Name: 肝癌における相撲プロテオームの濃縮、単離、同定、特性評価のためのツールとしての相撲結合エンティティ(SES) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 学ぶ SUMO結合エンティティを用いた肝癌におけるSUMO化プロテオームの濃縮・単離・同定・特性評価の手法。ヒト肝芽細胞とマウス肝腫瘍を用いて、SUMO化経路の役割を解明し、治療標的としての可能性を探索する。

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この作品は、フランス国立がんインスティトゥート・ナショナル・デュ・ガン、INCa助成金PLBIO16-251(PLBIO16-251)、CONACyT-SRE(メキシコ)助成金0280365、フランス・オクシタニー(M.S.R.)のREPEREプログラムの助成金によって支援されました。また、NIH(米国保健福祉省)-R01AR001576-11A1、 ゴビエルノ・ヴァスコ・デパーテアーメント・デ・サルー 2013111114 (M.L.M.-Cへ), ELKARTEK 2016, デパーテアメント・デ・インダストリア・デル・ゴビエルノ・ヴァスコ, MINECO: SAF2017-87301-R インテグラード・エン・エル・プラン・エ・プラン・エスタタル・ドインベスティガシオン・シエンティフィカ・イ・テクニカ・イ・イノヴァシオン 2013-2016 コフィナンシアド・コン・フォンドス・フェダー, BIOEF (バスクイノベーション・健康研究財団): EITB マラトイア BIO15/CA/014;サルド・カルロス3世:PIE14/00031内品, インテグラード・エン・エル・プラン・エスタタール・デ・インベスティガシオン・シエンティフィカ・イ・テクニカ・イ・イノヴァシオン 2013-2016 コフィナンシアド・コン・フォンドス・フェデラー(M.L.M.-C)、アソシアシオン・エスパニョーラ・コントラ・エル・カンサー(T.C.D, M.L.M-C)、ダニエル・アグラッグEASL(T.C.Dへ)、フンダシオン・シエンティフィカ・デ・ラ・アソシアシオン・エスパニョーラ・コントラ・エル・ガン(AECC科学財団)レア・腫瘍呼び出し2017(M.L.Mへ)、ラ・カイシャ財団プログラム(M.L.Mへ)。CICバイオガン(SEV-2016-0644)にセヴェロ・オチョア・エクセレンス認定を受けて、MINECOに感謝します。

