Name: 巨大ウイルス混合物分離のための蛍光活性化細胞選別の代替戦略としての単一細胞マイクロ吸引 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: 学ぶ単一細胞マイクロ吸引法によるVermamoeba vermiformisを用いた低豊度巨大ウイルス分離技術。Usurpatvirus LCD7の分離成功例を含む、ウイルス学における新たな分離・解析手法の確立に貢献する。

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著者たちは、ジャン=ピエール・ボードゥアンとオリヴィエ・ムバレクのアドバイスとクレア・アンドレアニの英語の修正と修正に関する彼女の助けに感謝したいと思います。この作品は、ANR-10-IAHU-03(メディテラネ感染症)とレジオン・プロヴァンス・アルプを参照する「投資・ダベニール(未来への投資)」プログラムの下で、国家研究機関が管理するフランス国家からの助成金によって支援されました。コートダジュールとヨーロッパの資金調達フェデラープリミ。

1. アメーバ文化
<ol><li>細胞サポートとしてベルマメーバ・バーミフォルミス(株CDC19)を使用してください。</li>
	<li>プロテアーゼ-ペプトン-酵母エキスグルコース培地(PYG)(表1)とアメーバの3mLを75cm2細胞培養フラスコに1x10 6細胞/mLの濃度で加えます。</li>
	<li>培養を28°Cに保つ。</li>
	<li>48時間後、カウントスライドを用いてアメーバを定量する。</li>
	<li>すすぐために、細胞を1x 106細胞/mLの濃度で採取し、720 x gで遠心分離してアメーバを10分間ペレット化し、上清を除去し、適切な量の飢餓媒体でペレットを再び踏み込み、1 x 10 6を得るセル/mL (表 1)</li>
</ol>2. アメーバにおけるストックウイルスの伝播
注:希釈する前に、十分な新鮮な培養を得るためにストックサンプルを培養し、次いで濾過に進むことが重要である。
<ol><li>飢餓培地でアメーバ培養物の1 x 106を使用してください。</li>
	<li>0.01の多重性(MOI)での細胞支持に関する共培養プロセスの後に、原液(ファウストウイルス/ウスルパティウイルスLCD7またはファウストウイルス/クランデスチノウイルスST1)から発行されたウイルスの混合物を接種する。 注:MOIは、主要なウイルス集団の豊富さと感染細胞の数を減らすために重要です。</li>
	<li>細胞障害効果(CPE)が誘導されるまで30°Cでインキュベートし、例えばアメーバル丸めやリジス、感染後約10〜14時間。</li>
	<li>メディアを収集し、5 μm フィルタを使用して濾過し、細胞の破片を除去します。</li>
</ol>3. 終点希釈
<ol><li>飢餓培地中のウイルス試料のシリアル希釈(10-1~10-11)を行う(表1)。 </li>
	<li>各ペトリ皿に含まれる1 x 106 Vermamoeba vermiformisの2 mLを、混合物接種体の100μLで接種する。</li>
	<li>ペトリ皿を30°Cの密封可能なビニール袋に入れます。</li>
	<li>6時間後の感染時に逆光学顕微鏡でペトリ皿の観察を開始し、4~8時間ごとに細胞形態を確認します。</li>
	<li>細胞の丸めを特徴とする細胞障害効果の出現時に、単一細胞マイクロ吸引プロセスを開始する。</li>
</ol>4. 単一細胞マイクロ吸引
<ol><li>
ホストを準備します。 注:この調製物は、感染した単一細胞を新鮮な細胞サポートに放出するために行われます。<ol>
