Name: 自由に動く動物の神経活動を記録するマルチファイバー光メトリー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: 学ぶマルチファイバー光メトリーによる自由に動く動物の神経活動記録法。カルシウム非依存的アーチファクト補正とデュアルカラーイメージングを用いて、特定の神経集団の活動を行動と関連付けて解析する手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、カナダ自然科学工学研究評議会(NSERC:RGPIN-2017-06131)からC.P.C.P.への助成金によって支援されました。我々はまた、この研究で使用されるウイルスベクターの生産のためのプレートフォルム・ドゥティルス・モレキュアレス(https://www.neurophotonics.ca/fr/pom)に感謝する。

すべての実験は、カリフォルニア大学サンディエゴ校の施設動物ケアおよび使用委員会、および実験動物のケアと使用に関するカナダガイドに従って行われ、ラバル動物保護大学によって承認されました。委員 会。
1. CMOS(相補金属酸化物半導体)カメラと個々または分岐パッチコードとの間の光路の位置合わせ
<ol><li>5 軸トランスレータのすべてのネジを緩めます (11,図 2B)。</li>
	<li>パッチコード(図2B)のネジは、5軸トランスレータに貼付されたアダプタ[SMA(サブミニチュアA)またはFC(光ファイバコネクタ))]に取り付け済み。</li>
	<li>470 nm励起光(図2B)を低出力(100μW)でオンにし、パッチコードの先端を自己蛍光プラスチックスライドを指します。これは、将来の記録には関係ありませんが、アライメントプロセスを視覚化するためのものです。</li>
	<li>CMOSカメラ(13、図2B)からライブモードで記録します。イメージが完全に黒でないまで、ゲインを増やすか、ルックアップ テーブル (LUT) を調整します。ポイントは、目的の焦点で画像を見ることができる(10、図2B)。</li>
	<li>5 軸のトランスレータを目的に進み、470 nm の光がパッチ コードの SMA または FC 端のファイバの中央に配置されていることを確認し、カメラで画像を解決します。</li>
	<li>イメージが中央に配置され、適切に解決されるまで、X 軸と Y 軸を調整します。</li>
	<li>パッチ コードのフェルール端から放出されるライトを視覚化します。等方性円として表示されます。分岐パッチコードを使用する場合、各パッチコードのフェルール端部で放出される光の量は同様である必要があります。円が等方性でない場合、または放出された光が等しくない場合は、X-Y 軸の 5 軸トランスレータを調整します。</li>
</ol>2. 平均蛍光強度測定用繊維周辺のROIの設定
<ol><li>すべての励起ライトをオンにして、繊維をより良く視覚化します。ピクセルが飽和し、繊維の鮮明な画像が存在しないようなカメラゲインを調整します。</li>
	<li>ライブレコードや予備画像を撮ります。</li>
	<li>繊維の周りにROIを描画し、記録中の平均強度値の測定のためにそれらを維持します(図2A)。</li>
	<li>複数のファイバ記録の場合は、信号の独立性をテストします。<ol>
<li>すべての繊維からのライブレコード。</li>
		<li>1 本のファイバを光源に向け、指でタップします。非常に大きな変動は、そのチャネルでのみ発生する必要があります(許容漏れ1:1000)。</li>
		<li>信号が独立していない場合は、より保守的なROIを再描画し、独立テストを繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>どのROIがどの繊維、着色テープまたはマニキュアに対応しているかをラベル付けし、追跡するために、繊維の端部に適用することができます。実験を開始する前に、セカンダリリマインダーとして写真を撮ります。</li>
</ol>3. レコーディングアリーナの設定
<ol><li>スタンド、クランプ、またはホルダーを使用して、パッチコードをアリーナの上に掛けます。</li>
	<li>動物が繊維の長さによって抑制されずに、アリーナ全体を自由に動くことができることを確認してください。</li>
	<li>オペラボックスまたはオープンフィールドを使用するかどうかにかかわらず、パッチコードが最小限の曲げで動物に到達できることを確認してください。鼻突きが必要な場合は、繊維の曲げを防ぐのに十分なスペースオーバーヘッドがあることを確認します。パッチコードの曲がりやねじれは避けてください。</li>
</ol>4. インビボ録音
注:繊維光メトリー実験のための光ファイバーカニューレ移植の手順は、スパルタら15に記載されている光遺伝学の手順と同一である。頭蓋骨にヘッドキャップの強い固定を提供する歯科用セメント(材料の表を参照)を使用することをお勧めします。歯科用セメントは、固定ネジが使用できない場合に特に有用です。
<ol><li>パッチコードの繊維の遠位端を目とミニファイバー顕微鏡で目で目で検査します。繊維の表面に傷が付いている場合は、細かいグリット(1 μmおよび0.3 μm)で繊維研磨/ラッピングフィルムを使用して繊維を再研磨します。</li>
	<li>70%のエタノールと綿の先端アプリケーターでパッチコードの遠位端をきれいにします。</li>
	<li>70%エタノールと綿の先端アプリケーターを使用して光ファイバーカニューレをきれいにします。</li>