すべての実験は、動物のケアと取り扱いのためのCIC bioGUNE機関委員会によって承認されました。すべての努力は、動物の苦しみを最小限に抑え、使用される動物の数を減らすために行われました。3ヶ月齢の男性グリシンN-メチルトランスフェラーゼ(Gnmt)欠損(Gnmt−/−)およびその野生型ゴミ類(Gnmt+/+)が使用された。
1. 細胞調製とリシス
注:本明細書において、Huh-7(ヒト肝腫細胞株)およびTHLE2(ヒト肝細胞株)が使用された。
<ol><li>湿度5%CO2-95%の加湿雰囲気の中で、標準増殖媒体中のP100プレートの細胞を37°Cに保ちます。</li>
	<li>ニューバウアー海血測定計計チャンバーを用いて細胞を数えることによって、1皿当たり1.2~1.5×106細胞の密度でめっきするP100プレートで細胞を成長させる。<ol>
<li>DMEMにおける培養Huh-7は、10%胎児ウシ血清(FBS)、1%ペニシリン・ストレプトマイシン-アンホテリシンB(PSA)および1%グルタミンを補充した。</li>
		<li>培養皿中のTHLE2細胞を0.01mg/mLフィブロネクチン、0.01mg/mLウシ血清アルブミン(BSA)、0.03mg/mLコラーゲン型で添加した気管支上皮細胞増殖基底培地(BEGM)で構成される増殖培地に溶解成長因子(0.4%BPE、0.1%インスリン、0.1%ヒドロコルチゾン、0.1%レチノイン酸、0.1%トランスフェリン、0.1%トリヨードサイロニン、ならびに10%FBS、1%PSA、5ng/mL表皮成長因子(EGF)および70ng/mLホスエタノールアミン。</li>
	</ol>
</li>
	<li>実験の終点で、プレートから媒体を吸引し、無菌1xリン酸緩衝生理食塩酸(PBS)の5mLで細胞を洗浄する。500 μLのリシスバッファー(50 mM Tris pH 8.5、150 mM NaCl、5 mM EDTA、1% 非イデッドP-40(NP40)を使用して氷上に直接置かれたプレート上のLyse細胞は、各P100皿に完全なEDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテルおよび50μM PR-619を補充した。細胞スクレーパーを使用して、プレートの底部から細胞をLysis培地に軽く削り取ります。 メモ:治療後にプレートベースを目視で調べて、すべての細胞がプレートから取り外されていることを確認します。</li>
	<li>あるいは、細胞媒体を吸引してトリプシン化して細胞を採取し、1mLの1mLを1x(0.05%)添加するトリプシンEDTAをプレートに、細胞を覆うのに十分な量で、37°、5%CO2、および95%の湿度で設定されたインキュベーターにプレートを入れ、全ての細胞がプレートから剥離していることを確認する。トリプシン化を停止するために、予め温めた成長培地を2mL加えます。150gで10分間遠心分離し、上清を吸引する。1x PBSで洗浄し、遠心分離機を150 x gで10分間洗浄します。上清を吸引した後、500μLのリシスバッファー(50mMトリスpH 8.5、150 mM NaCl、5 mM EDTA、1%NP40、P100皿ごとに完全なEDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテルおよび50μM PR-619を添加する。 メモ:PR-619の追加は重要です。</li>
	<li>15,500 x gと 4°C で 10 分間遠心分離剤を別のチューブに移し、ペレットを廃棄します。 注:プロトコルはここで一時停止することができ、サンプルはさらなる分析まで-80°Cで保存されます。</li>
</ol>2. 組織の調製とリシス
<ol><li>動物の犠牲に応じて、マウスの肝臓を収集し、冷たいPBSで洗浄し、液体窒素で直ちに凍結をスナップします。さらに分析するまでサンプル−80°Cを保存します。</li>
	<li>氷冷リシスバッファーの1 mLでスナップ冷凍/または新鮮な肝臓から75mgの断片を均質化(50 mM Tris pH 8.5、150 mM NaCl、5 mM EDTA、1%NP40、完全なEDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテルおよび50μM PR-619を補充)。ホモジナイザーを 6500 x rpm、それぞれ 2 x 60 s で実行し、30 s の一時停止を行います (「材料表」を参照)。</li>
	<li>15、500 x g、4 °Cのマイクロフュージでサンプルを10分間遠心分離し、上清を別のチューブに移し、ペレットを廃棄します。</li>
	<li>あるいは、液体窒素中の凍結組織の75mgを三量体化する。次いで、1mLのリシス緩衝液で組織を回収する。</li>
	<li>15、500 x g、4 °Cのマイクロフュージでサンプルを10分間遠心分離し、上清を別のチューブに移し、ペレットを廃棄します。 注:プロトコルはここで一時停止することができ、サンプルはさらなる分析まで-80°Cで保存されます。</li>
</ol>3. グルタチオン・アガロースビーズへのGST-SBEまたはGST制御の結合
注:GST-SBEまたはGSTコントロールの合成は、この原稿の範囲外であり、以前に公開された文献20で見直すことができます。あるいは、GSTおよび制御SEは市販されている(例えば、SignalChem)。
<ol><li>グルタチオンビーズの調製<ol>
<li>凍結乾燥したグルタチオンアガロースビーズの70mgに脱イオン水を1mL加えます。ビーズを4°Cで一晩再構成する(または室温で少なくとも30分間)。</li>
		<li>腫れ上がった後にビーズを十分に洗う(通常凍結乾燥粉末アガロースビーズに存在するラクトースとエタノールを除去する)。これを行うには、まず10mLの脱イオン水またはPBSで洗浄し、続いて室温で5分間300 x gで遠心分離します。このスライスを実行します。</li>
		<li>3本のワッシュを行った後、ビーズを1mLのPBSで再サスペンドし、50%(v/v)スラリーを得た。 注:このボリュームは、10サンプルの分析に適しています。</li>
	</ol>
</li>
	<li>各サンプルについて、GST-SBEまたはGST制御の100μg(参照20)をグルタチオンビーズスラリーの100μLと500 μLのPBSに加えます。 注:目的の相撲タンパク質の相対的な豊富さは、プルダウンに使用されるGST-SEの量を決定します。新しい実験モデルごとに、抗SUMO2/3抗体または目的のタンパク質(肝臓キナーゼB1(LKB1)に対して、ウェスタンブロッティングインプット、結合、フロースルー(FT)材料をウェスタンブロッティングして、実際の実験前の状態を分析します。</li>
	<li>3.2.で調製されたビーズですべてのGST-SBEまたはGST制御をインキュベートし、ローテーターまたはミニローラーでゆっくりと回転(材料表を参照)を4°Cで少なくとも2時間(低速結合反応)します。 注:1 mMジチオトレイトール(DTT)を添加すると、グルタチオンビーズへのGST結合が向上します。</li>
	<li>室温で5分間300 x gで遠心分離してアガロースビーズを回収します。最後に、ビーズをPBSに再懸濁し、50%(v/v)スラリーを得た。 注:プロトコルはここで一時停止することができ、サンプルはさらなる分析まで-80°Cで保存されます。</li>
</ol>4. GSTプルダウンアッセイ
<ol><li>ステップ1.5、2.3または2.5の後、総体積の1/10(例えば50°L)を取り、同じ体積の3倍沸騰緩衝液(250 mM Tris-HCl pH 6.8、500 mM β-メルカプトエタノール、50%グリセロール、10%SDS、ブロモフェノールブルー)を同じ体積で希釈する。この分数は INPUT と見なされます。</li>
	<li>ステップ1.5、2.3、または2.5から100 μLグルタチオンビーズスラリーから450μLの透明なリサートを加えます。ビーズでリサートをインキュベートし、少なくとも2時間4°Cでゆっくりと回転させる。 注:または、ステップ1.5、2.3または2.5(ブラッドフォードアッセイで定量)から100〜200μgの総タンパク質を450μLの総体積で使用することができます。</li>
	<li>300 x gのマイクロフュージでビーズを5分間スピンダウンし、分析のために上清を収集します。全容積の1/10(例えば、50°L)を別々のチューブに移し、3倍沸騰緩衝液の等量で希釈する。この分数は、フロースルー (FT) 分数です。</li>
	<li>残りのサンプルを1 mLの氷冷PBS、0.05%Tween 20で3回洗浄し、4°C、300 x gで1分間スピンダウンし、液体が残らないことを注意深く吸引します。ビーズは、SBE BOUND (SB) 分数に対応します。</li>
	<li>3倍沸騰緩衝液の15°Lとリシスバッファーの15°Lでサンプルを溶出します。これを BOUND 分数と呼ばれます。</li>
</ol>5. ウェスタンブロット分析による相撲目標の同定と特性評価
<ol><li>前に説明したように、抗SUMO2/3抗体または任意の任意の特定の抗体を用いてウェスタンブロット分析を行う。</li>
</ol>6. 質量分析法による相撲分プロテオームの同定と特性評価
注:質量分析(MS)分析の場合、ウィスニエフスキら23で説明したフィルター支援試料調製(FASP)法を用いて試料を処理した。
<ol><li>ステージチップC18マイクロカラムを使用してペプチドを脱塩し、MS分析の前に0.1%ギ酸(FA)で再サスペンドします。</li>
	<li>サンプルを LC-MS システムにロードし (材料表を参照)、トリプリケート (技術的複製) で分析します (図 2b)。</li>
	<li>関連するソフトウェアを使用して、タンパク質の同定と豊富さの計算を続けます。</li>
	<li>統計解析とヒートマップの生成については、Perseus プラットフォーム (http://www.perseus.tufts.edu/hopper/) にデータを読み込みます。豊富な値を比較するために、順列ベースの誤検出率(FDR)補正t検定を適用します。q < 0.05 および SES/GST 比が 2 より大きいタンパク質は、濃縮された 24と見なされました。 注:少なくとも2つの異なるペプチドで同定されたタンパク質は、最終分析において考慮される。</li>
</ol>

