Name: 大人のマウスにおける人工内耳表面製剤 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-06T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 学ぶ、マウス内耳表面製剤法によるEDTA脱灰と接着剤を用いた免疫組織化学法。コルチ器の可視化と毛細胞再生の研究に応用できます。

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記載された研究プロジェクトは、国立衛生研究所の国立ろう者・その他のコミュニケーション障害研究所の助成金R01 DC009222によって支援されました。この作業は、MUSCのWRビルで、助成金C06 RR014516によってサポートされる改装された空間で行われました。動物は、国立研究資源センターの村外研究施設プログラムから助成金C06 RR015455によって支援されたMUSC CRI動物施設に収容されました。著者たちは、ヨッヘン・シャハト博士の貴重なコメントとアンドラ・タラカ博士の原稿の校正に感謝する。

10~12週の男性成人CBA/Jマウスと6~8週のC57BL/6Jマウスに関するすべての研究プロトコルは、サウスカロライナ医科大学(MUSC)の制度動物ケア利用委員会(IACUC)によって承認されました。動物のケアは、MUSCの実験動物資源部門の監督下にあった。
注:以下に示す手順については、マウスを腹腔内注射を介してケタミン(100mg/kg)とキシラジン(10mg/kg)で麻酔されます。マウスは、動物がつま先のピンチなどの痛みを伴う刺激に反応しなくなった後に切断されます。
1. 側頭骨の抽出
<ol><li>直ちに外科的ハサミ(長さ17cm)でマウスを切断し、皮膚を前頭に引っ張って頭蓋骨を露出させた後、頭蓋骨の中心線に沿って前方の後方の側面からはさみで頭蓋骨の骨を切断する。</li>
	<li>鉗子を使用して脳組織を取り出し、生後3ヶ月以上のマウスの親指と人差し指で側頭骨を手動で取り除きます。生後3カ月未満のマウスの側頭骨を切断するには、小さな外科的はさみ(長さ11cm)を使用する。</li>
	<li>側頭骨を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解した氷冷フレッシュ4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液を含むペトリ皿(直径30mm)に入れ、pH7.4に溶解した。 注:PFA溶液の不適切なpHバランスは免疫標識の品質を低下させるので、新鮮な4%PFA溶液を準備し、側頭骨を固定する直前にpHを7.4に調整します。</li>
</ol>2. 固定と灌流
<ol><li>楕円形の窓からテープを取り出し、円形の窓の膜を鉗子#5大きさで穿刺します。ステレオ解剖顕微鏡の下で、1 mLの注射器に接続された27 G針を使用して、コクレアの頂点に小さな穴を開けます。</li>
	<li>溶液が頂点の小さな穴から洗い流されるまで、円形と楕円形の窓を介して4%PFA溶液でゆっくりとコクレアを熟読します。4%PFA溶液の10 mLを含む20 mLボリュームシンチレーションバイアルにコクリア(バイアルあたり1つまたは2つのコクレオ)を転送します。</li>
	<li>室温(RT)でシンチレーションバイアルを2時間静かに攪拌し、ローテーターの冷蔵庫(4°C)に一晩放置します。 注:固定の時間は、使用する抗体に応じて調整することができる。例えば、固定を1.5時間に制限すると、GluA2抗体を使用する際にシナプス後末端の免疫標識が成功する可能性があります。</li>
</ol>3. 側頭骨の脱石
