Name: 上頭頂皮細胞活性化に関与する経路を解析するエクスビボアッセイとしての糸球体成長 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: 学ぶ、マウス腎臓から分離した糸球体を用いたエクスビボ培養法で、上頭頂皮細胞の活性化メカニズムを解析する方法です。免疫蛍光染色とCD44ノックアウトマウスを活用し、腎臓線維化の治療標的探索に貢献します。

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この研究は、オランダ腎臓財団(助成金14A3D104)とオランダ科学研究機構(NWO VIDI助成金:016.156.363)によって支援されました。

すべての動物実験は、ラドボウド大学ナイメーヘンの動物倫理委員会のガイドラインに従って行われました。
注:未治療の、健康な野生型(WT)マウス(n=4)および cd44-/-(n=4) マウスは12-16週齢で屠殺した。雄マウスと雌マウスの両方を使用した。すべてのマウスはC57Bl/6バックグラウンドにあった。
1. マウス腎解剖
<ol><li>子宮頸部脱臼により健康なWTマウスまたは遺伝的に改変されたマウスを犠牲にする。</li>
	<li>マウスを犠牲にした直後にマウス腎臓全体を解剖する。このためには、腹部はさみを使用して、皮膚を切断し、次に腹筋を切断して、開腹術の中央値を実行します。腸を取り除き、マウスの隣に置きます。</li>
	<li>腎臓を組織に接続してから解放し、外科用鉗子を使用して腎臓を引き抜き、腎動脈、腎静脈および尿管をはさみで切断する。</li>
	<li>外科用鉗子で腎臓を保持することによって腎臓から腎カプセルを取り出し、鉗子の別のペアを使用してカプセルを引き出す。</li>
	<li>腎臓を6ウェル細胞培養プレート(2腎臓/ウェル)に入れ、ハンクスのバランス塩溶液(HBSS)を井戸あたり2mLで調製し、氷の上に置きます。</li>
</ol>2. マウス腎臓からの糸球体の分離
<ol><li>腎臓を100mmのペトリ皿に移し、2つのメスを使って腎臓を1-2 mmの小片にミンチします。HBSSの1-2 mLを使用して、ひきずみ腎臓片を濡らしてください。</li>
	<li>300 μmの金属ふるいの上にひき肉の腎臓片を置き、20 mLシリンジのプランジャーを使用してふるいを通して腎臓を押します。HBSSを間に入れてふるいを繰り返し洗い流し、血清学的ピペットを使用してきれいなペトリ皿にフロースルーを集める。また、メスでそれを削り取ることによってふるいの底側に残っている/スティックのすべてを収集し、収集されたフロースルー(腎臓ホモジネート)にそれを転送します。</li>
	<li>腎臓ホモゲンをHBSSで75μmのふるいを通してリンスする。フロースルーを収集し、その後、53 μmのふるいを通してこのフロースルーをすすいます。HBSSを使用して両方のふるいを洗浄し、小さな構造をすべて取り除きます。 注:このステップでは、流れはすすがれるだけですが、75 μmと53 μmのふるいを通して押すわけではありません。HBSSで洗浄することは、ふるいの上の破片や小さな構造を除去するために必要です。したがって、通常は200~300 mLのHBSSが使用されます。</li>
	<li>20%の胎児子牛血清(FCS)を補ったDulbeccoの修飾されたイーグルの媒体(DMEM)でふるいの上面を洗浄することによって、75 μmおよび53 μmのふるいに残る腎臓構造/材料を収集し、材料を6ウェル超低い取り付けマイクロプレートに移します。 注:ふるいの上面を洗う、傾いた位置(>45°)でふるいを洗い流し、ふるいの端に腎臓材料を集める。収集された材料は、カプセル化された糸球体と同様に濃縮され、少数の管状断片のみを示す。カプセル化された糸球体は非常に粘着性があります。単一の糸球体を収集するには、したがって、ペトリ皿またはウェルプレートの表面に接着する糸球体を防ぐことが重要です。付着を避けるために、20%のFCSで媒体を使用し、このステップには超低い取り付けプレートを使用してください。</li>
</ol>3. 糸球体成長の培養
