Name: 逆相液体クロマトグラフィー-質量分析法による無細胞タンパク質合成代謝の絶対定量 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: 学ぶ無細胞タンパク質合成における中央炭素・エネルギー代謝の40代謝物質の絶対定量法。アニリン誘導体化と逆相液体クロマトグラフィー-質量分析法を用いて、合成生物学研究のための正確な定量プロトコルを確立する。

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記載された研究は、国立がん研究所(https://www.cancer.gov/)から1U54CA210184-01賞を通じてがん代謝物理学センターによって支援されました。コンテンツは著者のみ責任であり、必ずしも国立がん研究所や国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、原稿の作成に何の役割も持っていませんでした。

1. アニリンタグ付け用試薬の調製
<ol><li>pH 4.5で6Mアニリン溶液を調製します。フードで働き、550 μLのアニリンとLCMS等級水の337.5°L、12M塩酸(HCl)の112.5°Lを遠心管に組み合わせます。ボルテックスウェルと4°で保存します。 注:アニリンは4°Cで2ヶ月間保存することができます。 注意:アニリンは非常に有毒であり、ヒュームフードで作業する必要があります。塩酸は腐食性が高い</li>
	<li>pH 4.5で6M 13Cアニリン溶液を調製します。250 mg の13C6-アニリンと水の132°L、12 M HCl. 渦井戸の44°Lを組み合わせ、4°Cで保存します。</li>
	<li>200 mg/mL N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N-エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC)溶液を調製する。すべてのサンプルに対して10°Lの水に2mgのEDCを溶かし、渦をよく付ける。 注:EDC溶液は、反応と同じ日に調製されるべきである。EDCは、アニリン12を有する化合物の誘導体化のための触媒として作用する。</li>
</ol>2. 基準の整備
<ol><li>LC/MSグレードの水に溶解したすべての化合物の別々のストック溶液を作る(表1)。</li>
	<li>
内部標準的なストックソリューションの準備
	<ol>
<li>ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP)、フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)、アセチル補酵素A(ACA)、グリセロール3-リン酸(Gly3P)を除くすべての化合物を、適切な体積で組み合わせ、すべての化合物の2 mMのストックソリューションを作成します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>NAD、NADP、FAD、ACA、および Gly3P を適切なボリュームと組み合わせて、2 mM のストック ソリューションを作成します。</li>
</ol>3. サンプルの調製 (図 1)
<ol><li>クエンチし、反応に等量の氷冷100%エタノールを加えることによって、無細胞タンパク質合成反応でタンパク質を沈殿させます。サンプルを12,000 x gで遠心分離し、4°Cで15分間。新しい遠心管に上清を移します。 注:サンプルは、この時点で-80 °Cで保存し、後で分析することができます</li>
</ol>4. 標識反応
<ol><li>
12C-アニリン溶液によるラベリングサンプル
	<ol>
<li>6 μL のサンプルを新しい遠心管に移し、体積を水で 50°L にします。 注:体積サンプルサイズは、特定のCFPS反応に依存する場合があります。</li>
		<li>200 mg/mL EDC 溶液の 5 μL を追加します。</li>
		<li>12C-アニリン溶液の5°Lを加えます。 注: アニリン溶液は2つのフェーズに分かれています。反応に加える前によく混ぜます。</li>
		<li>室温で2時間穏やかに振とう反応をボルテックス。</li>
		<li>2時間後、シェーカーからチューブを取り出し、フュームフードで反応にトリエチルアミン(TEA)を1.5μL加えます。 注:トリエチルアミンは、アニリンタグ付け反応を停止し、化合物を安定化する溶液のpHを上げます。 注意: トリエチルアミンは有毒であり、目や気道の刺激を引き起こす.</li>
		<li>13,500 x gで3分間遠心分離機。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
13C-アニリン溶液による内部標準のラベリング
	<ol>
<li>内部原液を50μLの最終容積で80μMに希釈します。 注:内部標準の濃度は、実験サンプルに近いレベルに調整することができます。</li>
		<li>200 mg/mL EDC 溶液の 5 μL を追加します。</li>
		<li>13C-アニリン溶液の5°Lを加えます。</li>
		<li>室温で2時間穏やかに振とう反応をボルテックス。</li>
		<li>2時間後、シェーカーからチューブを取り出し、ヒュームフードの反応にTEAの1.5 μLを加えます。</li>
		<li>13,500 x gで3分間遠心分離機。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
タグ付き内部標準とタグ付きサンプルの組み合わせ
	<ol>
<li>12C-アニリンラベル付きサンプルの25 μLを、25°Lの13C-アニリンラベル標準と混合します。</li>
		<li>オートサンプラーバイアルに転送し、LC/MS手順で分析します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
タグなし代謝産物の標準曲線の作成
	<ol>
<li>タグなし代謝産物(NAD、NADP、FAD、ACA、Gly3P)の希薄な原液を、体積50μLの320μM、80μM、20μM、5μMの最終濃度に希釈します。</li>
		<li>200 mg/mL EDC 溶液の 5 μL を追加します。</li>
		<li>12C-アニリン溶液の5°Lを加えます。</li>
		<li>室温で2時間穏やかに振とう反応をボルテックス。</li>
		<li>2時間後、シェーカーからチューブを取り出し、ヒュームフードの反応にTEAの1.5 μLを加えます。</li>
		<li>13,500 x gで3分間遠心分離機。</li>
		<li>上清をオートサンプラーバイアルに移し、LC/MS手順で分析します。 注: タグなし代謝産物は、同様のイオン化効率を維持するためにサンプルマトリックスを複製するサンプルと同じ手順に従います。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. LC/MS手順の設定
<ol><li>
溶剤の調製
	<ol>
<li>酢酸でpH4.75に調整した5mMトライブチラミン(TBA)水溶液を調製する。 注:モバイルフェーズのTBAは、分解物が良好な解像度と分離14を達成するのに役立ちます。</li>
		<li>アセトニトリル(ACN)で5 mM TBAを準備します。</li>
		<li>5%の水と95%のACNで洗浄溶剤を準備します。</li>
		<li>95%の水と5%のACNでパージ溶媒を準備します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>MS 条件の設定<ol>
<li>質量分析計をプローブ温度520°C、負のキャピラリー電圧-0.8kV、正のキャピラリー電圧0.8kVの負イオンモードに設定し、ソフトウェアを5ポイント/sでデータを取得するように設定します。</li>
		<li>指定した円錐電圧と質量過充電(m/z)値を持つ各代謝産物に対して、選択したイオン記録(SIR)を設定します。表 1を参照してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
製造元の指示に従って LC/MS を初期化する
	<ol>
<li>3分間の溶媒マネージャーにおける主な溶媒ライン。</li>
		<li><li><li><li><li><li><li></ol></li><li><ol><li></li><li> </li><li></ol></li></ol><ol><li><ol><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li></li><li></li><li> </li><li></li><li></li><li><li></li><li></li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60329/60329eq1.jpg"> </li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li></li><li></li><li> </li><li></li><li></li><li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></ol></li></ol>