<li>10 μg/mL のバンコマイシン、10 μg/mL のイミペネム、シプロフロキサシンの 20 μg/mL、ドキシサイクリンの 20 μg/mL、および 20 μg/mL のボリコナゾールを含む抗菌剤で培養中のアメーバを処理します。この混合物は、細菌や真菌の汚染を避けるために使用されます。 注:プロシージャは微生物学的安全ステーションの外のベンチで行われる。1 x 106セル/mLに濃縮されたアメーバをそれぞれ15ペトリ料理に加えます。アメーバの付着のために、30°Cで30分間培養をインキュベートする。</li>
	</ol>
</li>
	<li>以下の基準に従って限界希釈からマイクロ吸引に使用されるペトリ皿を選択する:1)真菌および細菌剤による目に見える汚染の欠如、2)ウイルスによるアメーバの細胞障害効果の証拠、および3)前析アメーバの丸め相(ウイルス粒子の吸引を避けるため)。</li>
	<li>
以下の資料を使用してワークステーションをセットアップします (図 1A,B を参照)。 マイクロマニピュレータ、マイクロキャピラリーの位置を可能にします。 手動制御圧力装置は、細胞を吸引し、マイクロキャピラリーに放出するために使用される; 反転顕微鏡; モーターモジュールをプラグアンドプレイ。 カメラ; 操作を視覚化し、写真を撮るためのコンピュータモジュール。</li>
	<li>マイクロキャピラリーを選択します (図 1Cを参照)。 注:細胞の大きさ、膜の表面への変形や付着、細胞運動性は、マイクロ吸引の円滑な進行に影響を与える可能性があります。マイクロキャピラリー直径は正確に選択され、吸引のサイズおよび方法に応じて特定の細胞タイプに合わせることができる。内径20μmのマイクロキャピラリーを用い、丸めアメーバ(直径~10μm)を吸引した。これにより、内部位置の維持とセルの容易な解放が可能になります。</li>
	<li>
システムをマウントします。
	<ol>
<li>電動モジュールのグリップシステムの動作角度を45°に固定します。</li>
		<li>ダブルインストールを実行し、最初にグリップシステムで、次にマイクロキャピラリーで実行します。</li>
		<li>マイクロキャピラリーを通して油の数滴を実行した後、細胞に焦点を当てます。 注:生物学的適合性を有する鉱物油は装置によって供給される。</li>
		<li>製造元の推奨事項に従って取り付けを完了します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
セルのクローンを作成します(図 2A,B を参照)。 注:この手順は、フレーリッヒとケーニッヒ31で説明されている手順に似ています。<ol>
<li>2mLの感染アメーバを含むペトリ皿を顕微鏡下に置きます。</li>
		<li>まず細胞に焦点を当て、次に培養に浸漬した微小毛細血管に焦点を当てる。</li>
		<li>丸みを帯びた単一セルを選択し、マイクロマニピュレータにマイクロキャピラリーを近づけます。</li>
		<li>細胞に手動圧力制御で柔らかい吸引を発揮し、マイクロキャピラリーの中に取り込む。最初のサンプルから単一の細胞を取り出し、細胞サポートで放出し、30°Cでインキュベートします。</li>
		<li>反転光学顕微鏡で毎日観察を行い、細胞の外観を観察し、細胞障害効果の出現を監視します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. PCRスクリーニング
注:ステップ4に続いて、PCRによる系統的スクリーニングは、分離を確認するために重要である。ウスルパティウイルス/ファウストウイルスおよびクランデスチノウイルス/ファウストウイルスの両方において、特定のプライマーおよびプローブシステムの設計および応用は、Primer-BLASTオンライン32を用いて行われた(表2)。
