Name: マウス肝臓における細胞型特異的遺伝子発現プロファイリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: 学ぶTRAP-seqを用いたマウス肝臓における細胞型特異的遺伝子発現プロファイリング。損傷後の肝細胞再生過程における翻訳中mRNAの分離と発現解析により、肝疾患治療の新たな標的発見に貢献します。

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著者は何も開示していない。

TRAP-seqは、エピトープタグ付きリボソームを介してmRNAを翻訳する細胞タイプ特異的な単離のための技術であり、FACS9の時間要件などの制限を回避するFACSアプローチに代わるものを提示する。その代わりに、TRAPはバルク組織から直接RNAを迅速かつ効率的に単離できるため、遺伝子発現の変化を回避できます。TRAP-seqは、ニチシノンの除去後の肝細胞拡張が細胞自律性であり、統合された肝細胞のサブセットの遺伝子発現プロファイリングを可能にするため、再入発性のFah-/-マウス肝臓での使用に特に適しています。トランスジーン。TRAPベクターはまた、cDNA、ショートヘアピンRNA、およびガイドRNAを含む遺伝子活性化またはサイレンシング分子17と共発現し、特定の遺伝子の活性化または阻害のグローバル遺伝子発現に及ぼす影響を研究することができる。あるいは、RosaLSL-GFP-L10Aトランスジェニックマウスは、Cre組換え細胞活性を有する任意の細胞における遺伝子...

脊椎動物の主要な代謝器官として、肝臓はグルコース恒常性、血清タンパク質合成、胆汁酸分泌、および異生物代謝および解毒を担当しています。肝臓は、即時肝不全を防ぐために毒素にさらされた場合に負傷したパレンキマを再生する特別な能力を有する1.しかし、再生の失敗は、アセトアミノフェンまたはアルコール過剰摂取の設定で起こり、急性肝不全2を引き起こす可能性がある。さらに、ウイルス性肝炎感染、脂肪肝疾患、および脂肪肝炎によって引き起こされる慢性肝損傷は、肝線維症、肝硬変、および肝細胞癌3を引き起こす可能性がある。終末期肝疾患に対する唯一の利用可能な治癒治療は移植であるが、臓器不足によって制限され、すべての患者に対する効率的な治療を妨げる4.したがって、有毒な肝臓損傷後の回復過程のより良い理解は、病気の臓器の機能を救出するのに十分な再生を刺激する治療法の開発のために重要である。
肝臓再生の研究のための最も広く適用されたモデルシステムは、げっ歯類の部分肝切除術であり、肝臓の大部分が急速な肝細胞拡張を刺激するために切除される5。しかし、部分的肝切除術は、ヒト6における急性肝傷害の設定においてしばしば観察される免疫細胞浸潤および肝細胞壊死の欠如による有毒な肝損傷に続く肝細胞拡張を再発しない。臓器再生のこの形態をモデル化するより適切なシステムは、適切なチロシン代謝に必要な機能性フマリアルセトー酢酸ヒドロラーゼ(FAH)を欠き、死亡につながる重度の肝臓損傷を発症するFah-/-マウスである7。これらのマウスは、飲料水中の薬物ニティシネによる治療によって無期限に健康な状態に維持することができる。あるいは、FAH発現は、肝細胞のサブセットへのトランスジーン送達によって復元することができ、これはニティシノン除去8の際に肝臓を再設定するために拡大する。
再入発肝細胞の遺伝子発現変化をプロファイリングするためには、隣接する負傷した肝細胞および他の細胞型から汚染されることなく、Fah-/-マウス中の複製肝細胞を特異的に分離するツールが必要である。残念ながら、(1)肝細胞の再入発性の脆弱性は肝灌流後の回復不良につながり、(2)肝細胞の複製は大きさが大きく変動し、単離を行うため、肝細胞の蛍光補助細胞選別(FACS)は困難である。FACSによる純粋な集団の困難な、および(3)肝臓灌流からRNA単離までの手順時間が2時間を超えるため、遺伝子発現プロファイルは、サンプルが獲得される前に実質的な人工的な変化を受ける可能性がある9。
あるいは、肝細胞の再入発におけるエピトープタグ付きリボソームの発現は、臓器収穫直後の親和性精製を用いてリボソームに結合したmRNAをバルク肝臓で積極的に翻訳する迅速な単離を可能にする。組織は、ライサットします。ここでは、翻訳リボソームアフィニティ精製(TRAP)10に続いてハイスループットRNAシーケンシング(TRAP-seq)を行い、Fah-/--における肝細胞の再入発においてmRNAを特異的に分離およびプロファイルするプロトコルについて説明する。マウス9.FAHと緑色蛍光タンパク質タグ付きリボソームタンパク質(GFP:RPL10A)の共発現により、GFP:RPL10Aを含むポリソームに結合したmRNAの翻訳の親和性精製が可能になります。この方法は、肝細胞の再入発性に脆弱な再入発性を分離するために肝灌流などの細胞解離ステップを回避する。代わりに、臓器組織および抗体全体のリシスを利用して、標的細胞から特異的にRNAを迅速に抽出します。最後に、TRAP-seqを介した豊富で高品質なmRNAの単離により、シーケンシング解析などの下流アプリケーションを使用して、再集団化プロセス中の遺伝子発現の動的変化をプロファイリングすることができます。