<ol><li>PFA溶液を取り出し、新鮮なPBS 3xでコクレアをそれぞれ5分間洗浄します。</li>
	<li>シンチレーションバイアルに4%エチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム塩(edTA)溶液(pH 7.4)の20 mLを加え、穏やかな攪拌でローテーターに48〜72時間冷蔵庫に保管します。COCHLEがデカル化されるまで、EDTA溶液を毎日変更します。コクレアが弾性を評価するために鉗子で骨前庭部分に触れてデカル化されているか、または単に前庭部の端から小さな部分を切断してデカル化するかどうかを確認します。このような切断が破砕片をもたらす場合、コクレアはデカル化されない。 注:EDTA溶液は、溶液濃度に応じて一次抗体の免疫反応を妨げる可能性がある。PBSで4%EDTAを準備し、pHを7.4に調整します。側頭骨の一貫したデカール化のために、新鮮なEDTA溶液が使用される。</li>
	<li>デカル化が完了したら、マイクロディケイドの溶液をPBSに変更します。 注:コクレアが十分に脱分けされていない場合、コクレアの解剖は行うことができない。</li>
</ol>4. 人工内耳上皮の微小分泌
注:脱石が完了したら、免疫標識のための人工内皮の微小解剖をできるだけ早く行う必要があります。PBSを含むきれいな30ミリメートルのペトリ皿では、内耳は次のように配向されます:ペトリ皿の上部(蓋)と底部を参照して、人工内耳の円形と楕円形の窓は上部に面しています。離分セクターを基準にして、人工内耳部は前方(離分離れから離れる)と前庭部分を背面(離方に近い)に向けている。次に、手順について詳しく説明します。
<ol><li>側頭骨の前庭部分を鉗子で保持し、赤線で示すように45°の角度でメスでアピカルターンを切断する(図1a)。</li>
	<li>赤い線 (図 1b)で示されているように、丸いウィンドウと楕円形のウィンドウの間のかすかな線に沿って垂直に切り取り、前庭部分から内耳を分離します (図1c)。 注:この人工内耳部は、上皮の中央、基底、およびフック部分を含む。</li>
	<li>底面旋回で人工内耳部分を下に向け、中央のターンをペトリ皿の上に向けて置き、赤い線で示すように、真ん中の骨のカプセルと側面の壁を、アピカルセクションが取り除かれた端に向かってカットします(Figu)re 1d,e)</li>
	<li>中央の部分を基底領域とフック領域から完全に分離するために切断を続けます (図 1f,g)。 注:人工内耳のフック領域は、マウスで48kHz以上のトーンに対する感度に対応する人工内皮の末端である。</li>
	<li>皿の底部に向かうバジロール膜部位を有する基底部とフック部を入れ、フック領域からモディオールを垂直に切り取り、縦の赤線で示すようにモディオールを除去する(図1g)。 注:モディオールは、海綿状の骨と人工神経と螺旋状の神経節からなる円錐形の円錐形の中心軸である。このカットははさみで行うことが好ましい場合がある。</li>
	<li>他の赤い線が図 1gに示すように基底領域とフック領域を切り取り、フック部分を分離します (図 1h)。 注:コクレアは、アピカル、ミドル、ベースル、フック部分に分離されました。次のステップは、中間ターンを例にして、個々のターンの最終的な解剖になります。</li>
	<li>赤線で示すように、真ん中のターンの骨カプセルと横壁組織の比較的大きな部分を切り取る(図1i)。 注:人工内耳管の横壁は、螺旋靭帯とストリア血管によって形成される。</li>
	<li>骨のカプセルと側面の壁をペトリ皿の底部に合わせ、これらの組織をバシャール膜側から切断するために鉗子で側面の壁を保持します。次に、試料を平らにして、感覚性毛細胞表面側を上に向けます。骨カプセルと側面壁の残りの部分を取り除きます(図1j)。</li>