<ol><li>陽性培養サンプルの一部(すなわち、細胞障害効果が観察される)からDNAを抽出し、製造業者のプロトコルに従って自動抽出システムを使用する。</li>
	<li>適切に設計されたプライマーを使用します。 注:ここでは、RpB2(ファウストウイルス)、LCD7主要キャプシドタンパク質(ウスルパトウイルス)およびマイナーキャプシドタンパク質(クランデスチノウイルス)として標識されたコア遺伝子を増幅するためのプライマーを設計しました。</li>
	<li>
サーモサイカーを使用して標準PCRを実行します。
	<ol>
<li>各プライマーの50μM(表2)、1xマスターミックス、およびRNaseフリーウォーターで20μL PCR反応を行います。</li>
		<li>Taq DNAポリメラーゼを95°Cで5分間活性化し、95°Cで10°変性の45サイクル、58°Cで30sのプライマーのアニーリング、72°Cで30sの延長を行います。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1.5%のアガロースゲルでPCR製品を実行し、DNAゲル染色(材料表)で染色し、UVで可視化します。</li>
</ol>6. ウイルスの生産と精製
<ol><li>残りのペトリ料理文化を小さなフラスコに戻します。</li>
	<li>ウイルス産生のために、145cm2のフラスコ15個を調製し、飢餓培地中に40mLのベルマメーバ・バーミフォルミスを含み、既にペトリ皿から小さなフラスコに移された単離されたウイルスの5mLを含む。</li>
	<li>ステップ4.1で使用したのと同じ抗生物質および抗真菌混合物で治療する。</li>
	<li>30°Cでインキュベートする。逆光学顕微鏡で毎日観察してください。</li>
	<li>完全な感染の後、すべてのフラスコをプールします。0.45μmフィルタを使用して、破片を除去します。</li>
	<li>超遠心噴機は45分間50,000 x gですべての上清。</li>
	<li>遠心分離後、吸引により各チューブから上清を除去し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)のペレットを1mLで再サスペンドする。</li>
	<li>25%スクロース(27.5gのスクロースを100mLのPBSで27.5g、濾過により殺菌)を用いて生成したウイルスを精製する。</li>
	<li>スクロースの遠心8 mLとウイルス懸濁液の2mLを80,000 x gで30分間30分間再懸濁し、PBSの1mLでウイルスペレットを再懸濁する。-80°Cで保管してください。</li>
</ol>7. 負染色と透過型電子顕微鏡
注:Bou Khalilら以前にこのプロトコル27を公開しました。
<ol><li>光を排出したグリッド上にリシス上清の5μLを堆積させる。室温で約20分間放置します。 注:グロー放電により、プラズマ塗布により親水性グリッドを得ることができる。</li>
	<li>グリッドを慎重に乾燥させ、1%のモリブデン酸アンモニウムを10sのために少し入金し、グリッドを5分間乾燥させます。</li>
	<li>200keVで電子顕微鏡観察に進みます。</li>
</ol>8. クランデスチノウイルスST1とウスルパティウイルスLCD7の特性評価
<ol><li>ゲノムシーケンシング、ゲノムアセンブリ、バイオインフォマティクス解析を用いたクランデスチノウイルスST1およびウスルパティウイルスLCD7の純粋な集団を特徴付け、他のウイルス10、20に対して行ったような複製周期の研究、 29.</li>
</ol>