	<li>黒い収縮管で覆われたセラミックスプリットスリーブを使用して、パッチコードのフェルール端を埋め込んだ繊維に接続します。接続中に、スリーブがタイトであることを確認し、それ以外の場合は新しいスリーブを使用してください。 注:パッチコードフェルールとインプラントの間にスペースがあり、録音が機能しない場合、大量の信号損失が生じるでしょう。</li>
	<li>行動テストを開始する前に、動物が数分間回復できるようにします。</li>
	<li>光信号の記録を開始し、実験を実行します。</li>
	<li>録音中は、ライブトレースに注意して、品質の高い録音を確保してください。信号は、記録の最初の2分の時間の関数として急速に減少することが予想されます。この効果は、熱媒介LED崩壊によって引き起こされ、それによって熱の増加は、光学素子の抵抗を増加させる。</li>
	<li>GCaMPのオン/オフ運動を超える信号のジャンプが発生した場合、これは多くの場合、スリーブが十分にタイトではなく、パッチコードとインプラントの間のスペースが変化していることを示しています。この場合、実験を中止し、新しいスリーブを使用して動物を再接続します。</li>
</ol>5. ファイバーフォトメトリーデータ分析
注: これは、ほとんどの録画に適したデータ分析の方法です。ただし、別の方法を実装できます。データ分析の例コードは、https://github.com/katemartian/Photometry_data_processingここに見つけることができます。
<ol><li>抽出は、470nm(Int 470)および410nm(Int 410)LEDから記録された蛍光強度値を平均し、個々の繊維に対応する。</li>
	<li>移動平均アルゴリズムを使用して各信号を滑らかにします(図3A)。</li>
	<li>アダプティブ繰り返し再重み付けされたペナルティ最小二乗(airPLS)アルゴリズム(https://github.com/zmzhang/airPLS)を使用して各信号のベースライン補正を実行し、傾きと低周波を除去します。信号の変動。</li>
	<li>平均値と標準偏差を使用して各信号を標準化します (図 3C): <img alt="統計解析方程式、Z変換、強度正規化、データ処理式。" src="/files/ftp_upload/60278/60278equ01v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1">
</li>
	<li>非負の強い線形回帰を使用して、標準化された zInt410 から zInt470 シグナル (図 3D)を回帰関数に適合します。 <img alt="線形方程式 \( y = ax + b \);数式のイラスト;代数研究、方程式解析。" src="/files/ftp_upload/60278/60278equ02v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2"><ol>
<li>線形回帰(a, b)のパラメータを使用して、zInt 470(fitInt410,図 3D,E)に適合したzInt410 の新しい値を見つけます。 <img alt="線形回帰方程式、図、fitzInt410 = a * zInt410 + b;データ分析、調査研究。" src="/files/ftp_upload/60278/60278equ03v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 3">
</li>
	</ol>
</li>
	<li>正規化されたdF/F (z dF/F) (図 3F) を計算します。 <img alt="信号処理解析に関連する数式z dF/F=zInt470-fitzInt410。" src="/files/ftp_upload/60278/60278equ04v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 4">
</li>
</ol>6. 同時デュアルカラー録音
<ol><li>フォトメトリーシステムに560nm LEDを追加して、赤色蛍光カルシウムセンサと適切なダイクロイックミラーおよびフィルタを励起する(詳細についてはKim et al., 2016を参照)12。</li>
	<li>目的とCMOSカメラの間に画像分割機を追加して、緑と赤の発光波長を分離します(図5参照)。画像スプリッタは、赤と緑の信号に対応するカメラセンサー上の2つのミラー画像を形成します(例えば、3つの枝を持つパッチコードは、6繊維を持つ画像を作成します)。</li>
	<li>上記のように、両方の色ですべてのファイバの周りにROIを描画します。対応するファイバとチャネル(緑と赤)で各ROIを明確に識別してください(図4A)。</li>
	<li>470 nm および 560 nm LED で同時励起をトリガーし、410 nm LED (図 5A)で交互に使用します。</li>
</ol>7. デュアルカラーデータ解析
<ol><li>セクション 5 の手順に従って、Int470 信号のfitInt410 を見つけ、z dF/Fを計算します。</li>
	<li>赤シフト GEC のアイソスベスト ポイントは一般に不明であるため、緑色チャネルに 410 nm LED で記録された信号は、両方のチャネルでの移動補正に使用できます。セクション 5 の手順に従って、Int560 信号のfitInt410 を見つけ、z dF/Fを計算します。</li>
</ol>