	<li>鉗子を使用してテクトリアル膜を取り除き、中央領域を完全に分離します(図1k)。</li>
	<li>図 1lに示すように、残りのターンまたはリージョンの最終的な解剖について、手順 4.7~4.9 を繰り返します。</li>
	<li>感覚上皮の接着のために10mmの丸いカバースリップを準備します。ピペットを使用して、ラウンドカバースリップの中央に0.5°Lのセルとティッシュ接着剤を手で広げます。乾燥後(RTで3〜5分)、ペトリ料理にPBSにカバーリップを入れます。</li>
	<li>ペトリ皿の10mmラウンドカバースリップに感覚上皮の4枚すべてを貼り付けます。次に、カバースリップの一方の端を保持して、免疫標識または免疫ヒストケミストリー用の4ウェル皿に転写します(図1m)。 メモ:図2は、主要なカットの位置を示しています。</li>
</ol>5. 人工内耳シナプスの免疫標識
注:この研究に続く人工内耳シナプスの免疫標識のためのプロトコルは、以前に13について説明されている。シナプス前リボンをCtBP2抗体で標識した(マウス抗カルボキシル末端結合タンパク質2IgG1、RIBEYE足場タンパク質のBドメインを標識)。シナプス末端後は、GluA2抗体(マウス抗グルタミン酸受容体2IgG2a、AMPA受容体の標識サブユニット)で標識した。
<ol><li>4ウェル皿で各洗浄でPBS 3xで感覚上皮を5分間洗浄し、2%の非イオン性界面活性剤(Triton-X 100)の2mLをローテーターでRTで30分間皿に加えます。</li>
	<li>ピペットを使用して皿から非イオン性界面活性剤溶液を取り除き、RTで穏やかな攪拌を伴うローテーター上の1時間、10%の通常ヤギ血清を含むブロッキング溶液をそれぞれ100°L添加します。</li>
	<li>各ウェルからブロッキング溶液を取り出し、PBS 3xで5分間、RTで穏やかな攪拌下で洗浄します。</li>
	<li>PBSで希釈した一次抗体をそれぞれに100μL添加する:マウス抗GluA2 IgG2a(1:2,000)、マウス抗CtBP2 IgG1(1:400)。蓋で各4ウェル皿を覆い、光から保護する大きな加湿容器に入れます。24時間37°Cでインキュベートする。 注:オプションとして、ウサギ抗ミオシンVIIa(1:400)を免疫標識用の感覚毛細胞を添加することができる。</li>
	<li>RTで穏やかな攪拌で各洗浄を5分間PBSで3x洗浄します。</li>
	<li>二次抗体Alexa 594ヤギ抗マウスIgG1a(1:1,000)、Alexa 488ヤギ抗マウスIgG2a(1:1,000)を各ウェルにPBSで希釈して100μLを加えます。蓋で各4ウェル皿を覆い、光から保護する大きな加湿容器に入れます。37°Cで2時間インキュベートする。 注:ミオシンVIIaを使用する場合は、Alexa 350ヤギ抗ウサギ(1:200)を追加します。</li>
	<li>PBSで3xを5分間洗います。次に、10 mm の丸いカバースリップを上部にサンプルを置いたスライドに転送します。</li>
	<li>カバースリップの中央にトリスバッファー付きのフルオロゲルを8°L慎重に加えます。次に、別の10mmラウンドカバースリップの端を、鉗子で上に取り付け、2つのカバースリップを挟みます。</li>
	<li>マニキュアを使用してスライドを密封し、段ボールのスライドフォルダに入れ、冷蔵庫に保管します。 注:取り付け中にカバーリップの間に一部のFluoo-Gelが漏れた場合は、スライドをマニキュアでシールする前にカバーリップの端を清掃してください。共焦点画像は7日以内に撮影する必要があります。</li>
</ol>