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すべての著者は開示するものは何もない。

単一細胞マイクロ吸引処理の持続時間および良好な機能はオペレータに依存する。実験の異なるステップは、精度を必要とします。ワークステーションのマイクロ操作コンポーネントの使用は、マイクロ吸引のプロセスと細胞の放出を観察することによって一定の制御下になければなりません。顕微鏡観察によるフォローアップは、細胞の捕獲と移動に必要です。経験豊富なオペレータは、1〜2時間を取って10個の細胞を分離し、分離するウイルスの豊富さに応じて1つずつ再転送することができます。操作の数はさまざまです。私たちは、10の操作から始まるお勧めします。定義上、未知のウイルスの本質的な特徴は分かりません。したがって、これらのウイルスを分離する成功を最適化するためには、分離のための異なる戦略の使用と開発が必要です。
マイクロ吸引プロセスは、無菌条件下(微生物学的安全ステーションの外のベンチで)で行われるため、その使用を制限し、ヒト病原体の研究への応用を妨げる。したがって、汚染物質を制限するために抗生物質と抗真菌剤の混合物の使用が必須である。この方法のもう一つの制限は、マイクロマニピュレーションコンポーネントが取り付けら...

核細胞質大DNAウイルス(NCLDV)は、真核生物1に感染する4つのファミリーによって定義される非常に多様である。300kbpを超えるゲノムを有する最初の記載のウイルスはフィコドナウイルス科、パラメシウムブルサリアクロレラウイルス1 PBCV12を含む。MimiVirusの単離および最初の説明は、ウイルスの大きさが粒子の大きさ(450nm)とゲノムの長さ(1.2Mb)3の両方の点で倍増することを示した。それ以来、多くの巨大ウイルスが記載されており、通常はアメーバ共培養手順を用いて単離される。異なる形態と遺伝的内容を持ついくつかの巨大なウイルスは、マルセイユウイルス、パンドラウイルス、ピトウイルス、モリウイルス、セドラットウイルス、パックマンウイルス、トゥパンウイルス、および最近を含むアカントアメーバ球細胞から単離することができるメデューサウイルス4,5,6,7,8,9,10,11,12,13、14、15、16、17.並行して、ベルマモエバ・バーミフォルミスの単離により、ファウストウイルス、カウモエバウイルス、およびオルフェオウイルス18、19、20の巨大ウイルスの単離および説明が可能となった。他の巨大ウイルスは、カフェテリア・レンゲンシス21、アウレオコッカス・アノファゲフェレンス22、クリソクロムリナ・エリチナ23、ボド・サルタンなどの宿主プロティストと共に単離された。 24.これらの分離はすべて、分離に取り組むチームの数が増え、高スループット戦略の更新が導入された結果です。フローサイトメトリーを用いる共培養システムの改善
2016年には、共培養とフローサイトメトリーを関連付ける戦略を用いて巨大ウイルス27を単離しました。この戦略は、接種するサンプルの数を増やし、細胞支持体として使用されるプロティストを多様化し、細胞支持体の上昇を迅速に検出するために開発されました。システムは、Pacmanvirus29の場合のように、予備的な分子生物学の同定と未知のウイルス集団の迅速な検出を避けるために補足ステップを追加することによって更新された。細胞選別への結合フローサイトメトリーは、ミミウイルスとセドラトウイルスA1130の混合物の分離を可能にする。しかし、後にフローサイトメトリーによるこれらのウイルス亜集団の分離と検出の限界に遭遇しました。シーケンシング後、ファウストウイルスST125とファウストウイルスLCD7(未発表データ)のゲノムを組み立てたとき、公共ゲノムデータベースで同定されていない2つの新規ウイルスの2つの補足ゲノムを各アセンブリで驚くほど見つけました。しかし、フローサイトメトリーも透過電子顕微鏡(TEM)も、アメーバが2つの異なるウイルス、クランデスチノウイルスST1およびウスルパティウイルスLCD7によって感染していることを示さなかった。我々は、ファウストウイルス、ウスルパティウイルス、クランデスチノウイルスマーカーをそれぞれゲノムに基づいて増幅する特定のPCRシステムを設計した。私たちの目的は、分離されているウイルスの純度の検証を可能にするPCRベースのシステムを持つことです。しかし、終点希釈とフローサイトメトリーはそれらを分離できませんでした。クランデスチノウイルスおよびウスルパティウイルス集団の形態および複製要素のいずれも特徴付けされていないため、この単一のウイルス集団の分離は困難であった。2つの集団の重複(有効分離後に試験)により、フローサイトメトリーによってウイルス集団を1つだけ検出した。96ウェルプレート上で単一粒子選別を行って分離しようとしましたが、細胞障害効果は観測されず、PCR増幅によってクランデスチノウイルスもウスルパティウイルスも検出しませんでした。最後に、エンドポイント希釈の組み合わせのみに続いて、ファウストウイルスからこれら2つの低存在量の巨大ウイルスの分離を可能にした単一のアメーバマイクロ吸引の組み合わせだけでした。この分離方法は、この資料の対象です。