<table><tbody><tr><td>10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated</td><td>DWK Life Sciences (Wheaton)</td><td>358007</td><td></td></tr><tr><td>Absolutely RNA Miniprep Kit</td><td>Agilent</td><td>400800</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP Antibodies</td><td>Memorial Sloan-Kettering 抗体 &バイオリソースコア</td><td>GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン、IgGフリー、プロテアーゼフリー</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete、Mini、EDTAフリープロテアーゼ阻害剤 カクテル</td><td>ロシュ</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>シクロヘキシミド</td><td>ミリポアシグマ</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>デオキシコール酸、DOC</td><td>ミリポア</td><td>ΣD2510</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース、デキストロース</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>D16</td><td></td></tr><tr><td>DL-ジチオスレイトール</td><td>ミリポアシグマ</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>ダイナビーズ MyOne ストレプトアビジン T1</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>65602</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド シャーレ クリアフッド付き</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (10x)、カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドなし</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES、1 M 溶液、pH 7.3、分子生物学グレード、超高純度、Thermo Scientific</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AAJ16924AE</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム、MgCl2&nbsp;</td><td>ミリポアシグマ</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>メタ</td><td>ノール フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A452</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c 分光光度計</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>VV-83061-00</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Poly(A) mRNA 磁気隔離モジュール</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>E7490S</td><td></td></tr><tr><td>イルミナ用 NEBNext ウルトラ RNA ライブラリ準備キット</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>E7530S</td><td></td></tr><tr><td>ノニルフェニルポリエチレングリコール、NP-40。IGEPAL CA-630</td><td>Millipore Sigma</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>オーバーヘッドスターラー</td><td>DWK Life Sciences (Wheaton)</td><td>903475</td><td></td></tr><tr><td>PBS Buffer (10x), pH 7.4</td><td>Ambion</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>29997</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム、KCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Pico キット &試薬</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Ribonuclease Inhibitors</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム, NaN3</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム, NaHCO3</td><td>Millipore Sigma</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>スーパーアセ&ミッドドット;RNase阻害剤</td><td>Invitrogen</td><td>AM2694</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス肝臓における細胞型特異的遺伝子発現プロファイリング

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

損傷後の肝臓の再集団は、環境毒素の暴露後の即時臓器不全および死亡を防ぐ哺乳類の重要な特徴である。再集団化中に起こる遺伝子発現の変化をより深く理解することは、傷害の設定における肝機能の回復を促進する治療標的の同定に役立つ可能性がある。それにもかかわらず、再入発性肝細胞を特異的に単離する方法は、細胞マーカーの欠如、限られた細胞数、およびこれらの細胞の脆弱性によって阻害される。肝臓損傷の設定で再集団を再キャパチングするFah-/-マウスモデルと連動したリボソームアフィニティ精製(TRAP)技術の開発により、再入生の遺伝子発現プロファイリングが可能肝 細胞。TRAPを使用すると、細胞型特異的翻訳mRNAは迅速かつ効率的に単離されます。緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ付きリボソームタンパク質(RP)、GFP:RPL10Aを選択的に発現する肝細胞からのmRNAの翻訳を親和性ベースで単離したTRAPを利用する方法を開発した。TRAPは、遺伝子発現プロファイルを変化させる可能性のある蛍光活性化細胞選別に必要な長い期間を回避します。さらに、再入発性肝細胞のみがGFP:RPL10A融合タンパク質を発現するので、単離されたmRNAは、肝臓の周囲の負傷した肝細胞および他の細胞型からの汚染を欠いている。親和性精製mRNAは高品質であり、遺伝子発現の下流PCRまたはハイスループットシーケンシングベースの解析を可能にします。