<ol><li>超低い取り付けマイクロプレートを反転光顕微鏡に持ち込み、カプセル化およびカプセル化解除された糸球体を20 μLピペットで収集します。他の構造物や破片をピペットにすることは避けてください。ピペットチップに単一の糸球体を採取した後、腎臓材料を採取せずに新鮮なDMEM培地を同じピペットチップに20μLの体積に加えます。</li>
	<li>20 μL DMEM培地を用いた単一の糸球体を24ウェルの細胞培養プレートのウェルの中心に移し、37°Cで3時間、5%(v/v)CO2でイン2キュベートし、糸球体をウェルの中心に付着させます。慎重にウェルの下宿人に糸球体の浮きを避けるためにプレートを移動します。</li>
	<li>3時間のインキュベーションの後、糸球体はウェルの中心に付着する。ヒドロコルチゾン、ヒト内皮成長因子、ウシ脳抽出物およびゲンタマイシン硫酸アンホテリシンB(材料表)および追加の5%(v/v)FBSおよび1%(v/v)陰茎/ストレプトミシン(各strepin)を含む成長因子キットを添加した内皮基底培地(EBM)を慎重に加える。</li>
	<li>37°Cで6日間、5%(v/v)CO2で単一の糸球体を2培養する。 注:6日以内に頭頂頭上皮細胞からなる成長が形成される。特定の化合物または薬物が頭頂頭上皮細胞に及ぼす影響をテストすることを目的とする場合、この6日間以内に培地に添加する必要があります。</li>
</ol>4. 頭頂皮細胞増殖の解析
<ol><li>6日後に糸球体の伸びを分析する。デジタル反転光顕微鏡を使用して顕微鏡画像を撮ります。</li>
	<li>画像解析ソフトウェア(ImageJ/FIJIなど)を使用して、球体の成長の表面積と直径、および成長細胞の数または成長する糸球体の数を決定します。<ol>
<li>糸球体の伸びの表面積を決定するには、tifを開きます。イメージJのスケールバーを持つ糸球体の伸びのファイル。スケール バーに直線を描き、 解析 と測定をクリックして距離をピクセル単位で決定します (たとえば、1 mm = 460 ピクセル)。</li>
		<li>分析でクリックしてスケールを決定し、尺度を設定し、既知の距離をピクセル単位で入力(例えば、460)、既知の距離(例えば、1)および長さの単位(例えば、1mm)を入力する。[OK] をクリックします。</li>
		<li>分析をクリックして結果表に表示される結果を決定し、測定結果を設定します。糸球体の伸びの表面積を決定するには、オプション領域をアクティブにし、ラベルを表示します。[OK] をクリックします。</li>
		<li>糸球体の伸びの表面積を決定するには、糸球体の成長の周りにフリーハンドの選択を描きます。 解析 をクリックして測定すると、以前に決定したスケールでの成長の表面積を示す結果表がImageJにポップアップ表示されます(ステップ4.4、例えば、mm2を参照)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 糸球体細胞の成長の特徴
注:成長の細胞組成を評価するために、t = 6日の糸球体の成長に対して細胞特異的マーカーの免疫蛍光染色が行われる。
<ol><li>慎重に媒体を取り出し、リン酸緩衝生理食塩(PBS)を使用して糸球体を2回軽く洗います。</li>
	<li>PBSで4%(w/v)スクロースを補った2%(w/v)パラホルムアルデヒド(PFA)を使用して室温で10分間固定し、PBSを使用して2倍慎重に洗浄します。</li>
	<li>PBS-ovine血清アルブミン(BSA)1%(v/v)で1%室温で希釈した適切な濃度(材料表)を有する一次抗体と共にインキュベートする。</li>
	<li>抗体溶液を取り除き、PBSで3倍丁寧に洗浄します。</li>
	<li>PBS-BSA 1%(v/v)で暗い温度で45分間、2次抗体(材料表)をインキュベートします。</li>
	<li>PBSで3倍を慎重に洗浄し、4′,6-ジミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)を用いた水性取り付け媒体の1-2滴を使用して取り付け、核を視覚化し、丸いカバースリップでウェルを覆います。</li>
	<li>蛍光顕微鏡を使用して顕微鏡画像を撮ります。</li>
</ol>