<ol><li>Forner, A., Llovet, J. M., Bruix, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma.</a> Lancet. 379 (9822), 1245-1255 (2012).</li>
<li>Gerbes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+roundtable+meeting+paper%3A+selected+recent+advances+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Gut roundtable meeting paper: selected recent advances in hepatocellular carcinoma.</a> Gut. , (2017).</li>
<li>Avila, M. A., Berasain, C., Sangro, B., Prieto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+therapies+for+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">New therapies for hepatocellular carcinoma.</a> Oncogene. 25 (27), 3866-3884 (2006).</li>
<li>Grotenbreg, G., Ploegh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+biology%3A+dressed-up+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemical biology: dressed-up proteins.</a> Nature. 446 (7139), 993-995 (2007).</li>
<li>Hendriks, I. A., Vertegaal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+compilation+of+SUMO+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A comprehensive compilation of SUMO proteomics.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 17 (9), 581-595 (2016).</li>
<li>Seeler, J. S., Dejean, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO+and+the+robustness+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">SUMO and the robustness of cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (3), 184-197 (2017).</li>
<li>Tomasi, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-adenosyl+methionine+regulates+ubiquitin-conjugating+enzyme+9+protein+expression+and+sumoylation+in+murine+liver+and+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">S-adenosyl methionine regulates ubiquitin-conjugating enzyme 9 protein expression and sumoylation in murine liver and human cancers.</a> Hepatology. 56 (3), 982-993 (2012).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cbx4+governs+HIF-1alpha+to+potentiate+angiogenesis+of+hepatocellular+carcinoma+by+its+SUMO+E3+ligase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cbx4 governs HIF-1alpha to potentiate angiogenesis of hepatocellular carcinoma by its SUMO E3 ligase activity.</a> Cancer Cell. 25 (1), 118-131 (2014).</li>
<li>Zubiete-Franco, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMOylation+regulates+LKB1+localization+and+its+oncogenic+activity+in+liver+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">SUMOylation regulates LKB1 localization and its oncogenic activity in liver cancer.</a> EBioMedicine. 40, 406-421 (2019).</li>
<li>Sarge, K. D., Park-Sarge, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO+and+its+role+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Internationa+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">SUMO and its role in human diseases.</a> Internationa Review of Cell and Molecular Biology. 288, 167-183 (2011).</li>
<li>Da Silva-Ferrada, E., Lopitz-Otsoa, F., Lang, V., Rodriguez, M. S., Matthiesen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+Identify+Recognition+Signals+and+Targets+of+SUMOylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Research+International%22%5BJournal%5D)">Strategies to Identify Recognition Signals and Targets of SUMOylation.</a> Biochemical Research International. , 875148(2012).</li>
<li>Liang, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO5%2C+a+Novel+Poly-SUMO+Isoform%2C+Regulates+PML+Nuclear+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">SUMO5, a Novel Poly-SUMO Isoform, Regulates PML Nuclear Bodies.</a> Science Reports. 6, 26509(2016).</li>
<li>Mikolajczyk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+ubiquitin-related+modifier+%28SUMO%29-specific+proteases%3A+profiling+the+specificities+and+activities+of+human+SENPs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biologucal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Small ubiquitin-related modifier (SUMO)-specific proteases: profiling the specificities and activities of human SENPs.</a> Journal of Biologucal Chemistry. 282 (36), 26217-26224 (2007).</li>
<li>Hilgarth, R. S., Sarge, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+sumoylated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection of sumoylated proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 301, 329-338 (2005).</li>
<li>Vertegaal, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteomic+study+of+SUMO-2+target+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A proteomic study of SUMO-2 target proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33791-33798 (2004).</li>
<li>Bruderer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+identification+of+endogenous+polySUMO+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Purification and identification of endogenous polySUMO conjugates.</a> EMBO Reports. 12 (2), 142-148 (2011).</li>
<li>Becker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+endogenous+SUMO+targets+in+mammalian+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detecting endogenous SUMO targets in mammalian cells and tissues.</a> Nature Structural Molecular Biology. 20 (4), 525-531 (2013).</li>
<li>Barysch, S. V., Dittner, C., Flotho, A., Becker, J., Melchior, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+analysis+of+endogenous+SUMO1+and+SUMO2%2F3+targets+in+mammalian+cells+and+tissues+using+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Identification and analysis of endogenous SUMO1 and SUMO2/3 targets in mammalian cells and tissues using monoclonal antibodies.</a> Nature Protocols. 9 (4), 896-909 (2014).</li>
<li>Hendriks, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+characterization+of+endogenous+SUMOylation+across+species+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Site-specific characterization of endogenous SUMOylation across species and organs.</a> Nature Communications. 9 (1), 2456(2018).</li>
<li>Da Silva-Ferrada, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+SUMOylated+proteins+using+SUMO-traps%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Analysis of SUMOylated proteins using SUMO-traps.</a> Science Reports. 3, 1690(2013).</li>
<li>Hjerpe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+protection+and+isolation+of+ubiquitylated+proteins+using+tandem+ubiquitin-binding+entities%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient protection and isolation of ubiquitylated proteins using tandem ubiquitin-binding entities.</a> EMBO Reports. 10 (11), 1250-1258 (2009).</li>
<li>Embade, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+double+minute+2+regulates+Hu+antigen+R+stability+in+human+liver+and+colon+cancer+through+NEDDylation%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Murine double minute 2 regulates Hu antigen R stability in human liver and colon cancer through NEDDylation.</a> Hepatology. 55 (4), 1237-1248 (2012).</li>
<li>Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).</li>
<li>Meier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+Parallel+Accumulation-Serial+Fragmentation+%28PASEF%29+with+a+Novel+Trapped+Ion+Mobility+Mass+Spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Online Parallel Accumulation-Serial Fragmentation (PASEF) with a Novel Trapped Ion Mobility Mass Spectrometer.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 17 (12), 2534-2545 (2018).</li>
<li>Ritho, J., Arold, S. T., Yeh, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Critical+SUMO1+Modification+of+LKB1+Regulates+AMPK+Activity+during+Energy+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Critical SUMO1 Modification of LKB1 Regulates AMPK Activity during Energy Stress.</a> Cell Reports. 12 (5), 734-742 (2015).</li>
<li>Lang, V., Da Silva-Ferrada, E., Barrio, R., Sutherland, J. D., Rodriguez, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Biotinylated+SUMO-Traps+to+Analyze+SUMOylated+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Using Biotinylated SUMO-Traps to Analyze SUMOylated Proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1475, 109-121 (2016).</li>
<li>Xolalpa, W., Rodriguez, M. S., England, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Surface+Plasmon+Resonance+%28SPR%29+for+the+Analysis+of+Interactions+Between+SUMO+Traps+and+Mono-+or+PolySUMO+Moieties%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Real-Time Surface Plasmon Resonance (SPR) for the Analysis of Interactions Between SUMO Traps and Mono- or PolySUMO Moieties.</a> Methods in Molecular Biology. 1475, 99-107 (2016).</li>
</ol>