<ol><li>Gunaydin, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+Neural+Projection+Dynamics+Underlying+Social+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Natural Neural Projection Dynamics Underlying Social Behavior.</a> Cell. 157 (7), 1535-1551 (2014).</li>
<li>Proulx, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neural+pathway+controlling+motivation+to+exert+effort%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A neural pathway controlling motivation to exert effort.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (22), 5792-5797 (2018).</li>
<li>Muir, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Fiber+Photometry+Reveals+Signature+of+Future+Stress+Susceptibility+in+Nucleus+Accumbens%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">In Vivo Fiber Photometry Reveals Signature of Future Stress Susceptibility in Nucleus Accumbens.</a> Neuropsychopharmacology. 43 (2), 255-263 (2017).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+shapes+the+aversion+and+reward+responses+of+lateral+habenula+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Learning shapes the aversion and reward responses of lateral habenula neurons.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>de Jong, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Neural+Circuit+Mechanism+for+Encoding+Aversive+Stimuli+in+the+Mesolimbic+Dopamine+System%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Neural Circuit Mechanism for Encoding Aversive Stimuli in the Mesolimbic Dopamine System.</a> Neuron. 101 (1), 133-151 (2018).</li>
<li>Lerner, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact-Brain+Analyses+Reveal+Distinct+Information+Carried+by+SNc+Dopamine+Subcircuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intact-Brain Analyses Reveal Distinct Information Carried by SNc Dopamine Subcircuits.</a> Cell. 162 (3), 635-647 (2015).</li>
<li>Calipari, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+identifies+temporal+signature+of+D1+and+D2+medium+spiny+neurons+in+cocaine+reward%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging identifies temporal signature of D1 and D2 medium spiny neurons in cocaine reward.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (10), 2726-2731 (2016).</li>
<li>González, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+Interplay+between+Orexin+Neurons+and+Eating%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibitory Interplay between Orexin Neurons and Eating.</a> Current Biology. 26 (18), 2486-2491 (2016).</li>
<li>Chen, T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Barker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+Preoptic+Control+of+the+Lateral+Habenula+through+Convergent+Glutamate+and+GABA+Transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Lateral Preoptic Control of the Lateral Habenula through Convergent Glutamate and GABA Transmission.</a> Cell Reports. 21 (7), 1757-1769 (2017).</li>
<li>Siciliano, C. A., Tye, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+calcium+imaging+to+illuminate+circuit+dysfunction+in+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">Leveraging calcium imaging to illuminate circuit dysfunction in addiction.</a> Alcohol. 74, 47-63 (2018).</li>
<li>Kim, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+fast+measurement+of+circuit+dynamics+at+multiple+sites+across+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain.</a> Nature Methods. 13 (4), 325-328 (2016).</li>
<li>Sych, Y., Chernysheva, M., Sumanovski, L. T., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+multi-fiber+photometry+for+studying+large-scale+brain+circuit+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density multi-fiber photometry for studying large-scale brain circuit dynamics.</a> Nature Methods. 16 (6), 553-560 (2019).</li>
<li>Akam, T., Walton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pyPhotometry%3A+Open+source+Python+based+hardware+and+software+for+fiber+photometry+data+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">pyPhotometry: Open source Python based hardware and software for fiber photometry data acquisition.</a> Scientific Reports. 9 (1), 3521(2019).</li>
<li>Sparta, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+implantable+optical+fibers+for+long-term+optogenetic+manipulation+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits.</a> Nature Protocol. 7 (1), 12-23 (2011).</li>
<li>Stamatakis, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+Hypothalamic+Area+Glutamatergic+Neurons+and+Their+Projections+to+the+Lateral+Habenula+Regulate+Feeding+and+Reward%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Lateral Hypothalamic Area Glutamatergic Neurons and Their Projections to the Lateral Habenula Regulate Feeding and Reward.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (2), 302-311 (2016).</li>
<li>Tervo, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Designer+AAV+Variant+Permits+Efficient+Retrograde+Access+to+Projection+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons.</a> Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).</li>
<li>Yu, K., da Silva, P., Albeanu, D. F., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+Amygdala+Somatostatin+Neurons+Gate+Passive+and+Active+Defensive+Behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Central Amygdala Somatostatin Neurons Gate Passive and Active Defensive Behaviors.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (24), 6488-6496 (2016).</li>
<li>Falkner, A. L., Grosenick, L., Davidson, T. J., Deisseroth, K., Lin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothalamic+control+of+male+aggression-seeking+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hypothalamic control of male aggression-seeking behavior.</a> Nature Neuroscience. 19 (4), 596-604 (2016).</li>
<li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomically+Defined+and+Functionally+Distinct+Dorsal+Raphe+Serotonin+Sub-systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Anatomically Defined and Functionally Distinct Dorsal Raphe Serotonin Sub-systems.</a> Cell. 175 (2), 472-487 (2018).</li>
<li>Barnett, L. M., Hughes, T. E., Drobizhev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+molecular+mechanism+responsible+for+GCaMP6m%E2%80%99s+Ca2%2B-dependent+change+in+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Deciphering the molecular mechanism responsible for GCaMP6m’s Ca2+-dependent change in fluorescence.</a> PLOS ONE. 12 (2), 0170934(2017).</li>
<li>Sun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genetically+Encoded+Fluorescent+Sensor+Enables+Rapid+and+Specific+Detection+of+Dopamine+in+Flies%2C+Fish%2C+and+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice.</a> Cell. 174 (2), 481-496 (2018).</li>
<li>Patriarchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+neuronal+imaging+of+dopamine+dynamics+with+designed+genetically+encoded+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ultrafast neuronal imaging of dopamine dynamics with designed genetically encoded sensors.</a> Science. 360 (6396), (2018).</li>
<li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genetically+Encoded+Fluorescent+Sensor+for+Rapid+and+Specific+In+Detection+of+Norepinephrine%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Genetically Encoded Fluorescent Sensor for Rapid and Specific In Detection of Norepinephrine.</a> Neuron. 102 (4), 745-761 (2019).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+red+protein+calcium+indicators+for+imaging+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity.</a> eLife. 5, (2016).</li>
<li>Wang, H., Jing, M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lighting+up+the+brain%3A+genetically+encoded+fluorescent+sensors+for+imaging+neurotransmitters+and+neuromodulators%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Lighting up the brain: genetically encoded fluorescent sensors for imaging neurotransmitters and neuromodulators.</a> Current Opinion in Neurobiology. 50, 171-178 (2018).</li>
<li>Lu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wireless+optoelectronic+photometers+for+monitoring+neuronal+dynamics+in+the+deep+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Wireless optoelectronic photometers for monitoring neuronal dynamics in the deep brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (7), 1374-1383 (2018).</li>
<li>Jennings, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+Hypothalamic+Network+Dynamics+for+Appetitive+and+Consummatory+Behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing Hypothalamic Network Dynamics for Appetitive and Consummatory Behaviors.</a> Cell. 160 (3), 516-527 (2014).</li>
</ol>