<ol><li>Fatima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parietal+epithelial+cell+activation+marker+in+early+recurrence+of+FSGS+in+the+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+CJASN%22%5BJournal%5D)">Parietal epithelial cell activation marker in early recurrence of FSGS in the transplant.</a> Clinical journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 7 (11), 1852-1858 (2012).</li>
<li>Dijkman, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferating+cells+in+HIV+and+pamidronate-associated+collapsing+focal+segmental+glomerulosclerosis+are+parietal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Proliferating cells in HIV and pamidronate-associated collapsing focal segmental glomerulosclerosis are parietal epithelial cells.</a> Kidney International. 70 (2), 338-344 (2006).</li>
<li>Kuppe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+histological+patterns+in+glomerular+epithelial+cells+in+secondary+focal+segmental+glomerulosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Common histological patterns in glomerular epithelial cells in secondary focal segmental glomerulosclerosis.</a> Kidney International. 88 (5), 990-998 (2015).</li>
<li>Dijkman, H., Smeets, B., van der Laak, J., Steenbergen, E., Wetzels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+parietal+epithelial+cell+is+crucially+involved+in+human+idiopathic+focal+segmental+glomerulosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The parietal epithelial cell is crucially involved in human idiopathic focal segmental glomerulosclerosis.</a> Kidney International. 68 (4), 1562-1572 (2005).</li>
<li>Smeets, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parietal+epithelial+cells+participate+in+the+formation+of+sclerotic+lesions+in+focal+segmental+glomerulosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Parietal epithelial cells participate in the formation of sclerotic lesions in focal segmental glomerulosclerosis.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 22 (7), 1262-1274 (2011).</li>
<li>Smeets, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+origin+of+glomerular+extracapillary+lesions+from+parietal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Tracing the origin of glomerular extracapillary lesions from parietal epithelial cells.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2604-2615 (2009).</li>
<li>Smeets, B., Moeller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parietal+epithelial+cells+and+podocytes+in+glomerular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Parietal epithelial cells and podocytes in glomerular diseases.</a> Seminars in Nephrology. 32 (4), 357-367 (2012).</li>
<li>Ryu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+leakage+through+glomerular+basement+membrane+ruptures+triggers+the+proliferation+of+parietal+epithelial+cells+and+crescent+formation+in+non-inflammatory+glomerular+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Plasma leakage through glomerular basement membrane ruptures triggers the proliferation of parietal epithelial cells and crescent formation in non-inflammatory glomerular injury.</a> The Journal of Pathology. 228 (4), 482-494 (2012).</li>
<li>Eymael, J., Smeets, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+fate+of+the+regenerating+cells+of+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Origin and fate of the regenerating cells of the kidney.</a> European Journal of Pharmacology. 790, 62-73 (2016).</li>
<li>Smeets, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+progenitor+cells+contribute+to+hyperplastic+lesions+of+podocytopathies+and+crescentic+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Renal progenitor cells contribute to hyperplastic lesions of podocytopathies and crescentic glomerulonephritis.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2593-2603 (2009).</li>
<li>Eymael, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+is+required+for+the+pathogenesis+of+experimental+crescentic+glomerulonephritis+and+collapsing+focal+segmental+glomerulosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">CD44 is required for the pathogenesis of experimental crescentic glomerulonephritis and collapsing focal segmental glomerulosclerosis.</a> Kidney International. 93 (3), 626-642 (2018).</li>
<li>Roeder, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+ERK1%2F2+increases+CD44+in+glomerular+parietal+epithelial+cells+leading+to+matrix+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Activated ERK1/2 increases CD44 in glomerular parietal epithelial cells leading to matrix expansion.</a> Kidney International. 91 (4), 896-913 (2017).</li>
<li>Appel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+podocytes+from+glomerular+parietal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Recruitment of podocytes from glomerular parietal epithelial cells.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (2), 333-343 (2009).</li>
<li>Yaoita, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visceral+epithelial+cells+in+rat+glomerular+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Visceral epithelial cells in rat glomerular cell culture.</a> European Journal of Cell Biology. 67 (2), 136-144 (1995).</li>
<li>Kuppe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigations+of+Glucocorticoid+Action+in+GN%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Investigations of Glucocorticoid Action in GN.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 28 (5), 1408-1420 (2017).</li>
<li>Ohse, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+conditionally+immortalized+mouse+glomerular+parietal+epithelial+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 19 (10), 1879-1890 (2008).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