マルティネス・シャンタル博士は、ミトセラペティクス合同会社にアドバイスを提供しています。

本明細書では、肝臓癌の生体内モデルにおける相化タンパク質の濃縮、単離および同定および特徴付けのためのSUBEsの使用を報告する方法論の完全かつ詳細な説明を提供した。マウス肝腫瘍とヒト肝腫細胞の両方において、目的とする相撲タンパク質を正しく単離して同定し、相撲化プロテオームとインターアクテオームの高スループット特性評価を行うことができました。SBEの合成は本原稿の範囲外ですが、詳細については、以下の参考文献を26で見る必要があります。記載されたプロトコルは、高速かつ非常に敏感であり、プロトコルの重要なステップは、SENP阻害剤(PR-619)の使用を含む。あるいは、LYSis緩衝液中のNEM(N-エチルマライドミド)やIAA(2-ヨードアセトアミド)などの化学的イソペプチダーゼ阻害剤を使用することができますが、以前の報告では、SUBEsプロトコルの場合、PR-619の使用は他の方として有利であることが示されています。阻害剤は、グルタチオンビーズ20へのGST結合を妨害する。
SESは、MSのタンデム繰り返しを含む組換えタンパク質であり、それによって、SUMO基質に対する全体的な親和性の増加に伴って、修飾タンパク質上の相撲分子を認識する。その高い特異性と感受性のために、相撲化プロテオームの単離のためのSESの使用は、に対する抗体を用いた特定の相撲タンパク質のウェスタンブロットによる検出のような文献の他のアプローチに比べて有利であるSUMO分子の異なるヒスチジンタグ付きバージョンを使用して、目的のタンパク質またはニッケルクロマトグラフィー。しかし、SUBEsプロトコルが非変性条件下で行われるように、相撲化タンパク質と他の相互作用タンパク質との相互作用が維持されることを考慮する必要があります。そこで、相撲化標的タンパク質のリストではなく、相撲相互作用に関する情報を得る。したがって、同定されたタンパク質がSUMO標的であるか相互作用因子であるかを確認するために、さらなる実験が必要である。SESの他の制限は、使用される制御GSTトラップが酸化ストレスに関連する多くのバックグラウンドタンパク質を捕捉することができるという事実である。この問題は、この手法の感度が高いため、MS 分析中に特に関連します。これらの制限を克服するために、ビオチン化相撲(bioSUBEs)は26を開発した。SBEのもう一つの制限は、相撲2と相撲3によって修飾されたタンパク質しか捕捉できないのに対し、相撲1変性タンパク質は単離できないという事実にあります。
SES の使用に関するその他の懸念事項は、手順に必要な開始材料の量に関連しています。SUMOy化タンパク質の捕捉に使用される出発物質は、探索されたさまざまな実験条件を考慮する必要があります。基底相撲は様々な細胞文脈で報告されているが、相撲化は、複数のストレス条件/刺激の後に強く誘導されるプロセスである。未処理サンプルと処理サンプルを比較する場合は、カラムが飽和していないことを確認する必要があり、それらの条件間の差異を確認できます。我々が分析しているマウス表現型の場合、治療法は使用されておらず、基礎相撲度レベルは低い。このため、多量のタンパク質が用いられた。バックグラウンド レベルは GST を使用して制御する必要があり、非特異的バインドが高い場合は、開始材料または結合時間を減らす必要があります。FT画分の分析は、これらのトラップがポリ相撲タンパク質を好み、全枯渇が期待できない場合でも捕捉効率を示すことができ、捕獲効率が一般的に観察される場合には総相撲量の減少がよく観察される最適。
最後に、SUBEs技術の他の応用は、リアルタイム表面プラズモン共鳴(SPR)とSUBEs技術の組み合わせを含み、細胞抽出物27からの相撲タンパク質とのリアルタイム相互作用を可能にする。また、より最近では、ビオチン化相撲(bioSUBEs)は、より大きなタグに関連する背景を減少させる利点を有して開発されている、例えば、質量分析解析中の26。さらに、bioSUBEバージョンは、ビオチンに対するストレプトアビジン結合を利用して、ステレプトアビジン標識を有するステレプトアビジン標識を用いて蛍光によって生細胞内の相撲化タンパク質を検出するために使用することができる。また、相撲化タンパク質の検出および定量のための方法は、タンデムユビキチン結合エンティティ(TUBEs)21で行われたようなGSTおよびbioSUBEsバージョンの両方で考えることができる。
全体的に、肝臓癌に関連する相撲化プロテオームの分離および特徴付けのためのSESの使用は、肝臓癌における相続的なにおいて、まだ未知の役割に関する膨大な情報を提供する迅速かつ敏感な方法である。

