Name: 胚性幹細胞からの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を運ぶ外生エンリッチ細胞小胞の分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: 学ぶ 胚性幹細胞からGM-CSFを運ぶ外生エンリッチ細胞小胞の分離法。ウルトラ遠心分離とゲルコート培養を用いて高品質な免疫調節性ベシクルを調製し、細胞非依存的免疫療法への応用可能性を探索する詳細プロトコールです。

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透過型電子顕微鏡画像を取得してくれたアルカディウシュ・スルサルチク氏とケンタッキー州生物医学研究基盤ネットワーク(KBRIN、P20GM103436)に感謝しています。この研究の一環として、NIH AA018016-01(J.W.E.)、ケンタッキー州連邦リサーチチャレンジトラストファンド(J.W.E.)、NIH CA106599、CA175003(C.L.)、NIH CA198249(K.Y.)、フリー・オブ・ブレス・リサーチ・グラント(K.Y.)からの助成金が支えられました。

1. ES-D3細胞の培養
<ol><li>エキソソームフリーウシ血清(FBS)を生成するには、FBSを超遠心分離機に、遠心分離機を100,000 x g で4°Cで16時間ロードします。 遠心分離後、マウスESC細胞株ES-D3を培養し、エキソソームエンリッチEVを取得するためのエキソソームフリーFBSとして血清上清を収集します。</li>
	<li>ES-D3細胞をめっきする前に、ゼラチン(0.1%)を室温で30分間使用して15cmの組織培養皿をコーティングします。</li>
	<li>先に説明したプロトコル16に従って、ゼラチンコーティング15cmの組織培養皿中のフィーダー層細胞を含まないES-D3細胞を培養する。ES-D3細胞培養培地はDMEMで構成され、 エキソソームフリーFBS(15%)、非必須アミノ酸(0.1mM)、L-グルタミン(2mM)、βメルカプトエタノール(0.1mM)、ペニシリン(50単位/mL)、ストレプトマイシン(50μg/mL)、白血病阻害因子(LIF;100単位/mL)。ES-D3細胞を5%CO2加湿インキュベーターで37°Cで培養した。</li>
	<li>ES-D3細胞が15cmの組織培養皿で約90%の合流度に達したら、吸引によって培地を取り除く。トリプシン(5 mL;0.05%)を使用して細胞を洗浄します。皿にトリプシン(5 mL)を加え、37°Cで5分間インキュベートします。皿から細胞を収集します。</li>
	<li>回収した細胞に新鮮な培養培地(5mL)を加え、トリプシンを不活性化する。5分間390xgで細胞を遠心分離する。新鮮な培地で細胞を再懸濁し、ヘモサイトメーターを使用して細胞数を決定します。</li>
	<li>通過細胞の場合、ES-D3細胞(5 x 106)をゼラチンコーティング(0.1%)に15cmの組織培養皿に新鮮な培地(15mL)でプレートし、細胞をサブキュアする前に3日間培養します。</li>
	<li>エキソソーム濃縮EVの単離のために細胞培養上清を収集するには、ES-D3細胞(1 x 107)をゼラチンコーティング(0.1%)15cmの組織培養皿に、細胞培養上清を採取する前に3日間、新鮮な培地(15mL)でプレートします。</li>
</ol>GM-CSF発現プラスミドの生成
注: トランスフェクションプラスミド pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP を生成し、ES-D3 細胞で GM-CSF を過剰発現させます。このプラスミドにおいて、マウスGM-CSF cDNAの発現は、ヒト化レニラ・レニフォルミスGFP(hrGFP)をヒト化したタンパク質と共に、ヒトポリペプチド鎖伸び因子1α(EF1α)プロモーター17、18によって駆動される。
<ol><li>ベクトルバックボーンを生成します。<ol>
<li>37°Cの制限酵素EcoRI(100単位)を2時間使用してプラスミドpEF1α-FD3ER-IRES-hrGFP(DNA 20μg)を消化し、ベクターバックボーン(6.0 kb)とFD3ERインサート(2.5kb)の2つのDNA断片を生成します。</li>
		<li>消化したプラスミドDNA(10μg)の50%を1.5mLマイクロ遠心分離チューブに移し、アルカリホスファターゼ(20単位)を37°Cで1時間処理します。アガロースゲル電気泳動(2%)を用いて、未処理のDNAと脱リン酸化DNAの両方を解決します。</li>