本稿で説明したプロトコルを用いて、単一のカプセル化糸球体を用いて、頭頂頭上皮細胞の増殖を評価することができる。このex vivoモデルは、頭頂皮細胞活性化に関与する分子経路を詳細に研究することを可能にする。記載された方法は、腎臓解剖およびふるい分けの単純な概念に依存して、糸球体を単離および培養し、異なる実験条件下での頭頂皮細胞の増殖および/または移動を比較する。培養で6日後に分析できる結果は、例えば、成長の表面積または直径、または単一のカプシュ状糸球体の成長細胞の数である。このアッセイのもう一つの応用は、頭頂頭上皮細胞活性化に関与する可能性のある分子経路を誘導または阻害する薬物の効果を研究することである。
免疫蛍光染色は、培養6日後の成長細胞が頭頂上皮細胞マーカー(CD44、クローディン-1、SSeCKS)に陽性に染色された上頭頂皮細胞であることを確認したが、シナプトポジン、内皮細胞マーカーCD311もポドサイト特異的マーカーを発現しなかった。染色の結果に沿って、単一の脱カプセル化糸球体の分離および培養の6日後に成長細胞は観察されず、この6日間の期間内に細胞の成長中の他の糸球体細胞...

糸球体疾患は腎臓障害の重要なグループであり、末期腎疾患(ESRD)の主要な原因を表す。残念ながら、特定の治療オプションは限られており、ESRDへの進行は避けられません。糸球体疾患は、糸球体損傷の存在によって定義され、炎症性および非炎症性疾患でグループ化することができる。最初の侮辱は異なるが、最近の研究では、一般的な細胞機構が糸球体上皮細胞,過形成につながり、最終的には基底原因1、2、3、42に関係なく、すべての糸球体疾患における糸球体性動脈1硬化症につながることが示されている。3,4
具体的には、糸球体硬化性病変が活性化頭頂細胞5,6,6から主に構成されていることを示した。生理学的条件下では、頭頂上皮細胞は、糸球体のボウマンのカプセルに並ぶ平らな静止上皮細胞である。しかし、遺伝子変異(例えば、ポドサイト特異的またはミトコンドリア細胞症)、炎症または過濾過(例えば、腎質量の低下、高血圧、肥満または糖尿病性髄膜)による任意の糸球体損傷は、頭頂上皮細胞の活性化を引き起こす可能性がある。活性化された頭頂皮細胞は細胞外基質を増殖および沈着させ、細胞内三日月または硬化性病変の形成を生じる,5、7、8。87これらのプロセスの進行は腎機能9の損失をもたらす。したがって、頭頂皮細胞活性化は、炎症性および非炎症性糸球,体疾患1、2、3、4、102,の両方における糸球体性硬化症の発症および進行における重要な要因1である。4,103
頭頂上皮細胞の活性化を媒介する分子プロセスは、まだほとんど知られていない。最近の研究では、細胞増殖および移動に関与する異なる経路の活性化に重要な受容体である、ノボ発現CD44を活性化した頭頂頭細胞がCD44を発現することが示されている。さらに、CD44の阻害は、炎症性の動物モデルならびに非炎症性糸球体疾患11,12における三日形成および糸球硬化症の進行を抑制し、12上頭頂皮細胞の活性化を阻害することが示された。
頭頂上皮細胞活性化は糸球体性硬化症および三日月形成の発展のための重要なプレーヤーであるため、これらの細胞の阻害は糸球体疾患の進行を遅らせることができる。頭頂頭細胞活性化を促進する分子経路の解明は、糸球体疾患における過形成および糸球体硬化性病変の形成を減衰させる特定の治療介入の開発につながる可能性がある。
実験動物モデルでは、遺伝子発現の変化(ノックアウトモデルまたはトランスジェニックマウスモデル)や頭頂皮細胞に対する薬物治療の直接的な効果の証拠を提供することはしばしば困難である。従来のノックアウトマウスでは、生体内変化が観察され、頭頂皮細胞の直接的な変化によって説明され得る。しかし、遺伝子発現はマウス内の他の細胞型でも変化するため、他の細胞型によって媒介される間接的な効果を排除することはできません。主に頭頂頭上皮細胞で活性なプロモーターによって駆動される条件付き cre-lox マウスの開発は、場合によっては13の解決策を提供している。それにもかかわらず、条件付きトランスジェニックモデルは複雑であり、より多くの条件線が利用可能になるが、従来のノックアウトまたはトランスジェニックマウスラインの多くにとって、まだ条件付き代替手段はない。
頭頂頭細胞に対する直接的な影響を研究するために、我々のグループは、マウス腎臓から単一のカプセル化糸球体を用いて、頭頂皮細胞の増殖と移動を測定および分析するex vivoアッセイを開発した。この方法により、頭頂頭上皮細胞特異的な効果を決定し、頭頂頭上皮細胞活性化のための責任ある経路を見つけ、この活性化を阻害する治療選択肢をテストすることができます。