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<li>Luo, B., Groenke, K., Takors, R., Wandrey, C., Oldiges, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+multiple+intracellular+metabolites+in+glycolysis%2C+pentose+phosphate+pathway%2C+and+tricarboxylic+acid+cycle+by+liquid+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway, and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1147 (2), 153-164 (2007).</li>
</ol>

著者たちは何も開示する必要はない。

無細胞システムは細胞壁を持たないため、複雑なサンプル調製を必要とせずに代謝産物や生合成機械に直接アクセスできます。しかし、細胞のない反応系を定量的に調べるための徹底的で堅牢なプロトコルを開発する作業はほとんど行われていない。本研究では、無細胞反応混合物および全細胞抽出物中の代謝産物を定量する高速で堅牢な方法を開発した。細胞を含まない反応や全細胞抽出物など、複雑な混合物中の代謝産物の個別定量は、いくつかの理由で困難である。これらの理由の中心は、化学的多様性です。これらの混合物中に同時に存在する官能基の配列(例えば、カルボン酸、アミン、リン酸塩、ヒドロキシルなど)は、分析の複雑さを大幅に増加させる。これを回避するために、13C内部規格と組み合わせてアニリン誘導体化法を用いて、代謝産物混合物に疎水性成分を導入した。この方法を用いて、1回のLC/MSランで無細胞反応で40個の代謝産物を堅牢に検出し、定量した。この研究では40化合物のうち35種類のプロトコルにタグを付け、残りの5種の化合物は標準曲線法で定量した。以前の研究は、誘導体化を阻害したアミンとリン酸基との間に分子内塩を...