Fah-/-マウスの肝細胞を再移植する遺伝子発現をプロファイリングするために、Gfp:Rpl10a融合およびFahトランスジーンはトランスポゾン含有プラスミド8(TRAPベクター)内で肝臓に共送される流体力学注入 (図 1A)ニチシノンの除去は、負傷したパレンキマ9を再設定するためにFAHを安定的に発現する肝細胞の選択圧力を作成する有毒な肝臓損傷を誘発する。免疫蛍光染色は、肝再集団の2週間後に肝細胞を再入発するFAHとGFP:RPL10A融合タンパク質の共発現を確認する(図1B)。
以下の代表的な実...

リボソームアフィニティ精製(TRAP)の翻訳により、細胞型特異的翻訳mRNAの迅速かつ効率的な単離が可能になります。ここでは、肝再集団とTRAPのマウスモデルにおける流体力学的尾静脈注射を組み合わせた方法を示し、再入発性肝細胞の発現プロファイルを調べる。

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

TRAP-seqを使用すると、負傷した肝臓で再び再び行う肝細胞などの特定の細胞タイプからRNAを分離し、それらの細胞で起こる遺伝子発現変化を分析することができます。組織から不要な細胞を除去するための任意の手順を必要としません。.細胞型特異的RNAは、全臓器ライセートからの親和性精製によって単離される。この技術は、特定の細胞が傷害にどのように反応するかを決定するのに役立ちます, 肝臓病と戦うために新しい戦略や薬物を特定するのに役立ちます.これは、肝細胞が肝傷害の異なるタイプに応答する方法を識別するために使用することができます.現在、重度の急性肝損傷の選択肢はほとんどなく、この方法は新しい治療法を手がかりにするのに役立ちます。この方法は、脳に由来します。肝臓では、様々な細胞タイプ、肝細胞、胆管細胞、クファー細胞、内皮細胞の動的変化を調べるために使用できると思い描きました。手順を実証するには、大学院生のアンバー・ワンと私のメンティーです。まず、穏やかなピペットで磁気ビーズを再中断します。1分以上磁気スタンドにビーズを収集し、上清を取り除きます。次に、マイクロ遠心分離チューブを磁気スタンドから取り出し、PBSを1ミリリットル加え、続いて上下にピペット処理してビーズを洗浄します。チューブを磁気スタンドに1分以上戻し、ビーズを回収し、PBSを取り除きます。タンパク質Lコーティングビーズを調製するには、再懸濁および洗浄された磁気ビーズに16マイクロリットルのビオチン化タンパク質Lを加え、1.5ミリリットルのマイクロセントレンジフュージチューブを使用する場合は1ミリリットル、または2ミリリットルのマイクロ遠心チューブを使用する場合は1.5ミリリットルの最終体積を1ミリリットルにする1X PBSを追加します。ビオチン化タンパク質Lを用いた磁気ビーズをチューブローテーターの室温で35分間インキュベートします。次に、チューブを磁性スタンドに1分以上置き、上澄み液を取り除き、タンパク質Lコーティングビーズを採取します。磁気スタンドからマイクロ遠心分離チューブを取り出し、3%BSAバッファーを含むPBSの1ミリリットルを加え、続いて少なくとも5回穏やかなピペットを加え、タンパク質Lコーティングビーズを洗浄します。再度、1分以上磁気スタンドにチューブを置き、上清を取り除いてコーティングされたビーズを集める。BSAをもう4回洗う。次に、GFP抗体19C8およびGFP抗体19F7に対する抗体をそれぞれタンパク質Lコーティングビーズに50マイクログラム添加し、チューブローテーター上で摂氏4度で1時間インキュベートする。親和性マトリックスを収集するには、チューブを磁気スタンドに1分以上置き、上清を取り除きます。磁性スタンドからチューブを取り除き、低塩バッファーの1ミリリットルを追加します。上下に軽くピレットして親和性マトリックスを洗浄し、低塩バッファーをもう2回洗浄します。低塩バッファーの 200 マイクロリットルにビーズを再懸濁し、200 マイクロリットルの親和性マトリックスを作ります。まず、PTFEガラス管を均質化中に氷の上に置くことができるように組織粉砕機を設置する。4ミリリットルの冷たいライシスバッファーをPTFEガラスチューブに充填します。ペトリ皿の上に肝臓を置きます。ナイフを使って200~500ミリグラムの肝臓片を分離し、PTFEガラス管に移動します。残りの肝臓組織を冷やされたマイクロ遠心分離チューブに入れ、液体窒素でフラッシュフリーズします。