セージ・アロンソンは、マルチファイバーフォトメトリーシステムを販売するニューロフォトメトリクス社のCEO兼創設者です。

ファイバーフォトメトリーは、研究者が自由に動く動物の定義されたニューロン集団からバルクカルシウムダイナミクスを記録することを可能にするアクセス可能なアプローチです。この方法は、強制水泳テスト2、恐怖コンディショニング18、社会的相互作用1、4、および他7などの「運動重い」タスクを含む行動テストの広い範囲と組み合わせることができます。8,19,20.これにより、研究者は、特定の神経集団におけるどのような行動や刺激駆動活動を観察したり、その逆を行ったりすることができます。
その素顔のシンプルさにもかかわら...

神経反応を動物の行動の特定の側面と相関させる能力は、特定のニューロングループが行動や刺激を指示または応答する際に果たす役割を理解するために重要です。動物の行動の複雑さを考えると、最も単純な行動にも影響を与える可能性のある無数の内部状態と外部刺激により、単一試用解像度で信号を記録すると、これらを克服するために必要なツールを研究者に提供します。制限。
ファイバーフォトメトリーは、生体内記録技術の他に比べて相対的なシンプルさ、高い信号対雑音比、および様々なシステム神経科学の分野で多くの研究者にとって選択の技術となっています。行動パラダイム1,2,3,4,5,6,7,8.従来の電気生理学的方法とは異なり、フォトメトリーは、遺伝的にコードされたカルシウム指標(GECI、GCaMPシリーズ)9と組み合わせて最も一般的に使用される光学的アプローチです。GECIsは、カルシウムに結合しているかどうかに基づいて蛍発性を変化させます。ニューロン中のカルシウムの内部濃度は非常に厳しく調節され、ニューロンが作用電位を発射すると電圧ゲートカルシウムチャネルが開くため、一過性の内部カルシウム濃度が増加し、蛍光に対するGECIの能力は、ニューロン発射9の良好なプロキシでありうる。
光ファイヤを使用すると、励起光は薄いマルチモードの光ファイバを脳に送り込み、発光信号を同じ繊維を通して回収します。これらの光ファイバは軽量で曲げ可能であるため、動物はほとんど妨げられずに移動することができ、この技術は、行動テストや条件の広い配列と互換性があります。光ファイバ パッチ コードの急速な動きや曲げなど、内部反射全体を維持できる半径を超える一部の条件では、信号アーティファクトが発生する可能性があります。ノイズからの信号を曖昧にするために、我々は「アイソスベストポイント」として知られているGCaMPのプロパティを利用することができます。簡単に言えば、GCaMPでは、励起光の波長が左にシフトするにつれて、カルシウム結合状態での発光が減少し、カルシウム非結合状態での放出がわずかに増加する。これら2つの放出の相対的強度が等しい点は、イソスベスティックポイントと呼べられている。GCaMPがこの時点で興奮すると、その発光は内部カルシウム濃度の変化の影響を受けず、信号の分散は、光ファイバパッチコードのオーバーベンディングまたは神経組織の動きによる信号の減衰が最も頻繁に起こる。埋め込まれた繊維に対して相対的である。
単一単位の電気生理学は単一細胞および単一スパイクのレベルの決断による生体内の記録で自由に動かすための金の標準である。しかし、記録されている細胞の分子的アイデンティティを特定することは困難であり、ポストホック分析は非常に面倒な場合があります。繊維フォトメトリーは単一細胞分解能を持たないが、研究者は従来の技術では対応できない質問をすることができます。ウイルス戦略とトランスジェニック動物を組み合わせることで、GECの発現は遺伝的に定義されたニューロン型に向けられ、集団または投影定義の神経活動を記録することができ、これは軸でカルシウムシグナルを直接モニタリングすることによって行うことができる。ターミナル10,11.さらに、複数の光ファイバーカニューレを埋め込むことにより、同じ動物12、13内の複数の脳領域および経路からの神経活動を同時に監視することができる。
本原稿では、単繊維およびマルチファイバーフォトメトリーの技術、カルシウムに依存しないアーティファクトの補正方法、モノカラーとデュアルカラーの記録の実行方法について説明する。また、質問の種類とその複雑さの増加レベルの例も示します (図 1参照)。このプロトコルで詳述されているマルチファイバー記録用の光メトリーセットアップは、https://sites.google.com/view/multifp/hardwareで見つかった材料のリストを使用して構築できます(図2)。
GCaMP6またはその変異体からのカルシウム依存性およびカルシウム依存性蛍光放出に対して、410 nmおよび470 nmの励起波長の両方にシステムを装備することが不可欠です。カスタムビルドのセットアップや、システムを実行するための利用可能なソフトウェアがない場合は、無料のオープンソースプログラムBonsai(http://www.open-ephys.org/bonsai/)を使用することができます。あるいは、ファイバーフォトメトリーは、MATLAB(例えば、https://github.com/deisseroth-lab/multifiber)12または他のプログラミング言語14を介して実行することができる。システムのソフトウェアとハードウェアは、410 nmと470 nmのLEDとカメラの両方の操作、画像の抽出(図2)、および繊維の周りに描かれた対象領域(ROI)の平均蛍光強度の計算を可能にする必要があります。画像。出力は、パッチ コード内の各ファイバから 470 nm および 410 nm LED で記録された平均強度値のテーブルである必要があります。マルチファイバー実験を行う場合、400μmの束化繊維はマウスの動きを制限してもよい。このような場合は、柔軟性を高める 200 μm パッチ コードを使用することをお勧めします。また、マウスの訓練中に小さなダミーケーブルを使用することも可能です。
ファイバーフォトメトリーの獲得時に、対象となる事象のタイムポイントを抽出できることが重要です。システムが特定のイベントに TTLL を統合するための組み込みシステムを容易に提供しない場合、別の方法として、テスト中に特定の時間とイベントに合わせて記録された個々のタイム ポイントにタイム スタンプを割り当てることを別の方法として使用します。タイムスタンプは、コンピュータクロックを使用して行うことができます。