肝臓癌は世界で6番目に多い癌であり、癌関連死の第2の原因1.肝細胞癌(HCC)は原発性肝癌の最も一般的な形態である。歴史的に, HCCの発症のための一般的な危険因子は、慢性B型肝炎またはC型肝炎感染と虐待アルコール摂取が含まれていました.過去数十年において、メタボリックシンドロームは、2型糖尿病非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)がHCC2の発症の危険因子として浮上している。HCCは非常に異種であり、フェノタイプと遺伝的両方で、シグナル伝達経路の複雑なネットワークが破壊される。ここ数年、HCCの病因に関与する分子経路に関する知識が増加しているにもかかわらず、HCC管理に有効な治療アプローチはまだありません。多くの経路はHCCで活性化され、1つを阻害することは、一般に他の経路3による補償を駆動する。これは、HCCを治療する際の主な困難の一つとなっています。したがって、よりグローバルなアプローチは、例えば、複数のシグナル伝達経路がタンパク質のPTMによって同時に調節され得るとして、例えば、翻訳後修飾(PTM)を標的とする肝癌の臨床管理のための潜在的な治療アプローチを提供し得る。
翻訳後修飾は、タンパク質恒常性および機能4を調節する主要なメカニズムと考えられている。構造的および機能的変化はPTMによって導入され、それによってプロテオームの多様性が増加する。最も一般的なPTMには、リン酸化、メチル化、アセチル化、グリコシル化、ユビキチン化、ユビキチン様タンパク質(UbLs)の結合が含まれます。すべてのUbLの中で、SUMO(小ユビキチンMOdifier)によるタンパク質修飾は、転写、細胞局在、DNA修復、細胞周期進行を含む様々な細胞プロセスにおける重要な役割と関連して注目されています。5.近年、肝臓癌6、7、8、9において相撲化が改変されたことが示され、及び特定タンパク質の相撲化の変化が進行に役割を果たしていることが記載されている。がん関連疾患9.
哺乳類には、相撲1~相撲5回の相撲類があります。現在までに、内因性相撲4および内因性相撲5相のタンパク質レベル10、11、12における内因性相位相の存在に関する実験的証拠は存在しない。哺乳動物中の相撲化は、ヘテロ二量体相活性酵素(SAE1/SAE2)またはE1、相撲共役酵素(Ubc9)またはE2および各標的タンパク質に特異的なSUMO-E3-リガーゼを含む酵素チオールエステルカスケードによって行われる。SUMO E3sのいくつかのファミリーの作用は、相撲特有のプロテアーゼ(SUSPsまたはSP)13との動的平衡状態にあるように見え、相撲化反応は非常に可逆的である。また、相撲タンパク質と非相撲全タンパク質のごく一部しか存在しない。それにより、生体内で内因性相撲タンパク質を単分化することは、むしろ困難な13である。
生体内での相撲化は、最初に目的のタンパク質14に対する抗体を用いてウェスタンブロットによって研究された。タンパク質の免疫沈降を特異的抗体で行い、次いでPAGE-Westernブロットを抗SUMO抗体で行った。この戦略の主な問題は、非修飾組換えタンパク質に対して生成された抗体が、常に相撲化されたタンパク質の形態を免疫沈降できるわけではないということです。あるいは、ヒスチジンタグ付き(His6)バージョンのSUMO分子および目的のタンパク質の一過性発現後のニッケルクロマトグラフィーは、細胞内の相撲化を研究するために使用されている。これに基づいて、His6-SUMO15を安定して発現する細胞から相撲改変形態を検出することがより便利になります。生体内研究では、ポリSUMOコンジュゲート16の精製のためにタンデム相撲モチーフ(SIM)ベースの濃縮が実証された。他のグループは、エピトープタグ付き抗体SUMOアプローチを使用して、原発細胞、組織、および器官17、18における内因性相撲を調査するための実行可能なツールを提供している。さらに最近では、ニールセンたちは抗体ベースの濃縮を用いて、細胞および組織19において内因性および部位特異的なSUMOを同定した。
生体内における相撲の役割に関する補完的な情報を提供するために、相撲トラップとしても知られる相撲結合エンティティ(SES)を開発した。関連性のうち、タンデムユビキチン結合エンティティ(TUBEs)は、SESの概念的前駆体と考えられ、ポリウビキチン化タンパク質21の検出および単離のための市販のツールである。SESは、MSのタンデム繰り返しを含む組換えタンパク質であり、それによって、SUMO基質に対する全体的な親和性の増加に伴って、修飾タンパク質上の相撲分子を認識する。相撲は、E3ユビキチンタンパク質リガーゼRNF4由来SIM2およびSIM3モチーフをタンデムに導入することにより、異種キャリアタンパク質20であるグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)を含有するベクターに設計された。SBEを適切に使用して単相化標的タンパク質を同定することはできませんが、この方法は、生体内のポリ相撲標的タンパク質の精製と同定を容易にするツールを提供します。本明細書では、ヒト肝腫細胞とマウス肝生検の両方で相撲化タンパク質を単離するSESの応用について説明する。この原稿に記載されているプロトコルの全体的なスキームを図1に示します。