肝臓構造から肝細胞を解離するために少なくとも5ストロークの場合、300rpmから始まるモータ駆動ホモジナイザーでサンプルを均質化する。ガラス管を毎回下げなさい。害虫を溶液の下に保つことによって、タンパク質の変性を引き起こす可能性のある通液を防ぎます。次に、少なくとも12の完全な脳卒中のために肝臓組織を完全に均質化するために900 rpmに速度を上げます。ライセートを、それぞれ1ミリリットル以下のラベル付きおよび冷蔵チューブに移します。核リシスを開始するには、肝臓リセートを摂氏4度で2,000倍の10分間遠心し、上清を氷の上の新しい冷蔵マイクロ遠心チューブに移します。氷上のマイクロ遠心分離管に10%NP-40の上清体積の1/9分を加え、チューブをそっと反転させて溶液を混ぜます。ミニ遠心分離機でマイクロ遠心チューブを素早く回転させ、サンプル量の1/9分の1を10%DOCに加え、マイクロ遠心チューブを優しく反転させ、マイクロ遠心チューブを素早く回転させ、氷の上で5分間インキュベートします。核ライゼを摂氏4度で20,000倍の10分間遠心分離し、上清を氷上の新しい冷蔵マイクロ遠心分離管に移す。各チューブについて、免疫沈降制御前として上清の総体積の1%を取り出す。一晩摂氏4度のチューブ回転器に免疫前沈降制御を置きます。ピペット処理で親和性マトリックスを穏やかに再中断し、各サンプルに200マイクロリットルを加えます。チューブ回転機に穏やかな混合で一晩摂氏4度でライセートをインキュベートします。RNAを単離するには、ミニ遠心分離機にライゼートを含むチューブを素早く回転させ、少なくとも1分間磁気ラックに置いてビーズを回収します。追加のマイクロ遠心チューブに上清を収集します。各チューブに新鮮な高塩バッファーを1ミリリットル加え、その後、泡を導入せずに少なくとも5回は穏やかなピペットを加えます。氷上の磁気スタンドにビーズを1分以上集め、上清を取り除きます。洗浄手順をさらに4回繰り返します。次に、磁気スタンドからマイクロ遠心チューブを取り出し、室温で5分間温めます。0.7マイクロリットルのβ-メルカプトエタノールでビーズを100マイクロリットルのリシスバッファーに再懸濁し、親和性マトリックスから結合RNAを放出する。最高速度で少なくとも5秒間チューブを渦し、すぐにスピンダウンします。その後、室温でチューブを10分間インキュベートする。チューブを磁気スタンドに少なくとも1分間置き、上清を回収し、キット内のRNA浄化プロトコルに従ってすぐにRNAクリーンアップに進みます。単離されたRNAの最高品質を達成するために、DNase消化および60°Cへの溶出バッファーの推奨予熱を含むすべてのRNA溶出ステップを含むすべての任意のステップを実行します。本研究では、GFP-L10A融合とFahトランス遺伝子を、トランスポゾン含有プラスミドトラップベクター内で流体力学的注射によって肝臓に共送した。ニティシニンの除去は、有毒な肝障害を誘発した。免疫蛍光染色は、2週間の肝臓再集団の後にFAHとGFP-L10A融合タンパク質および再ポピュレーション肝細胞の共発現を確認した。静止サンプルは、すべての肝細胞がAAV8-TBG-Cre注射後にGFP-L10Aを発現するため、融合タンパク質の最高収率を生み出した。逆に、GFP-L10Aトランスジーンを持たない野生型コントロールでは、ほとんどRNAが検出可能ではなく、TRAP手順が非常に特異的でバックグラウンドが低いことを示しています。TRAPをGFP-L10A導入肝細胞で再集団化した肝臓組織に使用した場合、豊富な高品質RNAが得られた。対照的に、陰性対照試料のバイオアナライザを介してRNAトレースは検出されなかった。Gsta1発現は、静止肝細胞と比較して肝細胞を再導入する際に10倍以上に誘導されたが、入力RNAの欠如のために野生型マウスからのTRAP分離RNAでは閾値サイクル値は検出されなかった。組織を均質化する際には、気圧を防ぐために、害虫をゆっくりと動かしてください。RNAを単離した後、ハイスループットシーケンシングまたはqPCRを行い、遺伝子発現を解析することができる。TRAP-seqでは、RNAを肝細胞の再導入から特異的に分離し、肝臓再集団における遺伝子発現の変化を解析する方法を有するようになりました。これにより、このプロセス中に変化する遺伝子と肝臓損傷の治療のための潜在的な治療標的を同定することができます。シクロヘキシミドとDTTは、いずれも毒性がある。廃棄物は、制度上のガイドラインに従って回収し、廃棄する必要があります。