<table><tbody><tr><td>1/4 "-20ステンレス鋼キャップスクリュー、1 "ロング</td><td>Thorlabs</td><td>SH25S100</td><td></td></tr><tr><td>1/4" -20ステンレス鋼キャップスクリュー、1/2 "ロング</td><td>Thorlabs</td><td>SH25S050</td><td></td></tr><tr><td>1/4" -20ステンレス鋼キャップスクリュー、3/8 "ロング</td><td>Thorlabs</td><td>SH25S038</td><td></td></tr><tr><td>1000 & マイクロ;m、0.50 NA、SMA-SMA ファイバー パッチ ケーブル</td><td>Thorlabs</td><td>M59L01</td><td></td></tr><tr><td>12.7 mm 光ポスト</td><td>Thorlabs</td><td>TR30/M</td><td></td></tr><tr><td>12.7 mm 台座ポスト ホルダー</td><td>Thorlabs</td><td>PH20EM</td><td></td></tr><tr><td>15 V、2.4 A 電源ユニット、3.5 mm ジャック コネクタ付き T-Cube</td><td>Thorlabs</td><td>KPS101</td><td></td></tr><tr><td>20x 対物レンズ</td><td>Thorlabs</td><td>RMS20X</td><td>#10 図 2、図 5 #11</td></tr><tr><td>ダイクロイックフィルターマウント付き30mmケージキューブ</td> 図2の<td>Thorlabs</td><td>CM1-DCH / M</td><td>#8-9、図5の#8-10</td></tr><tr><td>405 nm LED</td><td>ドーリックレンズ</td><td>CLED_405</td><td>#2 図2の</td></tr><tr><td>410 nmバンドパス</td><td>フィルターThorlabs</td><td>FB410-10</td><td>#5 図2の</td></tr><tr><td>465 nm。LED</td><td>ドーリックレンズ</td><td>CLED_465</td><td>#1 図 2 の</td></tr><tr><td>470 nm バンドパスフィルター</td><td>Thorlabs</td><td>FB470-10</td><td>#4 図 2 の #6</td></tr><tr><td>560 nm バンドパスフィルター</td><td>Semrock</td><td>FF01-560/14-25</td><td>#5 図 5</td></tr><tr><td>の 560nm LED</td><td>ドーリックレンズ</td><td>CLED_560</td><td>#1 図 3</td></tr> の <tr><td>5 軸キネマティックマウント</td><td>Thorlabs</td><td>K5X1</td><td>#11 図 2 の #12</td></tr><tr><td>図2の</td><td>無彩色ダブレット</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-035-A-ML#</td>7</tr> 図<tr>2の<td>405コリメータ</td><td>用アダプタThorlabs</td><td>AD11F</td><td>#3、図5の#4</td></tr> 調整可能な<tr><td>コリメータ用アダプタ</td><td>Thorlabs</td><td>AD127-F</td><td>#3 図2の3、図5の#4</td></tr><tr><td>アルミブレッドボード</td><td>Thorlabs</td><td>MB1824</td><td></td></tr>クランプ<tr><td>フォーク</td><td>Thorlabs</td><td>CF125</td><td></td></tr><tr><td>キューブコネクタ</td><td>Thorlabs</td><td>CM1-CC</td><td></td></tr><tr><td>デュアル 493/574 ダイクロイック</td><td>Semrock</td><td>FF493/574-Di01-25x36</td><td>#10 図 5</td></tr> の <tr><td>GCaMP6</td><td>Semrock</td><td>FF01-535/22-25</td>#6 の蛍光フィルター <td>図 2</td></tr><tr><td>の黒のハードボード