<table><tbody><tr><td>(gnmt&minus;/&minus;)/ (Gnmt+/+) マウス</td><td>CIC bioGUNE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5% トリプシン-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>BEBM</td><td>Lonza/Clonetics Corporation</td><td>cc-3171</td><td></td></tr><tr><td>BEGM Bullet Kit</td><td>Lonza/Clonetics Corporation</td><td>CC3170</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>Σ</td><td>115-39-9</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Σ</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>C18マイクロカラム</td><td>ミリポア</td><td>Z720070</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲンI型</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-136157</td><td></td></tr><tr><td>完全錠剤 EDTAフリー</td><td>ロシュ</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>A14431-01</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma</td><td>e9644</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td>Life Technologies</td><td>33010018</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>グルタチオン アガロース ビーズ</td><td>Sigma</td><td>G4510</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>GST-Control</td><td>SignalChem</td><td>G52-30H</td><td></td></tr><tr><td>GST-SUBEs</td><td>SignalChem</td><td>S291-340G</td><td></td></tr><tr><td>Huh7</td><td>CLS (Cell Lines Service)</td><td>300156</td><td>https://clsgmbh.de/</td></tr> <tr><td>IAA (2-ヨードアセトアミド)</td><td>Merck</td><td>L58046844</td><td></td></tr><tr><td>LKB1 antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-32245</td><td></td></tr><tr><td>Mini LabRoller Rotator</td><td>LABNET</td><td>H5500</td><td>https://www.labnetinternational.com</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>メルク</td><td>106404041000</td><td></td></tr><tr><td>nanoElute</td><td>ブルーカー</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>https://www.bruker.com/ NEM (N-エチルマレイミド)</td><td>シグマ</td><td>E3876</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>フルーカ</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 14190-094</td><td></td></tr><tr><td>ピークス ソフトウェア</td><td>バイオインフォマティクスソリューションズ株式会社</td><td></td><td>http://www.bioinfor.com/</td></tr> <tr><td>ホスホエタノールアミン</td><td>シグマ</td><td>P0503</td><td></td></tr>ポン<tr><td>ソーS溶液</td><td>シグマ</td><td>P7170</td><td></td></tr><tr><td>PR-619</td><td>メルク</td><td>662141</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24</td><td>Bertin Technologies</td><td>P000669-PR240-A</td><td></td></tr><tr><td>PSA</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ151-40-122</td><td></td></tr><tr><td>PSG</td><td>ライフテクノロジー</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>SUMO2/3 抗体</td><td>Abcam</td><td>Ab3742</td><td></td></tr><tr><td>THLE-2</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-2706</td><td>http://www.lgcstandards-atcc.org</td></tr><tr><td>timsTOF Pro with PASEF質量分析計</td><td>BRUKER</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>https://www.bruker.com/&-mercaptoethanol</td><td></td><td>Sigma 60-24-2</td><td></td></tr></tbody></table>

肝癌における相撲プロテオームの濃縮、単離、同定、特性評価のためのツールとしての相撲結合エンティティ(ses)

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

翻訳後修飾は、真核細胞におけるタンパク質恒常性および機能を調節する重要なメカニズムである。肝臓癌におけるすべてのユビキチン様タンパク質の中で、SUMO(小型ユビキチンMOdifier)による改変が最も注目されている。生体内の内因性相撲タンパク質の単離は、活性相撲の存在により困難である。生体内における相撲化の初期研究は、特定の相撲タンパク質の分子検出(例えば、ウェスタンブロットによる)に基づいていた。しかしながら、多くの場合、抗体は、一般に非修飾組換えタンパク質で作られ、目的とするタンパク質の相撲化形態の免疫沈降をしなかった。ニッケルクロマトグラフィーは、SUMO分子のヒスチジンタグ付きバージョンを捕捉することによって相撲化を研究するもう一つのアプローチとなっています。このアプローチは、主にHis-SUMO分子を安定に発現または一過性にトランスフェクトする細胞で使用されます。これらの制限を克服するために、相撲結合系エンティティ(SES)は、内因性スモジル化タンパク質を単離するために開発されました。本明細書では、SESを用いて肝臓癌マウスモデルからのヒト肝腫細胞および肝組織からの相撲化基質の濃縮、単離、および同定に必要なすべてのステップについて説明する。まず、ヒト肝腫細胞および肝腫瘍組織サンプルの調製およびリシスに関与する方法について説明する。次に、SESおよび制御の調製について、タンパク質プルダウンアッセイのプロトコルと共に詳細に説明する。最後に、相撲プロテオームの同定と特性評価、すなわち肝腫瘍からの特定の相撲化基質の検出のためのウェスタンブロット分析の使用または使用に関するいくつかの例が提供される血腫細胞における相撲化プロテオームと相互作用の高スループット特性評価のための質量分析法によるプロテオミクスの