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Biology

生物学

単一細胞の発現プロファイリングは、個々の細胞の詳細な遺伝子発現解析が可能になります。我々は心筋細胞の単離のための方法を説明し、特定のターゲットの全トランスクリプトームのマイクロアレイや定量PCRのどちらかの結果のライセートを調製した。...

成体マウスの心筋細胞の単一細胞転写プロファイリング

流体力学的遺伝子送達による裸のDNAのin vivoトランスフェクションは、最小限の炎症反応と動物の組織に遺伝子を導入しています。遺伝子産物の十分な量は、遺伝子の機能および調節、ならびにタンパク質の構造および機能を分析することができるように生成される。...

マウスにおける流体力学的遺伝子送達によるタンパク質の一過性発現

私たちは、端末赤血球生成の初期および後期段階を解剖インビトロマウス胎児肝臓赤芽球培養系を提示。このシステムは、異なる発生段階における特定の遺伝子の機能解析を容易にします。...

マウス胎児肝臓培養システムは、ターミナル赤血球の初期および後期段階での標的遺伝子の機能を分析する

このプロトコルは、クローンレベルでの遺伝子の大規模な配列の発現を評価する方法について説明します。単一細胞RT-qPCRをサンプルと数百の遺伝子のための強力な感度を有する信頼性の高い結果が得られます。...

レアリンパ集団の不均一性を特徴づけるためにマルチプレックスRT-qPCRのを使用した単一細胞の遺伝子発現

ここでは、マウス胚組織における遺伝子発現をプロファイルする多重化単一細胞mRNAシーケンシング法を提示した。多重化戦略と組み合わせた液滴ベースの単一細胞mRNAシーケンシング(scRNA-Seq)法は、複数のサンプルから単一細胞を同時にプロファイルできるため、試薬コストを大幅に削減し、実験的なバッチ効果を最小限に抑えることができます。...

マウス胚細胞の多重化単細胞mRNAシーケンシング解析

このプロトコルは、マウスから実行可能な精密カット肝スライスを製造するための簡単で信頼性の高い方法を提供します。このエクスビボ組織サンプルは、ラボ組織培養条件下で複数回維持することができ、肝臓病理生物学を調べる柔軟なモデルを提供する。...

肝臓生物学のEx Vivoモデルとしてのマウス精密カット肝臓スライス

ここでは、初代マウス肝臓正弦波内皮細胞(LSEC)単離のためのプロトコールを概説し、実証する。このプロトコールは、肝臓コラゲナーゼ灌流、低速遠心分離による非実質細胞精製、およびCD146磁気ビーズ選択に基づいている。また、フローサイトメトリーと走査型電子顕微鏡を用いて、これらの単離されたLSECの表現型と特性評価も行っています。...

マウス初代肝臓正弦波内皮細胞の単離と特性評価

本プロトコルは、パラホルムアルデヒド固定および最適切断温度化合物埋め込みマウス肝組織の定義された組織領域からRNAをレーザーキャプチャマイクロ解剖を用いて単離し、ターゲットを絞った下流遺伝子発現解析を可能にする方法を説明しています。...

パラホルマルデヒド固定マウス肝組織のレーザーキャプチャ顕微解剖によるRNA解析

この手順では、マウス骨髄からプライマリ造血細胞培養を確立し、ジーンパルサーMXCellのエレクトロポレーションシステムを用いてトランスフェクションが続いている方法について説明します。...

エレクトロポレーションのためのマウス骨髄からの一次造血細胞培養の準備

ここではでマウス網膜神経節細胞（RGCs）で遺伝子発現を操作するための2つのテクニックを紹介...

マウス網膜神経節細胞における遺伝子発現のための子宮内および生体外でのエレクトロポレーションで

学ぶTRAP-seqを用いたマウス肝臓における細胞型特異的遺伝子発現プロファイリング。損傷後の肝細胞再生過程における翻訳中mRNAの分離と発現解析により、肝疾患治療の新たな標的発見に貢献します。

マウス肝臓における細胞型特異的遺伝子発現プロファイリング

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