<table><tbody><tr><td>アガロース スタンダード</td><td>Euromedex</td><td>アンカウン</td><td>スタンダードPCR</td></tr><tr><td>AmpliTaq Gold 360 マスターミックス</td><td>アプライドバイオシステム</td><td>4398876</td><td>スタンダードPCR</td></tr><tr><td>CellTram 4r オイル</td><td>エッペンドルフ</td><td>5196000030</td><td>微小吸引プロセス中の細胞の制御</td></tr><tr><td>コーニング細胞培養フラスコ 150 cm2</td><td>Sigma-aldrich</td><td>CLS430825</td><td>Culture</td></tr><tr><td>コーニング 細胞培養フラスコ 25 cm2</td><td>Sigma-aldrich</td><td>CLS430639</td><td>培養</td></tr><tr><td>コーニング細胞培養フラスコ 75 cm2</td><td>Sigma-aldrich</td><td>CLS430641</td><td>培養</td></tr><tr><td>DFC 425C カメラ</td><td>LEICA</td><td>不明</td><td>観察・モニタリング</td></tr><tr><td>Eclipse TE2000-S 倒立顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>不明</td><td>観察・モニタリング</td></tr><tr><td>EZ1 アドバンスト XL</td><td>Quiagen</td><td>9001874</td><td>DNA 抽出</td></tr><tr><td>Glasstic Slide 10 with Counting Grids</td><td>Kova International</td><td>87144E</td><td>Cell count</td></tr><tr><td>Mastercycler nexus</td><td>Eppendorf</td><td>6331000017</td><td>Standard PCR</td></tr><tr><td>Microcapillary 20 & micro;m</td><td>エッペンドルフ</td><td>5175 107.004</td><td>細胞の微小吸引と放出</td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター InjectMan NI2</td><td>エッペンドルフ</td><td>631-0210</td><td>マイクロキャピラリーポジショニング</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td>サーモフィッシャー</td><td>AM9920</td><td>標準PCR</td></tr><tr><td>オプティマ XPN 超遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A94469</td><td>ウイルス精製</td></tr><tr><td>ペトリ皿 35 mm</td><td>同上</td><td>81158</td><td>培養/観察</td></tr><tr><td>滅菌シリンジフィルター5 & micro;m</td><td>Sigma-aldrich</td><td>SLSV025LS</td><td>ろ過</td></tr><tr><td>SYBR 緑色 Type I</td><td>Invitrogen</td><td>不明</td><td>蛍光分子プローブ/フローサイトメトリー</td></tr><tr><td>SYBR Safe</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>標準 PCR;DNAゲル染色</td></tr><tr><td>Tecnai G20</td><td>FEI</td><td>Unkown</td><td>電子顕微鏡</td></tr><tr><td>Type 70 Ti 固定角チタンローター</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>337922</td><td>ウイルス精製</td></tr><tr><td>ウルトラクリアチューブ、25 x 89 mm2</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>344058</td><td>ウイルス精製</td></tr></tbody></table>

巨大ウイルス混合物分離のための蛍光活性化細胞選別の代替戦略としての単一細胞マイクロ吸引

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

アメーバ共培養プロセス中に、複数のウイルスを単一のウェルで単離してもよい。我々は以前、ウイルス集団に適用される終点希釈および/または蛍光活性化細胞選別(FACS)によってこの問題を解決した。しかし、混合物中のウイルスが類似した形態学的特性を有し、ウイルスの1つがゆっくりと増殖すると、ゲノムアセンブリの段階で2つのウイルスの存在が発見され、ウイルスはそれ以上の特徴付けのために分離することができない。この問題を解決するために、類似性の高いウイルスの分離とクローニングを可能にする単一細胞マイクロ吸引手順を開発しました。本研究では、この代替戦略により、クランデスチノウイルスST1とウスルパティウイルスLCD7の小さなウイルス亜集団を分離し、ゆっくりと成長し、溶解性および急速に成長するアメーバル溶解に至らない巨大ウイルスをどのように分離することができたかを提示する。ファウストウイルス。純度制御は、特異的遺伝子増幅によって評価され、ウイルスはさらに特徴付けのために産生された。

単一細胞マイクロ吸引は、この原稿で最適化されたマイクロマニピュレーションプロセスです(図1)。この技術により、丸みを帯びた感染アメーバ(図2A)の捕捉と、未感染アメーバを含む新規プレートでの放出が可能になります(図2)。これは、共培養システムに適用され、正常に非溶解性巨大ウイルスを隔離した機能的なプロトタイプです。このアプローチは、巨大なウイルスの分野で初めて使用され、2つの新しい低存在量の巨大ウイルスを分離することを可能にしました。我々は、新しいウイルスクランデスチノウイルスST1とウスルパティウイルスLCD7と名付けました, 高豊富なファウストウイルスに比べて低い存在でした.マイクロ吸引手順後の各プレートにおけるウイルス存在を分析するために、15マイクロ吸引にPCRを適用した。純粋なウスルパティウイルス(ウスルパティウイルスLCD7[+]の存在およびファウストウイルス[–]の欠如)はクローン7のみで観察した(<strong...