パネル付きエンクロージャ</td><td>Thorlabs</td><td>XE25C9</td><td></td></tr><tr><td>外部 SM1-Threaded エンド キャップ</td><td>Thorlabs 加工用</td><td></td><td></td>SM1CP2M</tr><tr><td>ファストチェンジSM1レンズチューブフィルターホルダー</td> 図2の<td>Thorlabs</td><td>SM1QP</td><td>#4-6、図5の#5-7</td></tr><tr><td>405nm光用固定コリメーター</td> 図2の<td>Thorlabs</td><td>F671SMA-405</td><td>#3、図5の#4</td></tr><tr><td>470nmおよび560nm光用固定コリメーター</td> 図2の<td>Thorlabs</td><td>F240SMA-532</td><td>#3、図5の#4</td></tr><tr><td>グリーンエミッションフィルター</td><td>Semrock</td><td>FF01-520/35-25</td><td>光ビームスプリッター</td></tr><tr><td>高解像度USB 3.0 CMOSカメラ</td><td>Thorlabs</td><td>DCC3260M</td><td>図2の#13、図5の#15</td></tr><tr><td>光ビームスプリッター</td><td>ニューロフォトメトリクス</td><td>SPLIT</td><td>#14 図5の</td></tr><tr><td>ロングパスダイクロイックミラー、425 nm カットオフ</td><td>Thorlabs</td><td>DMLP425R</td><td>図2の#8、図5の#9</td></tr><tr><td>ロングパスダイクロイックミラー、495 nmカットオフ</td><td>セムロック</td><td>図2のFF495-DI03</td><td>#9、図5の#8</td></tr><tr><td>メタボンド歯科用セメント</td><td>C&B</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M8 - M8ケーブル</td><td>ドーリック式レンズ</td><td>Cable_M8-M8</td><td></td></tr><tr><td>光ファイバー カニューレ</td><td>ドーリック式レンズ</td><td></td><td>これらが低自家蛍光を必要とする測光実験に使用されることを指定する必要があります</td></tr><tr><td>光ファイバーパッチコード</td><td>ドーリック式レンズ</td><td></td><td>これらが低自家蛍光を必要とする測光実験に使用されることを指定する必要があります</td></tr><tr><td>赤色発光フィルター</td><td>Semrock</td><td>FF01-600/37-25</td><td>光線スプリッター</td></tr><tr><td>T7 LabJack</td><td>LabJack</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T-cube LED ドライバー</td><td>Thorlabs</td><td>LEDD1B</td><td></td></tr><tr><td>USB 3.0 I/O ケーブル ヒロセ電機 25 ソー</td><td>ラブ</td>ス <td>CAB-DCU-T3</td><td></td> DCC3240用</tr></tbody></table>

自由に動く動物の神経活動を記録するマルチファイバー光メトリー

Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals

自由に動く動物のニューロンのグループの活動を記録することは挑戦的な仕事です。さらに、脳がより小さく、より小さい機能サブグループに解剖されると、ニューロンの突起および/または遺伝的に定義された亜集団から記録することが最も重要になります。ファイバーフォトメトリーは、これらの課題を克服できるアクセス可能で強力なアプローチです。光学法と遺伝的方法論を組み合わせることで、遺伝子コード化されたカルシウム指標を発現させることで、脳の深部構造で神経活動を測定することができ、神経活動を簡単に測定できる光学信号に変換します。現在のプロトコルでは、マルチファイバーフォトメトリーシステムの構成要素、光を送受信する深層脳構造にアクセスする方法、モーションアーティファクトを考慮する方法、蛍光信号を処理および解析する方法について詳しく説明しています。このプロトコルは、単一または複数の埋め込み光ファイバから単一およびデュアルカラーイメージングを実行する際の実験的な考慮事項を詳述します。