		<li>DNAゲル抽出キットを使用してベクターバックボーンDNA断片(6.0 kb)を精製します。未処理のベクターバックボーンは空のベクター(pEF1α-IRES-hrGFP)として機能しますが、脱リン酸化ベクターバックボーンはGM-CSF発現プラスミド(pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP)の生成に使用されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>GM-CSF cDNA 挿入を生成します。<ol>
<li>プラスミドpMSCV-mGM-CSF-IRES-IRES-EGFP 19(20μg)を37°Cの制限酵素EcoRI(100単位)で2時間消化し、ベクターバックボーン(6.5 kb)とマウスGM-CSF cDNAインサート(474 bp)の2つのDNA断片を生成します。</li>
		<li>アガロースゲル電気泳動(2%)を介して消化されたDNAを解決します。DNAゲル抽出キットを使用して、マウスGM-CSF cDNA断片(474 bp)を精製します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>発現プラスミドを生成します。<ol>
<li>DNAライゲーションキットを使用して2ライゲーション反応(総体積10μL)を設定します。<ol>
<li>空のベクトルpEF1α-IRES-hrGFPを生成するには、ステップ2.1.3(6.0 kb;500 ng)から未処理のベクターバックボーンをリゲートします。</li>
			<li>pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFPを生成するには、ステップ2.1.3(6.0 kb;500 ng)から脱リン酸化ベクターバックボーンを(2)ステップ2.2.2(474 bp;200ng)で生成したmGM-CSF cDNA断片をリゲートします。</li>
		</ol>
</li>
		<li>25°Cで5分間リゲートします。合体DNAをDH5αの有能な 大腸菌 細胞に変換する。変換された 大腸菌 細胞をカルベニシリン(50 μg/mL)を含むLB寒天プレートにプレートします。</li>
		<li>DNA分離キットを使用して、単一 の大腸菌 コロニーからプラスミドを精製します。DNAシーケンシングによりプラスミドの身元を検証します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. GM-CSFを過剰発現するES-D3細胞の生成
注: プラスミド pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP を使用して、ES-D3 細胞を GM-CS を過剰発現させます。プラスミドpBabe-NeoをES-D3細胞にコトランスフェクトし、安定したトランスフェクト細胞18,20の選択を容易にする。
<ol><li>プラスミドをES-D3細胞にトランスフェクトする。<ol>
<li>ES-D3細胞(1.4 x 106)をゼラチンコーティング(0.1%)に、トランスフェクション用培養培地(10mL)で10cmの組織培養皿に入れます。ES-D3細胞を37°Cで24時間培養した。</li>
		<li>1.5 mLマイクロ遠心分離チューブで2つのプラスミド混合物を調製する:(1)pEF1α-IRES-hrGFP(28 μg、ベクターコントロール)、pBabe-Neo(4 μg)および(2)pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP(28 μg、発現GM-CSF)を用いたpBa-4.4。メーカーのプロトコルに従ってトランスフェクションキットを使用してトランスフェクションを行います。</li>
		<li>プラスミド混合物を含む各チューブにトランスフェクション媒体(1 mL)とトランスフェクション試薬(64 μL)を加え、室温で5分間インキュベートします。</li>
		<li>ES-D3細胞の各10cmの皿にトランスフェクション混合物を加えます。37°Cで5時間インキュベートする。</li>
		<li>10cmの皿の中の培地を新鮮な培養培地(10mL)に交換してください。37°Cで24時間インキュベートする。</li>
	</ol>
</li>
	<li>安定してトランスフェクトされたES-D3細胞のバルク集団を生成する。<ol>
<li>トランスフェクトされたES-D3細胞から培地を取り除きます。トリプシン(2 mL;0.05%)で細胞を洗います。トリプシン(2 mL)を加え、37°Cで5分間インキュベートします。細胞を15 mL遠心分離チューブに移し、2 mLの新鮮な培養培地を加えてトリプシンを中和します。遠心分離機 390 x g で 5 分間</li>