ここでは、感染アメーバの分離のための単一細胞マイクロ吸引法について説明する。ファウストウイルスと未知の巨大ウイルスに感染したヴェルマメーバ・バーミフォルミスのウイルス亜集団を分離するために、以下に詳述するプロトコルを開発し、2つの低存在量の新規巨大ウイルスを分離する能力を実証した。

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

単一細胞微小吸引は、微生物学全般、特にウイルス学の分野で使用される異なる技術を補完する方法である。これは、重要な質問に答え、巨大なウイルスの分離中に遭遇した問題を解決することができ、ターンオーバーウイルス、クランジジンウイルス、およびファウストウイルスである別のものからウジバチウイルスの場合のように、低量のウイルスを提示するウイルス混合物からウイルスを分離し、とにかく高い量に存在する。このアプローチの主な利点は、間接戦略の使用です。感染した宿主を分離してクローニングしてウイルス分離を得る。そこで、この方法は、細胞の捕獲から放出までの異なるステップを監視し、顕微鏡観察による選別プロセスを確認します。最後に、分子生物学は、分離されたウイルス粒子を観察するために選別および電子顕微鏡を確認するために使用される。このアプローチは、ウイルス分離の主要な問題を解決します。これは、一般的にアメバのクローニングやクローニングプロティストのための将来です。この技術を初めて使用しようとする人は、圧力を制御する際に厳密かつ正確でなければなりません。この視覚制御は、1 つのセルのキャプチャとリリースを確認するために不可欠です。セル支持体として、フェルマメーババーミフォルミ、ひずみCDC 19を使用する。75平方センチメートルの細胞培養フラスコに1ミリリットル当たり10倍から6番目の細胞の濃度でPYG培地30ミリリットルとアメーバの3ミリリットルを加える。インキュベーターで28°Cの文化を維持します。48時間後、アメーバ細胞培養液の10ミリリットルを計数スライドに移し、顕微鏡下に置いてアメーバを定量化する。すすべるために、30ミリリットルの細胞培養物をチューブに収穫し、10分間Gの720倍で遠心分離によりアメーバをペレットにする。上清を取り除き、適切な量の飢餓培地中のペレットを再懸濁し、1ミリリットル当たり6番目の細胞に10倍の濃度を得る。抗菌剤を添加して細胞サポートを準備する。バイオセーフティキャビネットでは、アメーバ培養の6回目に10倍から6分の1を2ミリリットルの飢餓培地に加えます。次に、ウイルスの混合物を含むストック溶液を0.01の感染の多重度でアメーバ細胞培養支持体に接種する。感染したアメーバ細胞培養サポートをインキュベートする。10〜14時間、またはアメーバル丸めやリシスなどの細胞パシー効果が誘発されるまで、摂氏30度を加えます。次に、注射器を使用して培地を収集し、5ミクロンのフィルターを通して濾過して細胞の破片を除去する。異なるウェルで飢餓培地中のウイルスサンプルの穀物希釈を行う。各ペトリ皿に含まれる第6のヴェルマモバ・ヴェルマフォルミスに10倍の2ミリリットルを接種し、100ミリリットルの混合物を接種する。その後、ペトリ料理を30°Cの密封可能なビニール袋に入れます。感染後6時間で、逆光顕微鏡でペトリ皿を観察し、4〜8時間ごとに細胞形態をチェックする。抗菌処理は細胞のサポートのための。ペトリ皿の中から、真菌および細菌剤による視覚汚染の存在しないもの、およびウイルスによるアメーバの細胞パシー効果の証拠と、ウイルス粒子の吸引を避けるためにアメーバの前リシスおよび丸め段階を有するものを選択する。マイクロマニピュレータ、手動制御圧力装置、反転顕微鏡、プラグアンドプレイモーターモジュール、カメラ、コンピュータモジュールを備えたワークステーションを設置します。