行動応答の神経相関は、様々な要因によって異なる場合があります。この例では、生体内繊維光測定で、横ハベヌラ(LHb)で終わる横視床下部(LHA)からの軸索末子の活性を測定した。野生型マウスは、LHAにGCaMP6s(AAV-hSyn-GCaMP6s)をコードするアデノ関連ウイルス(AAV)を注入し、光ファイバをLHbのすぐ上の先端に移植した(図4A)。GCaMP6s発現は、カルシウム信号を記録できるLHbに突出するLHAおよびその軸線子の細胞体に見られる。LHA-LHb経路の活性化は、この経路が回避シグナル16を伝達することを示唆するリアルタイムプリファレンステストにおける受動回避を促進する。次いで、マウスを繊維光メトリーシステムに接続し、6分間オープンアリーナに配置し、60秒ごとに1秒間の回避エアーパフにさらされた。測定された蛍光は、エアパフの投与と並行して有意に増加した(図4B-C)。緑色蛍光タンパク質...

このプロトコルでは、マルチファイバーフォトメトリー記録の実装と実行方法、カルシウムに依存しないアーティファクトの修正方法、およびデュアルカラーフォトメトリイメージングに関する重要な考慮事項について詳しく説明します。

Recording the activity of a group of neurons in a freely-moving animal is a challenging undertaking. Moreover, as the brain is dissected into smaller and ...

繊維フォトメトリーCSOMイメージングは、遺伝子組み換えカスタム指標と光ファイバーを組み合わせて、自由に動く動物の神経活動を監視します。これは、特定のニューロングループがアクションや刺激を指示または応答する際にどのように再生するかを理解するために重要です。この技術は、その接続または遺伝的プロファイルによって定義される特定の脳領域から記録するためのアクセス可能な方法であり、信号をノイズに分離するための制御が組み込まれています。プロセッサのデモンストレーションは、私の研究室の大学院生であるエカテリーナ・マルティアノワです。5軸変換器のすべてのネジを緩めることから始めます。パッチコードを5軸変換器に貼り付けたアダプターにネジします。次に、470ナノメートルの励起光を低電力で点灯し、自動蛍光プラスチックスライドを指すファイバーの先端を配置します。ライブモードでの無料の金属酸化物半導体またはCMOSカメラからの次の記録。目的の焦点に画像が表示されるまで、ゲインを上げるか、ルックアップ テーブルを調整します。5軸変換器を目的に向けて進め、470ナノメートルの光がパッチコードのSMAまたはFCの端にあるファイバーの中心に置かれ、カメラで画像が解決されるまで確実に進みます。最後に、画像が中央に配置され、適切に解決されるまで、X 軸と Y 軸を調整します。パッチ コードのバリオールの端から放出されるライトを、等方性円として表示されるように視覚化します。繊維をより良く視覚化するために、すべての励起ライトをオンにすることで開始します。そして、ピクセルが飽和していない、そして繊維の鮮明な画像が存在することを、カメラのゲインを調整します。その後、予備的な画像を撮ります。繊維の周囲に関心のある領域または ROIS を描画します。録音中の平均強度値の測定のためにそれらを保管してください。複数のファイバー録音の場合、すべてのファイバーからのライブ録音により、独立者をテストします。光源に向かって 1 本のファイバーを向け、指でタップします。チャネルの変動を観察します。次に、色付きテープを繊維の端に適用して、どの光ファイバに対応する ROI をラベル付けします。最後に、スタンド、クランプ、ホルダーを使用してアリーナの上にパッチコードを掛けて記録領域を設定します。最後に、動物が繊維の長さによって動きに制限されないことを確認し、アリーナ全体を自由に移動することができます。まず、パッチコードの繊維の遠位端を目で、ミニファイバー顕微鏡で検査します。繊維の表面に傷が付いている場合は、繊維研磨フィルムを用いて細かいグリットで繊維を再研磨する。その後、70%エタノールとコットンチップアプリケーターでパッチコードの遠位端をきれいにします。70%エタノールと綿の先端アプリケーターを使用して光ファイバーカニューレを洗浄してください。黒いシュリンクチューブで覆われたセラミックスプリスリーブを使用して、パッチコードのバリオール端を埋め込み型の繊維に接続します。接続中は、袖がしっかりと締め付けされていることを確認します。動物が数分間回復することを許可します。次に光信号の記録を開始し、実験を実行します。録音中は、ライブトレースに注意深く目を光らせて、品質の録音を確保します。そして、スリーブが十分にタイトではないことを示す、信号の任意のジャンプを見てください。デュアルカラー記録の場合は、516ナノメートルのLEDをフォトメトリーシステムに追加して、赤色蛍光カルシウムセンサー、適切な二色性ミラーおよびフィルタを励起させます。次に、目的と CMOS カメラの間にイメージ スプリッタを追加して、緑と赤の放出の波長を分離します。最後に、赤と緑の両方の色ですべての繊維の周りにROISを描きます。対応するファイバとチャネルを使用して、各 ROI を明確に識別してください。470ナノメートルと560ナノメートルのLEDで同時励起をトリガし、410ナノメートルのLEDでそれらを交互にします。結果は、測定された蛍光がLHA-LHB経路の活性化を伴うマウスのエアパフの投与と同時に有意に増加したことを示す。しかし、緑色蛍光タンパク質またはGFPを発現するマウスでは、エアーパフの投与中にシグナルの変化は検出されなかった。この技術は、研究者が合理的に異なる脳領域内の細胞の特定のタイプから記録することができます.動物が自由に振る舞っている間。これは、彼らが行動に関連するように、これらの脳領域の機能を解剖する能力をさらに進めます.