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</ol>

著者たちは何も開示する必要はない。

免疫標識と組み合わせた全実装表面製剤の人工内耳分除は、内耳病理および分子機構の調査のための基本的なツールを提供する。この改変された大人のマウス人工内耳解剖法は、細胞および組織接着剤を使用して、この困難な手順を簡素化する。
この修飾人工内耳表面調製方法は比較的容易でアクセスしやすいが、それでも熟練度を達成するためには練習が必要である。正しいカットを行うには、セクター間のセクター間に注意深い集中が必要です。基底ターンの人工内感毛細胞は螺旋状の四肢に非常に近いため、表面の準備が完全に平らにできるように四肢組織を完全に除去することは困難ですが、共焦点Z突起はこの問題を補うことができます。さらに、内炎のフック領域は、解剖するのが最も困難な部分である。フック領域の OHC と IHC の分離が発生する可能性があります。フック領域は、ヒトにおける大きな解剖学的変動を示し、骨伝導聴覚22、23にとって重要である。ミュラー1とVibergとCanlon<sup class="xref...

コクレアは音の検出に専念し、聴覚を担当します。人工内耳管は骨部迷路の螺旋状に巻き取られ、聴器感覚末器官であるコルティ(OC)の器官を保持する。OCは、成虫CBA/CaJマウス1、2で巻き取られた場合、約5.7ミリメートルの長さで、人工内皮を構成する、バシラー膜上に置かれる。OCは、ベースで検出された高周波と頂点の低周波数で音位的に組織化されているため、人工内皮は、多くの場合、低に対応するアピカル、ミドル、ベースターンの3つの部分に分かれています。それぞれ、高周波検出。支持細胞の配列に加えて、OCは内側毛細胞(IHC)の1行の内側の毛細胞(IHC)が内側に位置し、人工内耳スパイラルに対して横に位置する3列の外側の毛髪細胞(OHC)で構成されています。
正しい聴覚処理は、内髪の感覚的な毛細胞の完全性に依存する。感覚性毛細胞の損傷または喪失は、過度の騒音への暴露、耳毒性薬の使用、細菌またはウイルス性耳感染症、頭部外傷、老化などの多数の病因によって引き起こされる、後天性難聴の一般的な病理学的特徴であるプロセス3.さらに、内毛細胞/聴神経シナプスの完全性および機能は軽度の侮辱によって損なわれ得る4.分子・遺伝情報の入手とノックアウト技術やノックイン技術による遺伝子の操作により、マウスは聴覚科学に広く用いられている。成体マウス人工内耳はマイナスで、人工内皮は骨カプセルに囲まれており、技術的に困難な微小切片が生じるが、上皮の表面製剤は免疫標識または免疫ヒスト化学と組み合わさってまた、リボンシナプスや毛髪細胞の喪失、感覚性毛細胞や支持細胞のタンパク質レベルの変化、毛細胞の再生など、人工内耳病理の調査に共焦点画像が広く用いられている。人工内耳表面製剤は、レポーター遺伝子(すなわち、GFP)の発現パターンを決定し、正常な伝達を確認し、形質導入された細胞型を同定するためにも使用されている。これらの技術は、これまで成人CBA/Jマウス5、6、7、8、9を用いた騒音誘発難聴の基礎となる分子機構の研究に用いられてきた。
パラフィン切片または凍結切片を用いた免疫ヒストケミストリーとは異なり、各セクションに3つの外側毛細胞(OHC)と1つの内毛細胞(IHC)を含む人工内耳の小さな断面部分を得るために、人工内皮製剤を使用すると、感覚性毛髪細胞およびリボンシナプスをカウントするためのOCの全長の可視化と、特定の機能周波数に対応する感覚性毛髪細胞の免疫標識。表1は、ミュラー1及びヴィベルグ及びキャロン1、2からの研究による成人CBA/Jマウスにおける人工内耳スパイラルの長さに沿った距離の関数としての聴覚周波数のマッピングを示す。人工内耳面製剤は、人工内耳病理4、5、6、7、8、9、10の調査に広く用いられている ,11,12,13,14,15.全体のマウント人工内耳解剖法は、もともと1966年16月にハンス・エングストロームによって編集された本に記載されていました。この技術は、その後、聴覚科学10、11、12、13の多くの科学者によって文献に記載されているように様々な種に精製され、適応された。 15,17とマサチューセッツ目と耳18のイートンピーボディ研究所によって .最近、別の人工内耳解離方法がMontgomeryら19によって報告された。人工内耳の微小解剖は、人工内耳表面製剤にとって不可欠かつ重要なステップである。しかし、マウスのコクレオを解剖することは技術的な課題であり、かなりの練習が必要です。ここで、成体マウス人工内耳に用いるための修飾人工内耳表面調製方法が提示される。この方法は、免疫標識のために人工内皮の断片を10mmラウンドカバースリップに付着させるために、細胞および組織接着剤(すなわち、Cell-Tak)の脱皮および使用を必要とする。細胞および組織接着剤は、免疫組織化学20に広く使用されている。この修飾人工内耳マイクロ分除法は、以前に報告された18、19と比較して比較的簡単である。