		<li>新鮮な培養培地(10mL)でトランスフェクトされた細胞を再懸濁する。トランスフェクトES-D3細胞におけるGFPの蛍光強度を、メーカーのプロトコルに従って蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いて評価する。</li>
		<li>トランスフェクトした細胞を、新鮮な培養培地(10 mL)を含む2つの10cm皿に移します。ネオマイシン(0.5 mg/mL)を加えて、未感染細胞を排除します。</li>
		<li>ネオマイシン(0.5 mg/mL)を含む培地中のトランスフェクト細胞の培養を継続する。トランスフェクトされたES-D3が90%の合流度に達すると、細胞を再び15cmの組織培養皿に移す。手順を2週間繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>安定してトランスフェクトされたES-D3細胞のクローンを生成します。<ol>
<li>安定してトランスフェクトされたES-D3細胞のバルク集団が生成されたら、細胞を以前のように収集します。ヘモサイトメーターを使用して細胞数を決定します。5分間390xgで細胞を遠心分離する。新鮮な培地で細胞(1 x 107細胞/mL)を再懸濁する。</li>
		<li>滅菌40 μm細胞ストレーナーを通して細胞をフィルターします。メーカーのプロトコルに従って、FACSを使用してGFP陽性ES-D3セルを精製します。</li>
		<li>単一の選別されたES-D3細胞を、ネオマイシンフリー培地(200μL)に親のES-D3細胞(1 x 103)を含むゼラチンコーティング(0.1%)96ウェル組織培養プレートの1つのウェルにプレートします。トランスフェクトされたES-D3細胞を、トランスフェクトされていない親の細胞と共培養することで、安定的にトランスフェクトされた単一のES-D3細胞が生き残り、単一のクローンとして増殖することが保証されます。</li>
		<li>細胞を48時間培養し、ネオマイシン(0.5 mg/mL)を96ウェルプレートに添加して、感染していない親のES-D3細胞を排除します。</li>
		<li>ネオマイシン(0.5 mg/mL)を含む培地を含む96ウェル組織培養プレートでGFP陽性ES-D3細胞を1週間培養し続ける。クローンES-D3細胞株をゼラチンコーティング(0.1%)6 cmの組織培養皿に、ネオマイシン(0.5mg/mL)を含む培養培地(5 mL)で1週間移管します。</li>
		<li>メーカーのプロトコルに従って、FACSを使用して、トランスフェクションされたES-D3細胞クローンのGFP蛍光強度を決定します。GM-CSFまたは高レベルの緑色蛍光を有する空のベクターを発現するES-D3クローンを選択します。</li>
		<li>メーカーのプロトコルに従って、マウスGM-CSF ELISAキットを使用してES-D3細胞によって分泌されるGM-CSFの量を決定します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. エキソソームエンリッチ細胞小胞の分離
<ol><li>ES-D3細胞(1 x 107)を37°Cで72時間培養して15cmの組織培養皿に培養する。 細胞培養上清を収集する。4°Cで上清を収集し、1週間まで保存し、エキソソームの完全性を維持します。</li>
	<li>遠心分離機を4°Cで60分間5,000xgで遠心分離し、大細胞断片を沈降させる遠心分離機を用いた。 </li>
	<li>超遠心布を使用して、4°Cで90分間100,000 x g で上清と遠心分離機を収集します。</li>
	<li>上清を取り除く。各ペレットをリン酸緩衝生理食塩分(PBS;1 mL)で2回やさしくすすいで、残留培養上清を除去する。</li>
	<li>PBS内の各ペレットを再懸濁します。エキソソームエンリッチ化されたEVをタンパク質含有量5で定量化する。<ol>
<li>バイチンコニン酸(BCA)アッセイを用いて、エキソソーム濃縮EVのタンパク質濃度を測定します。ES-D3細胞からのエキソソームエンリッチEVの期待収量は、細胞培養上清のタンパク質/mLの約4μgです。エキソソーム濃縮EVをPBS(タンパク質濃度:~6 μg/μL)で再懸濁します。エキソソームを豊富に含むEVは-80°Cで保管してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>透過電子顕微鏡による外生富化細胞外小胞の特徴化
注:透過電子顕微鏡(TEM)5を用いて、ESCから分離されたエキソソームエンリッチEVの組成と構造を調べる。
<ol><li>エキソソームを濃縮したEV(3~5 μg/μL)を、室温で2時間の間、2%EMグレードのパラホルムアルデヒドの最終濃度で固定します。</li>
	<li>固定サンプル(10 μL)をカーボン支持フィルムで銅グリッドに積み込みます。サンプルを銅格子で1分間インキュベートし、フィルターペーパーでグリッドを排出します。</li>