内部位置の維持と細胞の容易な放出を可能にするために20ミクロンの内径のマイクロキャピラリーを選びましょう。電動モジュールのグリップシステムの動作角度を45度で固定します。最初にグリップシステムで、次にマイクロキャピラリーで、二重インストールを実行します。細胞に焦点を当てます。細胞をクローン化するには、感染したアメーバの2ミリリットルを含むペトリ皿を顕微鏡の下に置く。まず細胞に焦点を当て、次に培養に浸したマイクロ毛細血管に焦点を当てます。丸みを帯びた単一細胞を選び、マイクロキャピラリーをマイクロマニピュレーターに近づける。マイクロキャピラリーの内側に取る細胞に手動で圧力制御を加えて柔らかい吸引を行い、最初のサンプルから単一の細胞を取り出し、アメーバの細胞培養サポートで放出します。その後、摂氏30度でインキュベートします。慎重に単一の細胞を熱望し、単一の細胞の放出の観察によってあなたの抱負を制御することができるように圧力を制御する。反転した光学顕微鏡で毎日観察を行い、細胞の外観を観察し、細胞変性効果の出現を監視します。現在、細胞性効果が観察される陽性培養サンプルの一部からDNAを抽出するために、自動抽出システムを操作します。ファウストウイルスのRBP2、ウスパトウイルスの主要なキャプシドタンパク質、およびクランデスチノウイルスのマイナーキャプシドタンパク質として標識された貧しい遺伝子を増幅するプライマーを設計する。原稿に従ってサーモサイクラーを使用して標準PCRを行います。各プライマー、1Xマスターミックス、およびリボヌクレアーゼフリー水の50マイクロモルでPCR反応の20マイクロリリライタを実施します。1.5%のアガロースゲルの電圧135ボルトでDNAゲル染色でPCR製品を実行し、UVで可視化します。このプロトコルは単一細胞マイクロ吸引でマイクロマニピュレーションプロセスを最適化する。この技術は、丸みを帯びて感染したアメーバの捕獲と、感染していないアメーバを含む新規プレートでの放出を可能にする。このアプローチは、Userpatvirus LCD7という新しい低存在量の巨大ウイルスを正常に分離しました。お客様のユーザーパトウイルスは、Userpatvirus LCD7 DNAの存在とファウストウイルスDNAの存在を持つクローン7でのみ観察されました。電子顕微鏡は、フィブリルのない典型的な異端体形態を有するクランデスチノウイルスST1の出現と、約250ナノメートルの二面体キャプシドを有するウスルパトウイルスLCD7の出現を明らかにした。低細胞測定は、ファウストウイルスとノーボイラスの集団の重複を確認する。マスター化すれば、この手順は簡単に行うことができます。この手順を試みる際に覚えておくべきことは、作業ステーションの有能な取り扱いと汚染の問題のチェックを持つエンティティのサイズに関する最小限の観察の儀式の必要性です。このアプローチは、細胞形態に基づくソート技法として使用することができる。現在、それは特定のアメーバのクローニングのために私たちの研究室で使用されています.この手法の重要なポイントの 1 つは、セルの整合性を維持することです。実際、細胞の非観察や放出に問題が生じる可能性があります。これは、主に細胞がマイクロ毛細血管に崩壊するためである。この方法は、欠陥テレメトリとファクトの並べ替えが利用できない場合や、特定の手法の制限に達した場合に、効率的な代替手段となる可能性があります。場合によっては、細胞がマイクロ毛細血管から放出されないことを忘れないでください。これは、アメーバの特性と、細胞膜から適応し、その後の能力の一部によるものです。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