<table><tbody><tr><td>24ウェル細胞培養プレート</td><td>Corning Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-CD31</td><td>BD Pharmingen</td><td>内皮細胞マーカー (使用濃度 1:200)</td><td></td></tr><tr><td>ニワトリ抗ラット Alexa 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>&nbsp;(使用濃度 1:200)</td><td></td></tr><tr><td>DAPI-Fluoromount G</td><td>Southern Biotech</td><td>DAPI</td><td></td>を含む封入剤</tr><tr><td>デジタル倒立光学顕微鏡</td><td>Westburg, EVOS FL顕微鏡</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ロバ-抗ヤギ Alexa 568</td><td>Thermo Fisher</td><td>&nbsp;(使用濃度 1:200)</td><td></td></tr><tr><td>ロバ-抗ウサギ アレクサ568</td><td>サーモフィッシャー</td><td>&nbsp;(使用濃度1:200)</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのモディファイドイーグルの媒体&nbsp;</td><td>ロンザ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EBMミディアム</td><td>ロンザ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EBM-MVシングルクォートキット</td><td>ヒドロコルチゾン、hEGF、GA-1000、FBSおよびBBE</td><td></td>を含む<td>ロンザ</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ロンザ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎児子牛血清</td><td>ロンザ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td> ライ<td>カマイクロシステムズGmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヤギ-抗シナプトポジン</td><td>サンタクルス</td><td>ポドサイトマーカー (使用濃度 1:200)</td><td></td></tr><tr><td>ハンクスのバランスの取れた塩溶液</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ ソフトウェア</td><td>フィジー 1.51n</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>Sarstedt</td><td>サイズ 100</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ-抗クローディン1</td><td>アブカム</td><td>頭頂上皮細胞マーカー (使用濃度 1:100)</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ-抗SSeCKS</td><td>ロズウェルパーク総合がんセンター、バッファロー、ニューヨーク、米国</td>、<td>E.ゲルマン博士提供、頭頂上皮細胞マーカー</td><td></td>ラット</tr><tr><td>-抗CD44</td><td>BDファーミンゲン</td><td>壁上皮細胞マーカー(使用濃度1:200)</td><td></td></tr><tr><td>メス</td>ダー<td>ルハウゼン</td><td>サイズ10</td><td></td></tr><tr><td>ふるい&nbsp;</td><td>Endecotts Ltd</td><td>サイズ300&マイクロ;メートル、75&マイクロ;メートル、53&マイクロ;m、スチール</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>BD Plastipak</td><td>サイズ:20 ml</td><td></td></tr><tr><td>超低アタッチメントマイクロプレート&nbsp;</td><td>Corning Costar</td><td>6ウェルプレート</td><td></td></tr></tbody></table>