	<li>メーカーのプロトコルに従って染色液でグリッドを染色します。</li>
	<li>ピンセットを使用して、グリッドをフィルター用紙に転送します。グリッドを室温で一晩乾燥させます。</li>
	<li>メーカーのプロトコルに従って、透過型電子顕微鏡(50,000倍倍率)を用いて電子顕微鏡画像を取得します。</li>
</ol>6. ウェスタンブロット解析によるエキソソーム濃縮細胞外小胞の評価
<ol><li>全細胞抽出物を準備します。<ol>
<li>15cmの皿で培養したES-D3細胞から培地を取り出します。トリプシン(5 mL;0.05%)で細胞を洗います。細胞にトリプシン(5 mL)を加えます。37°Cで5分間インキュベートします。細胞を収集し、新鮮な培養培地(5 mL)を加えてトリプシンを中和します。5分間390xgで細胞を遠心分離する。PBS のセルを再中断します。</li>
		<li>ヘモサイトメーターを使用して細胞数を決定します。5分間390xgで再び遠心分離します。0.5% SDS(5,000セル/μL)を含むSDS-PAGEローディングバッファ内のセルを再中断します。</li>
		<li>10%の振幅(ワット数:500 W;超音波周波数:20 kHz)の超音波処理器を使用して10 sのサンプルを超音波処理します。サンプルを100°Cで5分間加熱します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>エキソソームエンリッチEVのリセートを準備します。<ol>
<li>0.5%のSDSを含むSDS-PAGE負荷バッファ内のエキソソームエンリッチEVを1.2 μg/μLの濃度で再中断します。</li>
		<li>10%の振幅(ワット数:500 W;超音波周波数:20 kHz)の超音波処理器を使用して10 sのサンプルを超音波処理します。サンプルを100°Cで5分間加熱します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ウェスタンブロットでタンパク質を検出します。<ol>
<li>細胞全体抽出物(10 μL;5,000細胞/μL)およびエキソソーム濃縮EVリセート(10 μL;1.2 μg/μL)をビストリスPAGEゲル(4-20%)の各ウェルにロードします。ポリビニリデンフッ化物(PVDF)膜にタンパク質を移す。</li>
		<li>適切な一次および二次抗体を用いて膜をインキュベートする。PBS、Tween-20(0.2%)、および非脂肪乾燥乳(10%w/v)を含むブロッティング緩衝液中の希薄化抗体(以下に示す濃度で)<ol>
<li>抗アネキシンV(200 ng/mL)、抗CD81(50 ng/mL)、抗フロティリン-1(200 ng/mL)、抗シトクロムc(100) ng/mL)、抗タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(200 ng/mL)、抗GAPDH(33 ng/mL)、抗オックスホスコックスIVサブユニットIV(600 ng/mL)。</li>
			<li>ペルオキシダーゼ共役ヤギ抗ウサギIgG(20 ng/mL)およびペルオキシダーゼ共役ヤギ抗マウスIgG(20 ng/mL)を使用してください。</li>
		</ol>
</li>
		<li>強化された化学発光検出キットを使用してタンパク質を検出します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. エキソソームエンリッチ化細胞外小胞中のGM-CSF濃度をELISAで決定する
注: いくつかの変更を加えたメーカーのプロトコルに従って、マウス GM-CSF 用のキットを使用して ELISA によるエキソソームエンリッチ EV の GM-CSF の量を評価します。
<ol><li>ELISAプレートにキャプチャ抗体を塗布します。エキソソームエンリッチEV(0.6 μg)をPBS単独で、またはPBS + 0.05%Tween-20(100 μL)で室温で30分間処理します。被覆されたELISAプレートに処理サンプルを加え、室温で1時間インキュベートします。PBS単独またはPBS + 0.05%Tween-20でプレートを洗います。</li>
	<li>検出抗体をサンプルに追加します。室温で1時間インキュベートする。PBS単独またはPBS + 0.05%Tween-20でプレートを洗います。サンプルにアビジン HRP を追加します。室温で30分間インキュベートします。PBS単独またはPBS + 0.05%Tween-20でプレートを洗います。</li>
	<li>マイクロプレートリーダー上で450 nmの吸光度を測定することにより、エキソソームエンリッチEVにおけるGM-CSF濃度を測定します。</li>
</ol>