無細胞タンパク質合成(CFPS)は、タンパク質や化学物質の製造に有望なプラットフォームであり、従来は生きている細胞のために予約されてきました。無細胞系は、粗細胞抽出物に由来し、細胞増殖1に関連する合併症を排除する。さらに、CFPSは細胞壁の干渉なしで代謝産物および生合成機械への直接アクセスを可能にする。しかし、無細胞プロセスの性能限界に関する根本的な理解が欠けている。代謝物定量のための高スループット法は、代謝の特性評価に貴重であり、代謝計算モデル2、3、4の構築に不可欠である。代謝産物濃度を決定するために使用される一般的な方法には、核磁気共鳴(NMR)、フーリエ形質転換赤外分光法(FT-IR)、酵素系アッセイ、質量分析(MS)5、6、7などがあります。 、8.しかし、これらの方法は、多くの場合、一度に複数の化合物を効率的に測定できないことによって制限され、多くの場合、典型的な無細胞反応よりも大きいサンプルサイズを必要とします。例えば、酵素ベースのアッセイは、多くの場合、実行で単一の化合物を定量するためにのみ使用することができ、無細胞タンパク質合成反応(通常は10〜15°Lスケールで実行される)のように、サンプルサイズが小さい場合に制限されます。一方、NMRは、検出および定量のための代謝産物の高い量を必要とします5. これらの欠点に対して、質量分析法(LC/MS)と連像のクロマトグラフィー法は、高感度および複数の種を同時に測定する能力を含むいくつかの利点を提供する9;しかし、測定される種の数と多様性に伴い、分析の複雑さが大幅に増加します。したがって、LC/MSシステムの高スループットポテンシャルを十分に実現する方法を開発することが重要です。試料中の化合物は液体クロマトグラフィーで分離され、質量分析によって同定される。化合物のシグナルは、その濃度およびイオン化効率に依存し、そこでイオン化は化合物間で変化し得るし、また、サンプルマトリックスに依存し得る。
LC/MSを使用して分析物を定量する場合、サンプルと規格の間で同じイオン化効率を達成することは課題です。また、プロトン親和性および極性10におけるシグナル分割および不均一性による代謝産物多様性に伴う定量化がより困難となる。最後に、試料の共溶出マトリックスは、化合物のイオン化効率にも影響を与え得る。これらの問題に対処するために、代謝産物を化学的に誘導体化し、LC/MSシステムによる分離分解分解分解と感度を高め、場合によっては信号分割を10、11に減少させることができる。化学誘導体化は、代謝産物の特定の官能基をタグ付けして、電荷や疎水性などの物理的性質を調整してイオン化効率を11上げることによって機能する。種々のタグ付け剤は、異なる官能基(例えば、アミン、ヒドロキシル、リン酸塩、カルボン酸など)を標的とするために使用することができる。アニリンは、そのような誘導体化剤の1つが、一度に複数の官能基を標的とし、親水性分子に疎水性成分を加え、それによってその分離分解能およびシグナル12を増加させる。共溶出マトリックスイオン抑制効果に対処するために、ヤンと同僚は、標準が13Cアニリン同位体でタグ付けされ、サンプルと混合されるグループ固有の内部標準技術(GSIST)ラベリングに基づく技術を開発しました。12、13.代謝産物および対応する内部標準は、共溶成以来同じイオン化効率を有し、その強度比を使用して実験試料中の濃度を定量することができます。
本研究では、CFPS反応における糖分解、ペントースリン酸経路、トリカルボン酸サイクル、エネルギー代謝および補因子再生に関与する40の化合物を検出し、定量するプロトコルを開発した。この方法はGSISTアプローチに基づいており、12のC-アニリンと13のC-アニリンを使用して、逆相LC/MSを使用して代謝産物をタグ付け、検出、定量しました。すべての化合物の線形範囲は、平均相関係数0.988の2〜3桁に及んだ。したがって、この方法は、無細胞代謝、および場合によっては全細胞抽出物を問い合わせるための堅牢で正確なアプローチです。