<table><tbody><tr><td>科学および産業向けの</td><td>10mmランドカバースリップ</td>顕微鏡製品 <td>260367</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウスIgG2</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-21131</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ファロイジン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 ヤギ抗マウスIgG1</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-21125</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 ヤギ抗ウサギIgG (H+L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>Carboard Micro Slide Trays</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-587-10</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>BD Biosciences</td><td>354240</td><td></td></tr><tr><td>Corning Petri Dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62247</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 鉗子</td><td>FSTファインサイエンスツール</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>EDTA二ナトリウム塩</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>E5134</td><td></td></tr>トリ<tr><td>スバッファー付きフルオロゲル</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>17985-104</td><td></td></tr><tr><td>ウェル細胞培養皿</td><td>グライナーバイオワン</td><td>627170</td><td></td></tr>ヤ<tr><td>ギ抗ミオシンVIIa抗体</td><td>プロテウスバイオサイエンス25-6790</td><td></td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>マウス 抗 CtBP2 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>#612044</td><td></td></tr><tr><td>マウス 抗 Glu2R 抗体</td><td>ミリポア</td><td>MAB397</td><td></td></tr><tr><td>正常ヤギ血清</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>31872</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>メス</td><td>VWR100491-038</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>バンナススプリングシザー</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15001-08</td><td></td></tr></tbody></table>

大人のマウスにおける人工内耳表面製剤

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

内科における聴覚処理は、メカノ感覚毛髪細胞の完全性に依存する。生涯にわたり、過度の騒音への暴露、耳毒性薬の使用、細菌またはウイルス性耳感染症、頭部外傷、老化プロセスなどの多くの病因から難聴を獲得することができます。感覚性毛細胞の喪失は、後天性難聴の品種の一般的な病理学的特徴である。さらに、内側の毛髪細胞シナプスは軽度の侮辱によって損傷を受けることがある。したがって、人工内耳上皮の表面製剤は、免疫標識技術および共焦点画像と組み合わせて、リボンシナプスおよび感覚毛髪細胞の損失を含む人工内耳病理の調査に非常に有用なツールであり、毛髪細胞および支持細胞におけるタンパク質レベルの変化、毛髪細胞再生、および報告遺伝子発現の決定(すなわち、GFP)は、正常な形質導入および形質転換細胞型の同定を検証する。内耳の骨状螺旋状構造である人工内耳は、聴覚感覚末臓器、コルティ(OC)の器官を保持する。OCの感覚的な毛細胞および周囲の支持細胞は、人工内耳管に含まれ、バジラー膜上に休息し、頂点のベースおよび低周波で発生する高周波検出とトノトピック的な方法で組織化される。分子・遺伝情報の入手可能性とノックアウトやノックイン技術による遺伝子操作能力により、マウスは聴覚科学を含む生物学的研究に広く用いられている。しかし、成体マウスの人工内耳は小さな、人工内皮は骨の迷路に封入され、微小分節が困難になる。解剖技術は多くの実験室で開発され、使用されているが、この修飾されたマイクロ解剖法は、細胞および組織接着剤を使用して、より簡単かつ便利である。これは、脱石後のすべてのタイプの成虫マウスのコクレオに使用することができる。

人工内皮の表面製剤は、免疫標識および共焦点イメージングと組み合わせて、リボンシナプス、感覚毛細胞の定量などの人工内病理の調査のために聴覚科学で広く使用されており、感覚性毛細胞におけるタンパク質発現5、6、7、8.表面製剤のための成虫マウスのコクレオの解剖は簡単ではありませんが、新卒生は10〜15耳で練習した後、この修正された方法を学ぶことができます(図1と図2)。この技術では、CtBP2(シナプス前リボンのマーカー)およびGluA2(シナプス後末端のマーカー)の免疫標識と組み合わせて、Z突起下の共焦点画像を用いたIHC/聴覚神経シナプスを0.25μm間隔でカウントします。マウスリボンシナプスのサイズは、21が可能です。...