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カヴィタ・ヤダナプディ、チー・リー、ジョン・W・イートンは、米国特許出願「人工胚性幹細胞由来エキソソームとその使用方法を含む組成物」を提出した。

本研究は、免疫刺激タンパク質GM-CSFを有するエキソソームエンリッチEVを産生する非常に効率的な方法を示し、エキソソームエンリッチEVの免疫調節効果を研究するために使用することができる。いくつかの研究は、エキソソームが免疫調節および抗腫瘍機能22を示すことを示唆している。したがって、GM-CSFを発現するESCのエキソソームは、免疫応答を調節する生物学的活性を有する可能性もある。このプロトコルにおいて、外因性マウスGM-CSFは、トランスフェクションによってマウスES-D3細胞において安定的に過剰発現した(図1)。重要なことに、GM-CSFを過剰発現させるES-D3細胞から分離されたエキソソームエンリッチEVで、かなりの量のGM-CSFが検出された(図5)。
これらのデータは、ほぼすべてのGM-CSFがエキソソームエンリッチEV内に存在することを示唆しています。サイトカインとして、大部分のGM-CSFタンパク質が細...

ESCは、着床前胚1の胚盤胞期に由来する。多能性幹細胞として、ESCは自己更新し、あらゆるタイプの胚細胞に分化する能力を有する。その著しい発達力と長期的な増殖能力のために、ESCは生物医学研究のために非常に価値がある1.現在の研究努力は、糖尿病、心臓病、および神経変性疾患2、3、4を含む様々な主要な病的障害に対するESCの治療可能性に主に焦点を当てている。
ESCを含む哺乳類細胞は、細胞外環境に可変サイズの小胞を放出することが知られており、これらのEVは細胞間コミュニケーションにおけるそれらの役割のために多くの生理学的および病理学的機能を有する5。EVの異なるサブタイプの中で、エキソソームは、中間内視鏡コンパートメント、多胞体(MVB)の融合時に細胞外空間に様々な細胞タイプから放出される小さな膜小胞である、血漿膜6を有する。エキソソームは細胞間通信を媒介することが報告されており、多くの(パソ)生理学的プロセス7,8に批判的に関与している。エキソソームは、タンパク質や核酸を含むサイトゾルから得られた生物学的物質を含んでいるため、自分の親細胞からいくつかの生物学的機能を継承します。従って、特定の疾患に特異的な免疫応答を刺激する関連抗原または因子は、特定のタイプの細胞9からエキソソームに封入される。これは、抗癌ワクチン10として腫瘍由来エキソソームを探索する臨床試験への道を開いた。
GM-CSFは、異なるタイプの免疫細胞11によって分泌されるサイトカインである。新たな証拠は、GM-CSFが免疫系を活性化し、調節し、抗原提示プロセス12において不可欠な役割を果たしていることを示す。例えば、臨床報告は、GM-CSFがワクチンアジュバント13として腫瘍に対する免疫応答を刺激することを示唆している。GM-CSFの強力な免疫刺激活性を利用するいくつかのGM-CSFベースの癌免疫療法戦略は、臨床試験14で調査されている。これらの中で、照射されたGM-CSF分泌腫瘍細胞からなるがんワクチンは、転移性腫瘍15において細胞および体液性抗腫瘍応答とその後の壊死を誘導することによって進行した黒色腫患者に何らかの約束を示している。
ESCに由来するエキソソームは元のESCと同様の生物学的活性を有するため、ESCからのGM-CSFを運ぶエキソソームは、免疫応答を調節するための無細胞小胞として機能する可能性があります。本論文では、GM-CSFを発現するESCから高品質エキソソームエンリッチEVを製造する詳細な方法を説明する。これらのエキソソームエンリッチEVは、免疫応答を調節する免疫調節小胞として機能する可能性を秘めています。