<table><tbody><tr><td>12C アニリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242284</td><td>アニリン 12C</td></tr><tr><td>13C 標識アニリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>485797</td><td>アニリン 13C6</td></tr><tr><td>3-ホスホグリセリン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td>3PG</td></tr><tr><td>酢酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>AC222140010</td><td>ACE</td></tr><tr><td>アセトニトリル、LCMS</td><td>JT BAKER</td><td>9829-03</td><td>ACN</td></tr><tr><td>アセチルコエンザイム A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2056</td><td>ACA</td></tr><tr><td>Acquity UPLC BEH C18 1.7 &mu;M、2.1 x 150 mm カラム</td><td>Waters</td><td>186002353</td><td>カラム</td></tr><tr><td>アデノシン二リン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754</td><td>ADP</td></tr><tr><td>アデノシン一リン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1752</td><td>AMP</td></tr><tr><td>アデノシン三リン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td>ATP</td></tr><tr><td>α-ケトグルタル酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1128</td><td>aKG</td></tr><tr><td>クエン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275</td><td>CIT</td></tr><tr><td>シチジン二リン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9755</td><td>CDP</td></tr><tr><td>シチジン一リン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1006</td><td>CMP</td></tr><tr><td>シチジン三リン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9274</td><td>CTP</td></tr><tr><td>D-グリセルアルデヒド 3-リン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39705</td><td>GAP</td></tr><tr><td>エリスロース 4-リン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0377</td><td>E4P</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EX0276</td><td>EtOH</td></tr><tr><td>Fisher Scientific accuSpin Micro 17 遠心分離機</td><td>FisherScientific</td><td></td><td>遠心分離機</td></tr><tr><td>フラビン アデニン ジヌクレオチド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6625</td><td>FAD</td></tr><tr><td>フルクトース 1,6-ビスリン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6803</td><td>F16P</td></tr><tr><td>フルクトース 6-リン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3627</td><td>F6P</td></tr><tr><td>フマル酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8509</td><td></td></tr><tr><td>FUM グルコン酸 6-リン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7877</td><td>6PG</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>GLC</td></tr><tr><td>グルコース 6-リン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7879 G6P</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール 3-リン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7886</td><td>Gly3P</td></tr><tr><td>グアノシン二リン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7127</td><td>GDP</td></tr><tr><td>グアノシン一リン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8377</td><td>GMP</td></tr><tr><td>グアノシン三リン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td>GTP</td></tr><tr><td>塩酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td>HCl</td></tr><tr><td>イソクエン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1252</td><td>ICIT</td></tr><tr><td>乳酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1750</td><td>LAC</td></tr><tr><td>リンゴ酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>02288</td><td>MAL</td></tr><tr><td>myTXTL - Sigma 70 Master Mix Kit</td><td>ArborBiosciences</td><td>507024</td><td>無細胞タンパク質合成</td></tr><tr><td>N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N&prime;-エチルカルボジイミド塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03449</td><td>EDC</td></tr><tr><td>ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43410</td><td>NAD</td></tr><tr><td>ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5755</td><td>NADP</td></tr><tr><td>ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元</td>型 <td>Sigma-Aldrich</td><td>481973</td><td>NADPH</td></tr><tr><td>ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元</td>型 <td>Sigma-Aldrich</td><td>N8129</td><td>NADH</td></tr><tr><td>シュウアセテート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4126</td><td>OAA</td></tr><tr><td>ホスホエノールピルビン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0564</td><td>PEP</td></tr><tr><td>ピルビン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td>PYR</td></tr><tr><td>Ribose 5-リン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7750</td><td>R5P</td></tr><tr><td>リブロース 5-リン酸</td><td>CarboSynth</td><td>MR45852</td><td>RL5P</td></tr><tr><td>セドヘプツロース 7-リン酸</td><td>CarboSynth</td><td>MS07457</td><td>S7P</td></tr><tr><td>コハク酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3674</td><td>SUCC</td></tr><tr><td>トリブチルアミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90780</td><td>TBA</td></tr><tr><td>トリエチルアミン</td><td>FisherScientific</td><td>O4884</td><td>TEA</td></tr><tr><td>超純水</td><td>FisherScientific</td><td>10977-015</td><td>水</td></tr><tr><td>ウリジン二リン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U4125</td><td>UDP</td></tr><tr><td>ウリジン一リン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U6375</td><td>UMP</td></tr><tr><td>ウリジン三リン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U6625</td><td>UTP</td></tr><tr><td>VWR ヘビーデューティ ボルテックス</td><td>VWR</td><td></td><td>ボルテックス</td></tr><tr><td>ウォーター、LCMS</td><td>JT BAKER</td><td>9831-03</td><td>ウォーター</td></tr><tr><td>ズ アクイティ H UPLC クラス クオータナリーソルベントマネージャー</td><td>ウォーターズ</td><td></td><td>LCMS</td></tr> ウォーター<tr><td>ズ アクイティ H UPLC クラスサンプルマネージャー FTN</td><td>ウォーターズ</td><td></td><td>LCMS</td></tr><tr><td>Waters Acquity Qda 検出器</td><td>Waters</td><td></td><td>LCMS</td></tr><tr><td>Waters Empower 3</td><td>Waters</td><td></td><td>ソフトウェア</td></tr><tr><td>Waters LCMS Total Recovery Vial</td><td>Waters</td><td>186000384c</td><td>LCMS バイアル</td></tr></tbody></table>