本稿では、大人のマウス人工内耳における免疫組織化学のための人工内皮の10mmラウンドカバースリップに人工内皮の断片を付着させるために、細胞および組織接着剤の脱塩および使用を必要とする修飾人工内皮調製方法を提示する。

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

人工内臓表面製剤は、免疫組織化学および共焦点イメージングを用いてコルティの器官の全レンズを可視化することを可能にする。それは関心のある特定の人工内科の病理学の調査のために広く使用されている。人工内流微細解剖法を変更します。この技術の主な利点は、複数の洗浄工程の間に組織の損失を回避しながら、免疫標識手順のための10ミリメートルのラウンドカバーリップに人工内皮上皮の一片の付着です。また、人工内毛病変に加えて、人工内毛表面製剤は、評価発現および毛髪細胞再生のために利用することもできる。この手法には基本的な顕微鏡のスキルが必要であり、この方法の視覚的なデモンストレーションは、各ステップが正しく実行されることを確実にするのに役立ちます。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の大学院生であるチャオジュン・ファンです。側頭骨抽出の場合、直ちに死後、皮膚を前方に引っ張って頭蓋骨を露出させ、はさみを使用して頭蓋骨の中心線に沿って後部の側面から骨を切断する。鉗子を使用して脳組織を取り除き、親指と人差し指を使用して3ヶ月以上のマウスから側頭骨を手動で取り除きます。骨を直径30ミリのペトリ皿に入れ、新鮮な氷冷4%PFAとPBSを含む分割顕微鏡で、楕円形の窓からテープを取り除きます。5番鉗子で丸い窓膜を穿刺し、新鮮な4%PFAを含む1ミリリットルの注射器に取り付けられた27ゲージ針を使用して、小さな穴を小さな穴を作ります。円と楕円形の窓を介して固定液を使用して、角の角の小さな穴から溶液が開くまで、静かにゆっくりとコクレアを浸透させます。その後、バイアルあたり4%PFAの10ミリリットルを含む個々の20ミリリットルのシンチレーションバイアルに最大2つの浸透した内欠性バイアルに移し、室温で2時間サンプルを穏やかに攪拌し、続いてローテーターで摂氏4度で一晩貯蔵します。翌朝、1回の新鮮なPBSで5分間の洗浄を3回でこする。最後の洗浄後、各バイアルに4%EDTAの20ミリリットルを加え、穏やかな攪拌で摂氏4度で48時間サンプルを回転させます。インキュベーションの終わりに、各コクリーの骨前庭部分を鉗子で触れてサンプルの弾力性を評価します。骨がしっかりしているのではなく弾性である場合、内痛は脱灰されています。各サンプルの EDTA を新しい PBS に置き換えます。人工内耳上皮の微細解剖の場合は、側頭骨の前庭部分を鉗子でつかみ、メスを使って頭頂部の旋回を45度の角度で切ります。丸い窓と楕円形の窓の間のかすかな線に沿って垂直に切り取り、内臓を前庭部分から分離し、底面の旋回で人工内膜部分をペトリ皿の上方に向けます。この位置から、尖語部が取り除かれた端に向かって中旋回の骨膜と側面壁を切断し、中間部分を基底領域とフック領域から完全に分離するために切断を続ける。皿の底部に向いたバジラー膜部位と基底部とフック部を配置し、フック領域の内側を垂直に切断して内側を取り除き、基底部とフック領域を切断してフック部を分離する。組織の歪みを避けるために、基底旋とフック領域の分離前に、フック領域の内側を切り取ります。中回転の骨膜と側壁組織の比較的大きな部分を切り取り、側壁を鉗子で保持して、骨状のカプセルと側面壁をペトリ皿の底に合わせ、これらの組織をバジラー膜側から切断する。次に、試料を平らにして、感覚性のヘアセル表面を上に向け、骨状のカプセルと側面壁の残りの部分をトリミングします。