<table><tbody><tr><td>アルカリ性リン酸塩、子牛腸</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>M0290S</td><td>脱リン酸化 DNA プラスミド</td></tr><tr><td>抗アネキシン V mAb</td><td>サンタクルーズ バイオテクノロジー</td><td>クローン H-3, sc-74438</td><td>ウェスタンブロット, RRID:</td></tr><tr><td>AB_1118989 抗CD81 mAb</td><td>サンタクルーズ バイオテクノロジー</td><td>クローン B-11, sc-166029</td><td>ウェスタンブロット, RRID:AB_2275892</td></tr><tr><td>抗シトクロム c mAb</td><td>サンタクルーズバイオテクノロジー</td><td>クローン A-8、sc-13156</td><td>ウェスタンブロット、RRID:AB_627385</td></tr><tr><td>抗 Flotillin-1 mAb</td><td>Santa Cruz バイオテクノロジー</td><td>クローン C-2、sc-74566</td><td>ウェスタンブロット、RRID:AB_2106563</td></tr><tr><td>抗 GAPDH pAb</td><td>Rockland</td><td>600-401-A33S</td><td>ウェスタンブロット、RRID:AB_11182910</td></tr><tr><td>抗マウス IgG、ヤギ、ペルオキシダーゼ標識</td>サー<td>モフィッシャー</td><td>31430</td><td>ウェスタンブロット、RRID:AB_228307</td></tr><tr><td>抗Oxphos COX IVサブユニットIV mAb</td><td>Thermo Fisher</td><td>clone 20E8C12 A21348</td><td>ウェスタンブロット、RRID:AB_221509</td></tr><tr><td>抗タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(PDI) pAb</td><td>Enzo</td><td>ADI-SPA-890</td><td>ウェスタンブロット、RRID:AB_10616242</td></tr><tr><td>抗ウサギ IgG、ヤギ、ペルオキシダーゼ結合</td><td>Thermo Fisher</td><td>31460</td><td>ウェスタンブロット、RRID:AB_228341</td></tr><tr><td>BCA(ビシンコニン酸)アッセイ</td><td>Thermo Fisher</td><td>23223</td><td>タンパク質濃度の測定</td></tr><tr><td>Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20%</td><td>Genscript</td><td>M42015</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Carbenicillin, Diodium Salt</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10177012</td><td>E. coliコロニーの選択</td></tr><tr><td>遠心分離機, Avanti J-26 XPI</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>低速遠心分離</td></tr><tr><td>機 遠心分離機ローター, JA-10</td><td>Beckmanコールター</td><td>09U1597</td><td>低速遠心分離</td></tr><tr><td>機 遠心分離ボトル、Nalgene PPCO</td><td>サーモフィッシャー</td><td>3120-0500PK</td><td>低速遠心分離</td></tr><tr><td>カーボン支持膜付きCuグリッド</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>FF200-Cu</td><td>電子顕微鏡画像の取得</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101</td><td>DNAプラスミド</td></tr><tr><td>の分解 化学発光の強化検出システム</td><td>サーモフィッシャー</td><td>32106</td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>FACScalibur フローサイトメーター</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td></td><td>ES-D3細胞のGFPレベルの検査</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ATCC</td><td>SCRR-30-2020</td><td>ES-D3細胞用培地</td></tr><tr><td>フィッシャーブランド 滅菌セルストレーナー;メッシュサイズ:40&mu;m</td><td>サーモフィッシャー</td><td>22-363-547</td><td>FACS ソーティング用ES-D3細胞のろ過</td></tr><tr><td>ゼラチン(0.1%)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>ES006B</td><td>ES-D3細胞の培養</td></tr><tr><td>GM-CSF ELISAキット</td><td>サーモフィッシャー</td><td>88733422</td><td>GM-CSF濃度の測定</td></tr><tr><td>ノックアウトダルベッコ'のモディファイドイーグル」s 培地</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10-829-018</td><td>ES-D3細胞用培地</td></tr><tr><td>白血病抑制因子</td><td>サーモフィッシャー</td><td>ESG1106</td><td>ES-D3細胞用培地</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>VWR</td><td>VWRL0131-0100</td><td>ES-D3細胞用培地</td></tr><tr><td>リポフェクタミン2000トランスフェクション試薬</td><td>サーモフィッシャー</td><td>11668019</td><td>ES-D3細胞</td></tr><tr><td>用培地 マイクロプレートリーダー、PowerWave XS</td><td>BioTek</td><td></td><td>GM-CSF濃度の測定</td></tr><tr><td>MoFlo XDP高速セルソーター</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td>単一のES-D3細胞クローンの単離</td></tr><tr><td>NEB 5-α コンピテント大腸菌</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>C2988J</td><td>GM-CSF発現プラスミドの生成</td></tr><tr><td>ネオマイシン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10-131-035</td><td>ES-D3クローンの選択</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>サーモフィッシャー</td><td>SH3023801</td><td>ES-D3細胞用培地</td></tr><tr><td>脱脂粉乳</td><td>サーモフィッシャー</td><td>NC9022655</td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>Opti-MEM I 還元血清培地</td><td>サーモフィッシャー</td><td>31985062</td><td>ES-D3細胞のトランスフェクション</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>15710</td><td>電子顕微鏡画像の取得</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>VWR</td><td>sc45000-652</td><td>ES-D3細胞用培地</td></tr><tr><td>プラスミド pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP</td><td>Addgene</td><td>37270</td><td>GM-CSF発現プラスミド</td></tr><tr><td>PVDF膜の生成</td><td>ミリポアEMD</td><td>IPVH00010</td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td>GM-CSF発現プラスミドの生成</td></tr><tr><td>QIAquickゲル抽出キット (50)</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td>GM-CSF発現プラスミドの生成</td></tr><tr><td>クイックライゲーションキット</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td>GM-CSF発現プラスミドの生成</td></tr><tr><td>透過型電子顕微鏡</td><td>Hitachi</td><td>HT7700</td><td>電子顕微鏡画像の取得</td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>VWR</td><td>45000-660</td><td>ES-D3細胞の培養</td></tr><tr><td>超遠心分離機、OptimaTM L-100 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>High速度遠心分離機</td></tr><tr><td>超遠心ローター、45Ti</td><td>ベックマン・コールター</td><td>09U4454</td><td>高速遠心分離機</td></tr><tr><td>超遠心ポリカーボネートボトル</td><td>ベックマン・コールター</td><td>355622</td><td>高速遠心分離</td></tr><tr><td>UranyLess染色液</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>22409</td><td>電子顕微鏡画像の取得</td></tr></tbody></table>