ウェスタンブロット解析による肝腫瘍生検における特定の相撲化基質の同定
肝キナーゼB1(LKB1)相撲化は、最近、肝臓癌9、25における重要な発癌性ドライバであることが示されている。グリシンN-メチルトランスフェラーゼ(Gnmt)に欠乏しているマウスは、しばしばGnmt−/−と呼ばれ、原発性肝癌の最も一般的なタイプである肝細胞癌(HCC)を自発的に発症するモデルである。SUBEsは、肝臓癌マウスとその野生型ゴミ類(Gnmt+/+)を有するGnmt−/−マウスの両方で相撲タンパク質を濃縮および分離するために使用された。図2aには、SESプルダウンアッセイで得られた3つの異なる画分(入力、FTおよびBOUND)のポンソーS染色が含まれる。ポンソーS染色は、ウェスタンブロットによって評価されるブロットタンパク質の負荷に対する有害な影響を制御するのに有用である。図2bに、SESを用いて内因性相撲LKB1を捕捉することによりLKB1のウェスタンブロット分析を行う。LKB1相撲のレベルは、肝腫瘍で増強されます.ウェスタンブロット分析の場合、等しい負荷および転写されたタンパク質は、入力分画のポンソー染色によって観察され、ワッシュ後に有意に変化しなかった(分画を通る流れ)。SESで捕捉されたタンパク質の量は、特に腫瘍において有意に高かった。あるいは、クマシーブルーで重複ゲルを染色すると、同様の情報を提供することができます。p53や相撲化されたタンパク質のような粘着性タンパク質は、GSTコントロールに結合する可能性があります。背景を取り除くために、低密度アガロースビーズを使用するか、BSAでコーティングを行うか、追加のワッシュを組み込みます。ただし、これは質量分析などのアプリケーションに影響を与える可能性があり、低親和性相互作用タンパク質の損失につながる可能性があります。
質量分析によるヒト肝腫細胞における相撲の特徴
自然に相撲化タンパク質と相互作用する相撲トラップの容量を調べるために、Huh-7(ヒト肝腫)および非形質転換肝上皮ヒトTHLE2細胞株を使用した。最初のステップは、SES でキャプチャされた合計材料の可視化と、GST を負のコントロールとして使用することです。この目的のために、図3aに示すように、従来のタンパク質染色プロトコルを使用することができる。次に、質量分析を行った。2268個のタンパク質がHuh7 GSTサンプル(それぞれ負荷ごとに2339、2297、2168)で同定されたのに対し、2812個のタンパク質はHuh7 SUBEsサンプル(2815、2817および2806)で平均的に同定された。減算後、742タンパク質がSESに濃縮された。一方、THLE2 GSTサンプル(それぞれ2476、2520、2495)では平均2497個のタンパク質が同定され、2763個がSES(2823、2783、2684)で同定された。これらのうち、577はSBEサンプルに富化されていると考えられた。技術的な反復の分析は、使用可能なデフォルト設定(ユークリッド距離、平均リンケージ、k平均で前処理)を使用して計算された図3bに示すヒートマップを取得します。ヒートマップは、各細胞株における100個の最も有意かつ排他的に濃縮されたタンパク質の分布を示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60098/60098fig01.jpg"> 図1:肝臓癌の研究のために生体内の相撲化プロテオームの濃縮、単離および同定および特徴付けに用いられるプロトコルフローチャートの概略図。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60098/60098fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60098/60098fig02.jpg"> 図2:肝細胞癌のマウスモデルにおける相撲-2によるLKB1の改変 (a)SESプルダウンアッセイで得られた3つの異なる画分(入力、フロースルー(FT)およびBOUND)のポンソーS染色。(b)相撲結合エンティティ (SES) を使用して内因性相撲 LKB1 を捕捉することにより、LKB1 のウェスタン ブロット分析;GAPDH はローディング制御として使用されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60098/60098fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60098/60098fig03.jpg"> 図3:腫瘍Huh-7と非形質転換肝臓上皮THLE2ヒト細胞株との相撲プロテオームの違い。 (a)捕捉されたタンパク質材料のシプロ染色、GST(陰性対照)およびSESを用いた。(c) Huh-7およびTHLE2 SUBEサンプルにおける微分的に濃縮されたタンパク質を描写したヒートマップ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60098/60098fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、SUMO結合系エンティティ(SES)を用いて肝細胞癌のマウスモデルから得られたヒト肝腫細胞および肝腫瘍の両方から、生体内で相撲によって修飾されたタンパク質を濃縮、単離、同定、および特徴付けるプロトコルを提示する。

肝癌における相撲プロテオームの濃縮、単離、同定、特性評価のためのツールとしての相撲結合エンティティ(SES)