次に、鉗子を使用してテクトリアル膜を除去し、真ん中の領域を完全に分離し、骨膜、側面壁組織、および残りのターンのテクトリアル領域を取り除きます。すべての人工内壁の回転が解剖されたら、1ラウンド10ミリメートルのカバースリップの中央に0.5マイクロリットルの細胞と組織接着剤を広げ、接着剤を室温で3〜5分間乾燥させます。乾燥したカバーリップをペトリ皿に入れ、各感覚上皮サンプルの4つすべてを1つのカバースリップに貼り付けます。次に、鉗子を使用して各カバースリップの1つの端をつかんで、検査体を免疫標識用の4ウェル細胞培養皿の個々の井戸に移します。表面人工内膜シナプス製剤の免疫標識の場合、各感覚上皮を1回の新鮮なPBSで5分間3回洗浄し、続いて各サンプルを2ミリリットルの非イオン性界面活性剤を2%の非イオン性界面活性剤で処理し、ローテーター上の室温で30分間処理します。インキュベーションの終わりに、各ウェルから界面活性剤溶液を吸引し、室温で穏やかな攪拌を伴う回転子上で1時間、1ウェルあたり100マイクロリットルのブロッキング溶液で任意の非特異的結合を遮断する。ブロッキングインキュベーションの最後に、穏やかな攪拌の下で示されるようにPBSでサンプルを3回洗浄してから、各上皮に100マイクロリットルの目的の一次抗体を24時間、光から保護して24時間標識します。翌日、新鮮なPBSと1回の穏やかな攪拌でサンプルを3回洗浄し、適切な二次抗体の100マイクロリットルを光から保護した摂氏37度で2時間ラベル付けします。インキュベーションの最後に、各カバースリップを個々のガラス顕微鏡スライドに置く前に、洗浄ごとに新鮮なPBSで3回の5分間の洗浄でサンプルを洗います。次に、適切な取り付け媒体の8マイクロリットルを各カバースリップの中央に慎重に追加し、鉗子を使用して各サンプルに別の10ミリメートルのカバースリップを取り付けます。次に、各カバースリップサンドイッチの側面を透明なマニキュアで密封し、サンプルを段ボールスライドフォルダに入れ、スライドを摂氏4度で保存します。表面製剤のための成体マウスのコクレアの解剖は簡単ではありませんが、この技術に新しい研究者は、10〜15の耳で練習した後に方法を学ぶことができます。CTBP2およびGluA2を有する未治療の10〜12週齢のCBAJマウスの表面製剤の免疫標識は、シナプス前リボンおよび心内末端の両方がそれぞれ内側の毛細胞核の下に位置し、機能的シナプスを示す並置されていることを示している。ミオシン7Aの免疫標識とファロイジンおよびDAPIによる対抗は、外毛細胞および内毛細胞およびそれらの核を含む感覚性毛細胞の存在を明らかにする。ミオシン7Aの免疫標識およびファロイジンによる対抗染色は、細胞および組織接着剤の使用の有無にかかわらず、免疫反応性または均一性に差を示さない。さらに、未処理の6~8週齢のC57黒6マウスの表面製剤の走査型電子顕微鏡は、外毛細胞のV字型立体体をサンプルの3列に整理した。溶液が頂点の小さな穴から開くまで、円形と楕円形の窓を通して静かにゆっくりと固定液で人工内緒を埋めることを忘れないでください。フック領域を基底方向から分離する前に、内側の内側領域を切り離して、内側の除去を容易にするように注意してください。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

動物モデルの蝸牛に耳毒性物質を導入するための様々な方法が存在します。提示されているのは、丸い窓のニッチに耳毒性物質を送達するための外科的プロトコルです。この手順は信頼性が高く、標的を絞った蝸牛内病変を作成し、マイクロアーキテクチャへの機械的損傷を回避します。蝸牛の自己修復・再生の検討が可能です。...