胚性幹細胞からの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を運ぶ外生エンリッチ細胞小胞の分離

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

胚性幹細胞(ESC)は、自己再生および分化が可能な多能性幹細胞であり、すべてのタイプの胚細胞に分化することができる。他の多くの細胞タイプと同様に、ESCはエキソソームなどの小さな膜小胞を細胞外環境に放出する。エキソソームは細胞間コミュニケーションの不可欠なメディエーターとして機能し、多くの(パソ)生理学的プロセスにおいて基本的な役割を果たす。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)は、免疫応答を調節するサイトカインとして機能する。エキソソームにおけるGM-CSFの存在は、免疫調節機能を高める可能性を秘めています。ここで、GM-CSFは、マウスESC細胞株ES-D3において安定的に過剰発現していた。GM-CSFを過剰発現するES-D3細胞から高品質のエキソソームエンリッチ細胞小胞(EV)を分離するプロトコルが開発されました。分離エキソソームエンリッチEVは、様々な実験的アプローチによって特徴付けられていた。重要なことに、大量のGM-CSFがエキソソームエンリッチEVに存在することが判明した。全体として、ESCからのGM-CSFを持つエキソソームエンリッチEVは、免疫調節活動を行うために無細胞小胞として機能する可能性があります。

GM-CSFはマウスESCで過剰発現している。 ES-D3細胞中でGM-CSFを安定的に過剰発現させるために、マウスGM-CSF cDNAをトランスフェクションベクターにクローニングし、発現ベクターpEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFPを生成した(図1A)。GM-CSFはトランスフェクションによりES-D3細胞で過剰発現し、一過性トランスフェクションES-D3細胞の約20%がGFP陽性であった。GM-CSFまたは空ベクトル制御を安定的に過剰発現する細胞クローンをFACSによって獲得した。図1Bに示すように、空のベクターを発現するGM-CSF発現ES-D3細胞株またはES-D3細胞株のGFP蛍光強度は、親の細胞株よりもはるかに高かった。ELISAアッセイを実施し、細胞培養上清中の異なる細胞株のGM-CSF濃度を評価した(<strong cl...