multi-fiber-photometry-to-record-neural-activity-freely-moving

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

自由に動物を振る舞うの神経活動パターンの非侵襲計測は、高速ビデオ撮影で神経生理学的記録を組み合わせることによって得られる。...

自由に動物を振る舞うの神経回路のアクティベーションの記録

このビデオでは、繊維測光を使用して自由に動くマウスの神経活動を記録する方法を示します。この方法では、特定の脳領域のニューロンが遺伝的にコードされたカルシウムインジケーターを発現します。この脳領域に刺激を加え、刺激依存的な蛍光の変化を測定して神経活動を特定します。...

繊維測光法による自由自在に動くマウスの神経活動の記録

この方法では、マウスは顕微鏡イメージングや動物の頭をしっかり固定を必要とする単一セルの電気生理学的記録、中に移動し、探索するための具体的な、使い慣れた環境を作成します。...

フラットの床の空輸プラットフォーム：げっ歯類の移動自由アウェイクに顕微鏡または電気生理学と行動を組み合わせるための新しい方法

このプロトコルは、吸光度の電圧依存性色素とフォトダイオードアレイを用いた非トランスジェニック無脊椎動物種における単細胞分解能を用いたニューロン集団活性をイメージングする方法を提示する。このアプローチにより、迅速なワークフローが可能になり、イメージングと解析を1日にわたって追求できます。...

非トランスジェニック無脊椎動物における単一ニューロン分解能を用いたネットワークダイナミクスを記録するためのフォトダイオードベースの光学イメージング

マイクロプリズムレンズは、1光子顕微鏡と2光子顕微鏡の両方に対応したヘッドプレートと光学設計と一体化することで、頭部を固定した状態でのよく制御された実験や、自由に動く動物の自然な行動課題など、さまざまな条件下で垂直カラム内の神経応答を測定する上で大きな利点を発揮します。...

自由に動く動物と頭部固定動物におけるマイクロプリズムを用いた同定された神経集団の長期イメージング

このプロトコルには、トランスデューサーの製造、パラメータレポート作成、外科的処置、および自由移動マウスでの同時集束超音波ニューロモデュレーションおよびファイバー測光記録の運用ワークフロー全体の信号記録が含まれます。...

自由移動マウスにおける集束超音波ニューロモデュレーションとファイバー測光の同時記録

全光学的アプローチを使用して、虚血性脳卒中を誘発すると同時に、覚醒して行動しているマウスの新たな脳卒中コアで蛍光バイオセンサーを使用してニューロンのCa2+...

行動マウスの虚血性脳卒中を誘発および監視するための同時光血栓症とファイバー測光法

このプロトコルは、複数の記憶関連脳領域にまたがるニューロンおよびアストロサイトからのカルシウム信号を同時に記録する方法を包括的に説明し、学習および記憶行動のパラダイムにおける応用を示しています。...

学習および記憶行動中の複数の脳領域にわたるアストロサイト-ニューロン活動を記録するための二色ファイバーフォトメトリー法

このプロトコルは、ウイルスの送達、視球体の着床、光血栓誘導、アストロサイトおよびニューロン活動の同時記録、アストロサイトのオプトジェネティック刺激を含む統合的な手法を提供します。この統合手法は、虚血性脳卒中の急性期から慢性期にわたり、アストロサイトとニューロンの関係を同時に調査することを目的としています。...

振る舞うマウスの神経細胞およびアストロサイト活動の光血栓性脳卒中モデリングおよび in vivo 光学記録のための統合手法

この記事では、我々は手術の手順を説明し、マウスモデルにおける高密度脳造影法（EEG）の買収のためのマウスの頭蓋骨で、極薄ポリイミドベースの微小電極アレイ（PBM...

ポリイミドベースのマイクロ電極を用いて自由に動くマウスの高密度脳波録音

学ぶマルチファイバー光メトリーによる自由に動く動物の神経活動記録法。カルシウム非依存的アーチファクト補正とデュアルカラーイメージングを用いて、特定の神経集団の活動を行動と関連付けて解析する手法です。

自由に動く動物の神経活動を記録するマルチファイバー光メトリー

さらに動画を探す