蝸牛細胞の変性を誘導するための迅速かつ信頼性の高いテクニック：耳毒性剤送達のためのマウスラウンドウィンドウアプローチ

一次繊毛は、さまざまなシグナル伝達経路に影響を与えます。哺乳類の蝸牛は、平面細胞極性(PCP)シグナル伝達を調べるのに理想的です。繊毛の機能障害は、蝸牛の成長、細胞パターン化、有毛細胞の配向、PCPの読み取りに影響を与えます。私たちの目標は、表現型解析、免疫組織化学、走査型電子顕微鏡法を通じて、マウス蝸牛のPCPシグナル伝達を分析することです。...

繊毛病マウス変異蝸牛における平面セル・-極性表現型の評価

私たちは3無傷の蝸牛ターン（頂点、ミドル、ベース）としてコルチ大人の臓器を分離する手法を提案します。また、蛍光タグ付き抗体で免疫染色するための手順を示しています。一緒に、これらの技術は、蝸牛に見出さ有毛細胞、支持細胞、および他の細胞型の研究を可能にします。...

成体マウス蝸牛のホールマウント解剖および免疫蛍光

&gt;jove_content&lt;ここでは、内耳への局所的な薬物送達のための2つのマイクロサージェリーアプローチについて説明し、聴覚パラメータ、蝸牛細胞構造、および炎症マーカーの発現への影響の観点から比較します。...

マウス内耳に標的薬の配布方法の比較研究：Bullostomy対 Transtympanicインジェクション

このプロトコールの目的は、新生仔ネズミの蝸牛外植片の調製、培養、処置および免疫染色を実証することである。この技術は、聴覚研究におけるインビトロスクリーニングツールとして利用することができる。...

新生児マウス蝸牛移植法<em&gt;インビトロ</em&gt;聴覚研究のスクリーニングツール

人工内耳装用の動物モデルは、電気刺激で永久的な難聴の治療の技術基盤の知識を進めることができます。本研究は、急性耳をつんざくと聴性脳幹反応と機能性の評価と同様に、マウスで電極アレイの人工内耳の手術のプロトコルを示します。...

人工内耳手術と c57bl/6 マウスに電気的誘発脳幹の応答録音

本原稿は、正常マウスにおけるリボンシナプスの形態学的特徴および機能状態を評価するための実験プロトコルについて説明する。本モデルは、騒音誘発および加齢性共生性シナプトパシー制限モデルにも適している。以前のマウス研究の相関結果についても議論する。...

マウスコクレアの特定周波数領域におけるリボンシナプスの形態学的および機能的評価

ここでは、機能性メカノトランスダクションチャネルを有する聴覚毛髪細胞における3kDaテキサス赤ラベルデキストランの取り込みを視覚化する方法を提示する。さらに、3〜10kDaのデキトランスは、コルチの器官の毛髪および支持細胞におけるエンドサイトーシスを研究するために使用することができる。...

生きた機能性マウス人工内毛細胞におけるデキストランの標識と取り込み

ここでは、マウスから初代蝸牛有毛細胞を単離して培養するための詳細なプロトコルを紹介します。最初に、コルチの器官は、顕微鏡下で新生児(3〜5日齢)のマウス蝸牛から解剖されました。その後、細胞を酵素的に消化して単一細胞懸濁液とし、数日間培養した後に免疫蛍光法を用いて同定しました。...

新生仔マウスの初代蝸牛有毛細胞の単離と培養

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マウス内耳組織の凍結切片および免疫染色:胚期から成虫期まで

ここでは、マウスの血管線条から原発周辺細胞の分離、精製、培養および酸化ストレスおよび細胞老化の in vitro...

新生マウスからの血管条線の一次境界細胞の単離および培養

学ぶ、マウス内耳表面製剤法によるEDTA脱灰と接着剤を用いた免疫組織化学法。コルチ器の可視化と毛細胞再生の研究に応用できます。

大人のマウスにおける人工内耳表面製剤

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