上頭頂皮細胞活性化に関与する経路を解析するエクスビボアッセイとしての糸球体成長

Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation

上頭頂皮細胞(PEC)活性化は、糸球体性動脈硬化症の発症および進行に関与する重要な因子の1つである。したがって、頭頂皮細胞活性化に関与する経路の阻害は、糸球体疾患の進行を減衰させるツールとなり得る。本稿では、マウス腎臓から分離されたカプセル化糸状糸球体の頭頂皮細胞の増殖を培養および分析する方法について述べている。単離マウス腎臓を解剖した後、組織をミンチ化し、糸球体をふるいにかけて単離する。カプセル化糸球体が採取され、単糸球体を6日間培養し、頭頂頭細胞の糸球体伸長を得る。この期間中、頭頂頭上皮細胞の増殖および移動は、細胞数または成長細胞の表面積を決定することによって分析することができる。したがって、このアッセイは、トランスジェニックマウスまたはノックアウトマウスにおける遺伝子発現の変化の影響、または頭頂皮細胞の成長特性およびシグナル伝達に対する培養条件の影響を研究するためのツールとして使用することができる。この方法を用いて、頭頂頭上皮細胞活性化の過程に関与する重要な経路、そして結果的に糸球体性動脈硬化症において重要な経路が検討できる。

糸球体伸成長アッセイを実行する方法の系統図を 図1に示す。 図2A-Dは 、光顕微鏡を用いて観察された異なる時点でのカプセル化糸球体の成長を示す。成長は、マウス腎臓からの糸球体分離後の培養における2日目、4日目および6日目(図2B-D)に示される。成長細胞が頭頂上皮細胞であることを検証するために、脱カプセル化糸球体は 図2E,Fに示すように6日間も単離および培養されている。脱カプセル化糸球体は6日以内の培養期間中に細胞の伸びを示さなかった。 図3において、免疫蛍光染色は、異なる頭頂上皮細胞マーカー、ポドサイト特異的マーカーならびに内皮細胞マーカーに対して行った。この結果は、成長...

本稿では、マウス腎臓から分離されたカプセル化糸球体上皮細胞の増殖を培養し、分析する方法について述べている。この方法は、頭頂皮細胞の増殖および移動に関与する経路を研究するために使用することができる。

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of ...

頭頂頭細胞の活性化は、腎臓の糸球体における瘢痕組織の発達において重要な要因である。この方法を使用して、この活性化に関与する細胞プロセスを研究し、うまくいけば、病気の進行を遅くしたり止めたりする治療オプションを見つけることができます。私たちの技術の主な利点は、単離された糸球体からまっすぐに成長する一次細胞を使用することです。腎臓を解放した後, テキスト原稿に記載されているように, 外科用鉗子で腎臓を保持し、腎カプセルを引き離すために鉗子の別のペアを使用します.この後、腎臓を6つの井戸培養プレートの井戸に入れ、それぞれに2ミリリットルのHBSSが含まれ、培養プレートを氷の上に置きます。まず、腎臓を100ミリメートルのペトリ皿に移し、2つのメスを使用して、約1〜2ミリメートルの小片にミンチします。ひき肉の腎臓片をHBSSで濡らしてください。次に、腎臓片を300マイクロメートルの金属ふるいの上に置き、20ミリリットルのシリンジからプランジャーを使用してふるいを通して腎臓を押します。HBSSを間に繰り返し洗浄し、血清ピペットを使用してフロースルーを収集し、きれいなペトリ皿に移します。メスを使用してふるいの底に残っているすべてのものを削り取り、収集した腎臓ホモジネートに移します。HBSSで75と53マイクロメートルのふるいを通して腎臓ホモゲン酸をすすい。次に、HBSSで両方のふるいを洗浄し、小さな構造をすべて取り除きます。20%の胎児の子牛の血清を補ったDMEMの各の上面を洗浄することによってふるいに残った腎臓構造および材料を集め、6つの極度低い取り付けマイクロプレートの井戸に材料を移す。超低い取り付けマイクロプレートを反転光顕微鏡に持ち込み、20マイクロリットルのピペットを使用して、単一のカプセル化および脱カプセル化された糸球体を収集します。ピペットチップに単一の糸球体をキャッチした後、20マイクロリットルの体積に同じピペットチップに腎臓材料を収集することなく、新鮮なDMEM培地を追加します。DMEM培地を用いた単一の糸球体を24のウェル細胞培養板のウェルの中心に移し、5%の二酸化炭素で摂氏37度で3時間インキュベートし、糸球体を井戸の中心に付着させます。インキュベーション後、糸球体は井戸の中心に取り付けられます。慎重に成長因子キットと追加の5%FBSと1%ペニシリンとストレプトマイシンを補った内皮基底培地の500マイクロリットルを各ウェルに追加します。5%の二酸化炭素を摂氏37度で6日間培養する。6日間のインキュベーションの後、デジタル反転光顕微鏡を使用して画像を撮影し、糸球体の成長を分析します。画像解析ソフトウェアを使用して、スケール バーを使用してイメージ ファイルの 1 つを開いて、糸球体伸成長の表面積を決定します。スケール バーに直線を描き、[解析] をクリ