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

SUMO結合性エンティティは、生体内で内因性のSUMOylate化タンパク質を単離することを可能にする。これは、活性なSUMO特異的プロテアーゼの存在と、生体内のSUMOylatedタンパク質の低分画により、かなり困難です。SUMO結合性エンティティを用いたSUMOのタンパク質の分離は、SUMO基質に対する全体的な親和性の増加を遅らさせるため有利である。これは、SIのタンデム反復を含むタンパク質に共通のSubEsが存在するため、改変タンパク質に特異的にSUMO分子を認識します。SUMO結合エンティティを肝臓癌におけるSUMOylatedプロテオームの単離および特性評価に使用することは、迅速かつ敏感な方法である。これは、潜在的な治療アプローチにおける肝臓癌におけるSUMOylation経路のかなり未知の役割に関する過去の情報を提供する。SUMO結合体は、ヒトの標本や動物モデルの両方から、またいくつかの細胞モデルから、肝臓以外の他の組織でSUMOylatedプロテオームを分離し、特徴付けるために使用することができます。この手法は簡単に実行できますが、同じ種類の複数のサンプルを分析する場合は注意が必要です。いくつかのステップにクーラーキューブ。そのため、この実験を開始する前にチューブを慎重に平準化することをお勧めします。SUMO結合エンティティの使用の視覚的なデモンストレーションは、特に、プロトコル中にビットを処理する困難と材料の損失のために、このプロトコルの革命を容易にします。ヒト肝腫細胞は、P100プレートの細胞を1皿あたり1.2~150万個の密度でめっきして、37°Cの標準成長培地に維持してきました。細胞を使用する準備ができたら、プレートから培地を吸引し、滅菌PBSの5ミリメートルでそれらを洗浄します。氷の上にプレートを置き、原稿の指示に従って補足された500マイクロリットルのリシスバッファーを追加します。その後、セルスクレーパーを使用して、プレートの底から細胞をそっと擦り落とし、リシス培地に入ります。あるいは、トリプシン法で細胞を収穫し、細胞が覆われていることを確認するプレートにトリプシン-EDTAの1ミリリットルを加えます。プレートを37°Cのインキュベーターに5分間入れてプレートから取り外しできるようにし、2ミリリットルの事前温め成長培地を加えてトリプシンを止めます。150回Gで細胞を10分間遠心し、上清を吸引する。その後、PBSと遠心分離機でさらに10分間細胞を洗います。上清を吸引し、500マイクロリットルのリシスバッファーを加えます。15000倍Gで、摂氏4度で10分間のリーゼ細胞を遠心分離し、上清を新鮮なチューブに移し、ペレットを捨てます。収穫されたマウスの肝臓を使用する準備ができたら、氷冷ライシスバッファーの1ミリリットルで新鮮またはスナップされた凍結断片の75ミリグラムを均質化します。原稿の指示に従ってホモジナイザーを実行します。組織均質化後、試料を15000倍Gで遠心し、摂氏4度で10分間遠心する。上清を新鮮なチューブに移し、ペレットを捨てます。70ミリグラムのビーズに1ミリリットルの脱イオン水を加え、4つのデグレス摂氏で一晩再構成して、グルタチオンビーズを準備します。膨潤した後、10ミリリットルの脱イオン水またはPBSでビーズを3回洗浄し、各洗浄後5分間300倍Gで遠心分離する。このビールを1ミリリットルで再懸濁し、100マイクログラムのGST-SUBEsまたはGSTコントロールで各サンプルに対して50%スラリーを得て、グルタチオンビーズスラリーの100マイクロリットルおよびPBSの500マイクロリットルを得る。回転しながら少なくとも2時間摂氏4度で混合物をインキュベートし、その後、5分間Gの300倍で遠心分離によってビーズを回収し、PBSで再中断する。以前に調製した細胞の10%を取り、3倍の沸騰バッファーの等量で希釈します。450マイクロリットルの清浄化されたライセートを100マイクロリットルのグルタチオンビーズスラリーに加えます。ゆっくりと回転しながら、少なくとも2時間、ビーズを摂氏4度でインキュベートします。インキュベーション後、ビーズをGの300倍5分間回転させ、上清を回収して分析します。総体積の10%を別のチューブに移し、等量の3倍の沸騰バッファーを追加します。残りのサンプルを05%Tween 20で1ミリリットルの氷冷PBSを加え、300倍Gと摂氏4度で1分間回転させて3回洗浄します。上清を慎重に吸引し、液体が残らないようにします。次に、3X沸騰バッファーの15マイクロリットルと15マイクロリットルの溶菌バッファーでサンプルを溶出します。原稿の指示に従って、ウェスタンブロット分析を実行します。質量分析を行う場合は、ステージチップC18マイクロカラムを使用してペプチドを脱塩し、分析前に0.1%ギ酸に再懸濁します。LC-MS システムにサンプルをロードし、三重で分析します。関連ソフトウェアを使用して、タンパク質の同定と豊富な計算を進めます。原稿の指示に従って統計解析を行う。このプロトコルは、グリシンN-メチルトランスレーゼ欠乏症を有するマウスのSUMOylatedタンパク質を分離するために使用されており、肝臓癌および野生型のごみを自発的に発症する原因となっている。Ponau S染色は、入力、フロースルー、およびSUBEsプルダウンアッセイからのBOUNDフラクションで行った。SubEsで捕捉されたLKB1のウェスタンブロット分析は、LKB1 SUMOylationのレベルが肝腫瘍で増強されていることを示している。ヒト肝細胞および非形質肝上皮細胞を用いて、SUMOトラップが天然のSUMOylate化タンパク質と相互作用する能力を調べた。まず、従来のタンパク質染色を用いて、SubEsで捕捉された全材料を可視化した。その後、質量分析法は、742タンパク質が肝細胞SUBEサンプルで濃縮され、577タンパク質が肝臓上皮非形質細胞SUBEサンプル中に濃縮されたことを示した。SUBEを用いて実験を行う場合、SUMOylatedの純度を維持するためには、氷上の細胞や組織を維持し、特定のミリリットルをリシスバッファーに加えておく必要があります。SUBEを用いたSUMOylate化プロテオームの可視化後、ウェスタンブロット分析または質量分析法のいずれかを使用して特性評価を見つけることができます。SEを肝臓癌組織および肝細胞におけるSUMOylatedプロテオームを単離し、特徴付ける応用は、潜在的な治療メカニズムを提供する可能性のある肝癌におけるSUMOの翻訳後修飾の役割を探求する道を開いている。

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生物化学

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既存のアルゴリズムは、バイオ マーカー検出データセットの 1 つのソリューションを生成します。このプロトコルは、複数の同様に有効な解の存在を示し、提案の挑戦のためのデータセットの調査生物医学の研究のためのユーザーフレンドリーなソフトウェアを示します。コンピューター科学者は、彼らのバイオ...

同様に効果的な二値分類性能を持つ複数のバイオ マーカーのサブセットを選択

相撲は必須で高度に保存された、小さなユビキチンのような修飾タンパク質です。このプロトコルでは、ストレス耐性組換え相撲捕捉タンパク質 (kmUTAG)...

蛍光相撲捕集タンパク質を用いた SUMO 修飾タンパク質の局在化

このプロトコルは、治療または表現型などの特定の状態に関連するこれらの種類の翻訳後修飾(PTM)の変化を同定するために、ユビキチン(Ub)およびユビキチン様(Ubls)特異的プロテオームを確立することを目的としています。...

ユビキチンおよびユビキチン様依存性翻訳後修飾のプロファイリングと有意な変化の同定

本プロトコルは、トポイソメラーゼ阻害剤およびホルムアルデヒドによって誘導されるユビキチン化、SUMO化、およびADPリボシル化を含む、DNA-タンパク質架橋(DPC)およびそれらの翻訳後修飾(PTM)を検出および定量するための改変方法を強調し、それによってDPCおよびそのPTMの形成および修復の研究を可能にする。...

DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

ユビキチン化は細胞内タンパク質機能の重要な調節因子です。ここでは、哺乳類細胞における基質タンパク質のユビキチン化レベルを検出するための2つの細胞溶解法を説明し、それらのユビキチン化レベルの解析効果を比較します。HEK293T細胞内のタンパク質過剰発現は一時的なトランスフェクションによって誘導され、ウビキチン化タンパク質はウェスタンブロット解析によって検出されました。...

SMAD2/SMURF2をモデルとした哺乳類細胞溶解液におけるユビキチン検出の比較戦略

学ぶ SUMO結合エンティティを用いた肝癌におけるSUMO化プロテオームの濃縮・単離・同定・特性評価の手法。ヒト肝芽細胞とマウス肝腫瘍を用いて、SUMO化経路の役割を解明し、治療標的としての可能性を探索する。

肝癌における相撲プロテオームの濃縮、単離、同定、特性評価のためのツールとしての相撲結合エンティティ(SES)

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