この研究では、胚性幹細胞から免疫刺激性顆粒球マクロファージマクロファージを担う外生富化細胞外小胞を単離する方法について説明する。

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

我々のプロトコルは、免疫刺激因子、GM-CSFを発現する胚性幹細胞から高品質のエキソソームエンリッチ細胞小胞を生成するために使用することができる。外因性の富化した細胞外小胞は、GM-CSFを担い、免疫応答を調節できる無細胞免疫調節小胞を提供する可能性を有する。基本的な分子および細胞生物学の訓練を受けた研究者, このプロトコルのように簡単にできるはずです, しかし、初めてこのプロトコルを実行する人は、密接に指示に従う必要があります.私たちのプロトコルは複雑であるため、各ステップの複雑な詳細を視覚化することは、他の研究者がエキソソームフリーFBSを生成し、FBSの所望の体積を超遠回しにし、外生フリー上清を収集するのに役立ちます。ESD 3個の細胞をめっきする前に、室温で15センチメートルの組織培養皿を室温で30分間コーティングします。ESDのフィーダー層細胞を含まないESD細胞を吸引して培養し、5%の炭酸ガス加湿インキュベーターで37°Cの細胞培養液を細胞が90%合流するまで培養した。1皿あたり0.05%トリプシンの5ミリリットルで、新鮮なトリプシンで摂氏37度で5分間のインキュベーションを行い、ほぼコンフルエントな文化を洗います。インキュベーションの終わりに遠心分離管に分離した細胞を引っ張り、新鮮な培養培地の5ミリリットルでトリプシンを不活性化.遠心分離によって細胞を沈降し、過越のために数える新鮮な媒体でパレットを再中断し、 細胞培養後3ミリリットルの新しいゼラチンコーティングプレート上のESDの3細胞の5倍の10~6番目の細胞を3日間培養してから3日間培養し、外因性豊約細胞外小胞板を10回から7番目のESD3細胞に1回採取する。新しいゼラチンコーティングプレートにつきミリリットルの細胞培養培地は、細胞培養上清を収集する前に3日間、外因性の余分な細胞小胞の分離のために、最初の沈降は遠心分離によってESD3細胞を培養した72時間培養した上清内の大細胞断片を沈降させる。上清を収集した後、Ultra遠回しにサンプルを採取し、上清を捨てます。メーカーの指示によると、各パレットを1回のPBSで2回洗浄して残留培養上清を除去し、ビチンコニン酸アッセイで外因性豊結細胞外小胞タンパク質含有量を定量化する。その後、PBSの外因性豊量な細胞外小胞をマイクロメートル濃度あたり6マイクログラムで再中断し、摂氏80度で貯蔵する。透過電子顕微鏡法により外因性富化細胞外小胞を可視化し、室温で2%電子顕微鏡グリッドパラホルムアルデヒドの最終濃度で細胞外小胞の1ミリリットル当たり3〜5マイクログラムを2時間固定した。インキュベーションの最後に、固定サンプルの10マイクロリットルをカーボンサポートフィルムで銅グリッドに1分間ロードしてから、フィルターペーパーでグリッドを排出し、メーカーのプロトコルに従って適切な染色液でグリッドにとどまり、ピンセットを使用してグリッドをフィルターペーパーに転送します。 その後、透過型電子顕微鏡を50,000倍の倍率で使用し、標準的なプロトコルに従って電子顕微鏡画像を取得します。全細胞抽出物を調製するために、示されているように培養物からESD3細胞を採取し、採取した細胞をPBSで再中断してカウントする。2回目の遠心分離の後、0.5%SDS濃度を含むSDSページローディングバッファのマイクロリットル当たり3番目の細胞に5倍10回の細胞を再中断し、10%振幅のソニケーターでサンプルを10秒間超音波処理します。その後、サンプルを摂氏100度で5分間加熱します。エキソソーム濃縮された細胞外小胞のリセートを調製するには、0.5%SDSを含むSDSページ負荷バッファーの外皮濃縮細胞外小胞をマイクロリットル1.2マイクログラムで再中断し、サンプルを10秒間超音波処理し、サンプルを100°Cで5分間加熱します。ウェスタンブロット分析では、10マイクロリットルの卸用抽出物とエキソソーム濃縮細胞外小胞リセートサンプルを、最良のストレスページゲルの個々のウェルにロードします。実行の最後に、PVDF膜にタンパク質を移し、目的の適切な一次および二次抗体で膜をインキュベートし、強化された化学発光検出キットを使用してタンパク質発現を検出する、メーカーの指示に従う。エキソソーム濃縮細胞外小胞内のGM-CSFの量を評価するには、キットのマウスGM-CSFを使用して次に抗GM-CSF捕捉抗体でELISAプレートをコーティングし、100マイクロリットルのPBSでエキソソーム濃縮細胞外小胞サンプルの0.6マイクログラムを治療するか、PBSに加えて0.05%tween 20を室温で30分間室温で処理します。インキュベーションの終わりに、処理したサンプルを調製したELISAプレートの個々のウェルに、室温で1時間インキュベーションし、その後にPBS単独で適切な対応するウェルの洗浄、またはPBSプラス0.05%トゥイーン20を加える。洗浄後、検出抗体をサンプルに加えて、室温で1時間インキュベーションし、PBS単独で洗浄し、PBSに0.05%トゥイーン20を加え、アビジン・ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼを室温で30分間インキュベーションし、続いて450ナノメートルのマイクロプレートリーダーで各ウェルウェルの吸光度を洗浄して測定します。空のベクターを発現するESD3細胞株またはESD 3細胞株を発現するGM-CSFのGFP蛍光強度は、親の細胞株よりもはるかに高い。ELISAは、GM-CSFを発現するESD3細胞が、空のベクターコントロール細胞よりも細胞培養上清において著しく高いレベルのGMCSFを産生することを明らかにした。さらに、3細胞を発現するGM-CSFで生成されるGM-CSFの量は、GM-CSFを発現するSTO線維芽細胞によって生成されるものと同様である。細胞外小胞を導入したベクターから分離した透過電子顕微鏡と、GM-CSFの細胞培養により、予想される直径30~100ナノメートルの範囲内に収まる、異なるサイズの小胞が明らかになります。CD81、アネキシンVおよびフロチリン-1を含むエキソソームマーカーの発現は、細胞外小胞で顕著に増強され、ウェスタンブロット分析による対応する卸売抽出物と比較してESD 3細胞から単離される。重要なことに、ESDに他の細胞下コンパートメントマーカーの存在は、小胞体小胞、プロテインジスルフィドイソメラーゼ、ミトコンドリアマーカー、チトクロムCおよびオックスホス複合IVサブユニットIVおよび細胞質マーカーGAPDHを含む、3つの細胞外小胞を検出しなかった。0.05%トゥイーン20で洗浄した後、コントロール細胞外小胞で検出されたGM-CSFレベルの背景が有意に低下した。これに対し、GM-CSF発現細胞の細胞外小胞中のGM-CSFレベルは、トゥイーン20によって有意に増加した。GMCSFを運ぶ高品質のエキソソーム富化細胞外小胞を獲得することは、このプロトコルの成功のための最も重要なステップです。研究者は、GM-CSF依存性細胞株および動物の研究など、GM-CSFを世話する外因性豊かな細胞外小胞が無細胞免疫調節小胞として機能できるかどうかを判断するなどの追加の実験を行うことができる。これらの外因性豊かな細胞外小胞は、免疫応答の調節が異なる疾患状態にどのように影響するかを探求するために使用することができる。

isolation-exosome-enriched-extracellular-vesicles-carrying

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

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