単一のウイルスゲノム（SVG）は、単一のビリオンのゲノムを分離して増幅する方法である。混合された集合体のウイルス懸濁することにより、ビリオンを捕捉し、下流の処理中にゲノムせん断を低減、アガロースを含む個別のウェルを有する顕微鏡スライド上にフローサイトメトリーを用いてソートされる。全ゲノム増幅は、配列決定のために適しているゲノム材料をもたらす複数の置換増幅（MDA）を用いて達成される。...

&#39;シングルウイルスゲノミクス&#39;を使用してシングルビリオンの単離とゲノム解析

表面へのビリオンの付着は、超解像蛍光イメージングまたは原子間力顕微鏡(AFM)による単一のビリオンイメージングの要件です。ここでは、AFMおよび超解像蛍光イメージングでの使用に適したガラス表面へのビリオンの制御接着のためのサンプル調製方法を示す。...

単一のビリオン原子間力顕微鏡と超解像蛍光イメージングのサンプル調製

ここでは、巨大ウイルスの新しいアスファルウイルス関連系統であるファウストウイルスの新しい遺伝子型の特性評価のためのウイルス分離における最新の進歩について説明します。このプロトコルは、ウイルス、特にアメーバに感染する巨大ウイルスのハイスループット単離に適用できます。...

用いた環境サンプルから新規Faustovirusesの単離のための迅速な戦略<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

このプロトコルは、特定の目的の細胞タイプを分離するための、デスチオビオチン、ストレプトアビジン、およびAPTESシステムのカスタマイズ可能な表面機能化について説明しています。さらに、この原稿では、このプロセスのアプリケーション、最適化、および検証について説明します。...

ガラスの表面機能を介して、標的細胞の単離方法

単一セル配列は生物学的システムにおける遺伝的異質性を明らかに、現在の技術は群集組成と機能の深いプロファイリングに必要なスループットを欠けています。ここでは、配列のためのマイクロ流体ワークフローについて述べる &gt; 多様なから 50,000...

単一細胞のゲノムの配列のための超高スループット マイクロ流体プラットフォーム

96 遺伝子の発現を量的に方法論が説明し、単一セルがex vivo、差動の同定を可能にする 18 の表面タンパク質は感染していない細胞を基準にしてウイルスに感染した細胞の遺伝子そして蛋白質を表明しました。+ T 研究 SIV 感染 CD4...

MRNA およびサル免疫不全ウイルス感染 cd4 表面タンパク質発現の単一細胞定量+ T 細胞孤立したアカゲザルから

このプロトコルは、生後マウスまたはラットの新皮質および海馬からの蛍光 GABAergic または glutamatergic...

蛍光活性化細胞選別により確立された精製 GABAergic または Glutamatergic ニューロンの初代細胞培養

このプロトコルは、エアスプレーノズルのサイズ、シース液の圧力、サンプルフロー圧力、電圧、ゲイン、およびトリガーしきい値パラメータを最適化することにより、小さな細胞外小胞の迅速かつサイズ固有の分離方法を提供します。...

低分子細胞外小胞のハイスループット単離および精製のためのフローサイトメトリーソーティングパラメータの最適化(英語)

細胞外小胞は生物医学的応用に大きな期待を寄せていますが、現在の単離法は時間がかかり、臨床使用には実用的ではありません。本研究では、大量の生体液から細胞外小胞を最小限のステップで連続的に直接単離できるマイクロ流体デバイスを紹介します。...

二股A4Fマイクロ流体デバイスを用いた大量サンプルからの細胞外小胞のシングルステップ分離(英語)

ここでは、デュアルレポーターフローサイトメトリーシステムを使用して、アンジオテンシン変換酵素-2結合磁気マイクロスフェアによって捕捉された無傷の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)ウイルス粒子上の2つのユニークなスパイクタンパク質エピトープを同時に検出する、新たに開発されたマルチプレックス蛍光免疫測定法について説明します。...

マルチプレックスデュアルレポーター法によるウイルス粒子上の表面タンパク質エピトープのプロファイリング

このプロトコルは、間葉系間質細胞によって放出される細胞外小胞(EV)の選別について詳細に説明しています。特に、機器の設定と選別条件の最適化に焦点を当てています。目標は、細胞外小胞の特性を維持しながら選別することです。...

細胞外小胞単離のための適切なソーティングの設定

学ぶ単一細胞マイクロ吸引法によるVermamoeba vermiformisを用いた低豊度巨大ウイルス分離技術。Usurpatvirus LCD7の分離成功例を含む、ウイルス学における新たな分離・解析手法の確立に貢献する。

巨大ウイルス混合物分離のための蛍光活性化細胞選別の代替戦略としての単一細胞マイクロ吸引

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