td><td>サーモフィッシャー</td><td>(STEM00001)</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル増殖因子還元型 (GFR)</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>マウス胚性線維芽細胞 (MEFs)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヌクレオスピンゲル抽出および PCR クリーンアップキット</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>眼窩振盪インキュベーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCas9_GFP</td><td>ベクターAddgene</td><td>44719</td><td></td></tr><tr><td>PCRストリップチューブUSA</td><td>Scientific</td><td>1402-2900</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼおよび5倍;Phusion buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K210011</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Qiagen Qiagen</td><td>19133</td><td></td></tr><tr><td>StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells</td><td>Takara</td><td>636763</td><td></td></tr><tr><td>SOC medium</td><td>New England Biolabs</td><td>B9020S</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme</td><td>サーモフィッシャー</td><td>12605036</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 二塩酸塩/ROCK阻害剤(ROCKi)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト多能性幹細胞におけるcrispr-cas9を用いて定義されたゲノム修飾の生成

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

ヒト多能性幹細胞は、遺伝子機能を研究し、疾患に関連する特定の変異をモデル化するための強力なシステムを提供します。正確なヘテロジゴウス遺伝子改変の生成は、CRISPR-CAS9が第2対立遺伝子のインデル形成を媒介しているため困難である。ここでは、1 つだけが目的のシーケンス変更を表現する 2 つの修復テンプレートを使用して、この問題を克服するためのプロトコルを示しますが、両方のテンプレートには、再切断とインデル形成を防ぐためのサイレント変異が含まれています。この方法論は、DNAの遺伝子編集コード領域がヒト疾患および生物学を研究するための等元制御および変異ヒト幹細胞株を生成するのに最も有利である。さらに、遺伝子編集実験の労力とコストを削減するために、トランスフェクションおよびスクリーニング方法論の最適化が行われている。全体として、このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞モデルを利用した多くのゲノム編集プロジェクトに広く適用可能である。

gRNAの生成とインデルのスクリーニング
各gRNAをプラスミドベクターにクローニングし、U6プロモーターを用いて発現する。AflII制限酵素は、プラスミド(#41824アジーン)を線形化するために使用され、U6プロモーターの後に位置する。2つの60bpオリゴをアニーリングした後に生成された100bpバンドは、DNAアセンブリを用いてgRNA発現ベクターにクローニングされる。gRNAプラスミドが生成されると、それらはCRISPS-CAS9 GFPプラスミド(#44719アジーン)と共にHESCまたはiPSCにトランスフェクトされる。GFP+細胞は、トランスフェクトされた細胞とメッキのために濃縮するために2日後にソートされる(セクション5参照)。10-14日後、単一細胞由来コロニーを採取し、DNAを単離して、各gRNAに対して生成されたインデル形成をスクリーニングするために使用する。gRNA部位にまたがるプライマーを用いたPCR増幅は、EtBrを用いて2.5%(w/v)のアガロースゲルを用いてインデル形成を可視化するために使用され、...

このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたヘテロ接合性またはホモ接合ヌクレオチド変化の生成を容易にする方法を提供する。

ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたゲノム修飾の生成

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

遺伝子機能と疾患の研究は、人間の集団の外来性によって妨げられている。患者固有および制御iPS細胞株の異なる遺伝的背景は、所定の機能的アッセイに見られる分化効率および表現型に影響を及ぼす可能性がある。唯一の違いが関心の特定の突然変異である遺伝的に同一または同一の線の使用は、これらの問題を克服するために重要である。多くのヒト疾患は、CRISPR-Cas9システムでは生成が困難なヘテロ接合性突然変異によって引き起こされます。これは、非常に高い頻度で起こり得る非標的性アリールにおけるインデル突然変異の生成によるものです。私たちの技術は、1つだけが関心の突然変異を抱えている2つの修復テンプレートを使用して、この問題を克服します。この技術を試みる研究者は、ヒト多能性幹細胞培養に熟練すべきである。コロニーピッキングのビデオデモンストレーションは、正しいサイズと形態だけでなく、ピッキングやスクリーニングに使用される技術を示すために役立ちます。この手順をデモンストレーションするレオ・カルデナスです。まず、照射されたMEF上のヒトESCを6ウェルプレートにプレートします。トランスフェクションマスターミックスを準備します。ピペットで混ぜ、室温で15分間インキュベートします。細胞が70〜80%の合流度に達したら、トランスフェクションマスターミックスを細胞と共に各ウェルにドロップして、摂氏37度で48時間インキュベートします。メディアを 24 時間ごとに変更します。細胞を収穫するには、まず、トリプルEで細胞を室温で3分間インキュベートし、MEFを酵素的に除去する。10マイクロモルロック阻害剤とHESC培地の0.5ミリリットルを追加します。ペレット細胞は3分間300回gで、10マイクロモルROCK阻害剤を有するヒトESC培地の0.5ミリリットルで再懸濁した。35ミクロンの細胞ストレーナーキャップを通して5ミリリットルチューブに細胞懸濁液をろ過します。蛍光活性化細胞選別を使用して、生細胞にゲートを付け、緑色蛍光タンパク質陽性細胞を選別します。次に、4つの選別された細胞に最大1.5倍の10を直接10センチメートルの皿に移し、1〜3基膜マトリックスを塗り、ROCK阻害剤を含むMEFおよびヒトESC培地を照射した。ROCK阻害剤を使用せずにヒトESC培地を使用して毎日培地を変更します。10〜15日後、コロニーは直径約1〜2ミリメートルである。顕微鏡下で、P200ピペットを使用して1つのクローンを慎重に削り取り、ピペットに細胞を引き込みます。コロニーで作成された培地中で3~4回軽くピペットを入れて、96ウェルプレートのウェルに細胞を分散させます。次に、各ガイドRNAに対して20個のコロニーを選び、スクリーニングのためにPCRストリップチューブに分配します。ペレット細胞は、10,000回Gで5分間遠心分離して細胞をペレット化する。現在、タンパク質処理Kバッファーの20マイクロリットルで細胞ペレットをインキュベートし、DNAと渦を激しく分離します。5分間Gの10,000倍で遠心分離機。次に、編集したDNAのスクリーニングPCRを行う。目的の領域を増幅するように設計されたフォワードとリバースプライマーを含むマスターミックスのチューブ20マイクロリットルだけでなく、プロテアーゼKダイジェストの5マイクロリットルを追加します。スクリーニングPCRを行う際に、コントロールiPSCラインから単離したゲノムDNAを使用して、クリーンアンプリコンを確認します。70~90ボルトで1時間経ったPCR産物のサイズ変化を、2.5%の重量で2.5%のアガロースゲルで評価します。どんなサイズの違いも切断を示す。一本鎖オリゴDNAとCRISPR-Cas9プラスミドをトランスフェクトするには、照射されたMEFの6ウェル皿にターゲット細胞株をプレートし、一晩のインキュベーション後に70〜80%のコンフルエンスに達する。記載に従ってトランスフェクション反応を設定する。反応をピペットで混ぜ、室温で15分間インキュベートします。次に、トランスフェクション反応混合物を細胞にドロップワイズ添加する。48 時間後、セルの並べ替えに使用するセルを以前のように準備します。単一細胞をめっきしてから約10日後、200マイクロリットルのピペットを使用してコロニーをPCRストリップチューブに選び、ゼラチンとMEFで事前にコーティングされた12ウェルプレートの井戸に入ります。細胞の100マイクロリットルを24または48ウェルプレートの各ウェルに移し、以前にゼラチンでコーティングし、ROCK阻害剤を用いたヒトESC培地中のMEFを照射した。残りの100マイクロリットルをDNA分離に使用します。一本鎖オリゴDNAの正常な統合を確認するには、各コロニーから分離した5マイクロリットルのDNAを採取し、以前に設計したスクリーニングプライマーを使用してPCRを行います。PCR産物を精製し、一本鎖オリゴDNAに作成されたユニークな酵素サイトを使用して、制限酵素消化の40マイクロリットルを調製します。ピペットで反応を混ぜ、メーカーの推奨温度で1〜3時間インキュベートします。次に、1.5%重量の負荷色素を含む消化PCR産物を、80~100ボルトで40分間、80~100ボルトで表した量のエチジウム臭化物を可視化します。一本鎖オリゴDNAの積分が成功した場合、入れ子になったプライマーを用いて配列特異的変異が起こる。本研究では、ガイドRNA構築のために、1.5%アガロースゲルから100塩基対バンドを切除した。細胞トランスフェクション後、ガイドRNA切断の検証を2.5%アガロースゲルを用いて可視化した。180塩基対PCR産物は、インデル形成を示すバンドシフトを有するノーカット制御および異なるクローンを示した。異なるガイドRNAは、異なる切断効率を持っていました。編集された対立遺伝子のCRISPR-Cas9再切断を避けるために、PAM配列はGからAにサイレント突然変異を使用して改変された。PAMシーケンスのサイレント突然変異は、1つまたは2つの対立遺伝子への正常な統合をスクリーニングするのに役立つユニークな制限サイトを生成しました。ゲノム編集幹細胞株は、下流の分化や機能アッセイに使用して、ヒトの発達や疾患に与えられた突然変異の影響を研究することができます。この方法論は、ヒト疾患の多種多様に関与する特定のヘテロ接合性またはホモ接合性突然変異を有する等元性細胞株の生成を可能にする。これらの疾患モデルは、新しい細胞療法の開発への道を開くだけでなく、創薬のためのプラットフォームを提供します。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

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学ぶCRISPR-Cas9を用いたヒト多能性幹細胞のゲノム編集手法。修復テンプレートを活用し、ヘテロ接合・ホモ接合変異を効率的に導入する方法を解説。遺伝的背景の影響を排除したアイソジェニック細胞株の作製により、遺伝子機能と疾患メカニズムの研究を支援します。

ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたゲノム修飾の生成

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