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、マウスの腎臓から無傷の糸球体を分離する方法について説明しています。このようにして得られたカプセル化され、カプセル化解除された糸球体は、さらに、マウス腎臓から頭頂上皮細胞増殖を培養するために使用することができる。...

糸球体単離:マウス腎臓から無傷の糸球体を得る技術

涙腺（LG）は、ビジョンと眼の健康を維持するために必要な涙の水性成分を生成し、分岐器官である。ここでは、LG電子の開発に関与するシグナル伝達経路を解読するネズミLG郭清およびex vivo培養技術を説明しています。...

マウス涙腺を操作する

このプロトコルは、血管系を介した洗剤の順行性灌流によるSprague...

上皮細胞の再増殖および腎組織の開発のための齧歯類細胞外マトリックスの足場の調製

このプロトコルでは、糸球体疾患のマウス ・...

糸球体疾患のマウス ・ モデルにおける腎機能の評価

このプロトコルの主な焦点は、効率的にさまざまな下流のアプリケーションで使用するための最小限の汚染物質と実行可能な主な糸球体の文化を分離することです。孤立した糸球体コンポーネント...

ラット腎臓からそのまま糸球体を分離する効率的なふるい分け法

ここでマウスの体内でビオチンと腎糸球体細胞表面タンパク質のラベリングのためのプロトコルを提案する.このプロトコルは、マウス腎臓の灌流、腎糸球体に分離および興味の蛋白質の内因性の免疫沈降を実行する方法について説明します。...

腎糸球体と腎糸球体細胞表面タンパク質の標識体内の分離

ここで提示されるのは、高効率(&gt;90%)を有する誘導多能性幹細胞からのヒト腎臓ポドサイトの誘導のための化学的に定義されたプロトコルであり、遺伝子操作または亜集団選択とは無関係である。このプロトコルは、26日以内に望ましい細胞タイプを生成し、腎毒性試験および疾患モデリングに有用であり得る。...

化学的に定義された条件下でのヒト人工多能性幹細胞からの成熟した腎臓ポドサイトの誘導分化

ここでは、ヒト人工多能性幹細胞から分化した遺伝的に一致する上皮細胞と血管内皮細胞を統合することにより、腎臓糸球体濾過バリアの構造と機能を要約するパーソナライズされた臓器チップシステムを設計するためのプロトコルを紹介します。このバイオエンジニアリングシステムは、腎臓精密医療および関連アプリケーションを進歩させることができます。...

ヒト人工多能性幹細胞から改変された同質遺伝子腎臓糸球体チップ

この原稿では、ヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)へのエピソームリプログラミングとその後のポドサイトへの分化 を介して...

皮膚生検からの患者由来足細胞の生成

ここでは、コラーゲンおよびコラーゲン-アガロースマトリックスを微生理学的システムに使用して3D細胞培養を実施するための手順を詳しく説明したプロトコルを紹介します。これらのプロトコルは、腎近位尿細管と腎細胞がんのスフェロイド共培養をサポートし、 in vivo...

腎臓癌の進行をモデル化するための腎臓健康と腫瘍上皮のマイクロ流体共培養

学ぶ、マウス腎臓から分離した糸球体を用いたエクスビボ培養法で、上頭頂皮細胞の活性化メカニズムを解析する方法です。免疫蛍光染色とCD44ノックアウトマウスを活用し、腎臓線維化の治療標的探索に貢献します。

上頭頂皮細胞活性化に関与する経路を解析するエクスビボアッセイとしての糸球体成長

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