逆相液体クロマトグラフィー-質量分析法による無細胞タンパク質合成代謝の絶対定量

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

無細胞タンパク質合成(CFPS)は、タンパク質のインビトロ産生のためのシステムおよび合成生物学における新しい技術です。しかし、CFPSが研究室を超えて、時間の製造技術の中で普及し、標準になる場合は、これらのシステムの性能限界を理解する必要があります。この問題に対して、CFPS反応における糖分解、ペントースリン酸経路、トリカルボン酸サイクル、エネルギー代謝および補因子再生に関与する40の化合物を定量する堅牢なプロトコルを開発しました。この方法では、13個の C-アニリンでタグ付けされた内部標準を使用し、サンプル内の化合物は12個の C-アニリンで誘導体化されます。内部標準および試料を混合し、逆相液体クロマトグラフィー質量分析(LC/MS)によって分析した。化合物の共溶出によりイオン抑制が排除され、平均相関係数が0.988であった2~3桁以上の代謝物濃度の正確な定量が可能となった。40個の化合物のうち5種はアニリンでタグ付けされていないが、CFPSサンプルで検出され、標準的な曲線法で定量された。クロマトグラフィーの実行は、完了するまでに約 10 分かかります。まとめると、CFPSに関与する40の化合物を単一のLC/MSランで分離し、正確に定量する高速で堅牢な方法を開発しました。この方法は、無細胞代謝を特徴付ける包括的かつ正確なアプローチであり、最終的には、無細胞システムの歩留まり、生産性、エネルギー効率を理解し、改善することができます。

概念実証として、緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する大腸菌系CFPS系の代謝産物を定量化するプロトコルを用いた。 CFPS反応(14μL)をエタノールで急行し、脱タンパク質化した。その後、CFPSサンプルは12C-アニリンでタグ付けされ、標準は13C-アニリンでタグ付けされました。タグ付けされたサンプルと標準を組み合わせて LC/MS に注入しました (図 1)。内部標準を用いて中枢炭素・エネルギー代謝に関与する40個の代謝産物を検出・定量化した一方、アニリンでタグ付けされなかった代謝産物5名の標準曲線も開発された(図2)。これらの経路に関与する多様な代謝産物は、リン酸化糖、ホスホカルボン酸、カルボン酸、ヌクレオチド、および補因子のクラスであった。アニリンによる誘導体化は、逆相クロマトグラフィー12を用いてより効果的な分離を促進する親水性分子に疎水性部分を導入した。さらに、この方法は、グルコース6-リン酸およ...

ここでは、無細胞タンパク質合成反応において中枢炭素およびエネルギー代謝に関与する40種類の化合物を定量するための堅牢なプロトコルを提示する。無細胞合成混合物は、逆相液体クロマトグラフィーを用いて効果的な分離のためにアニリンで誘導体化され、同位体標識内部標準を用いて質量分析法によって定量される。

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

無細胞タンパク質合成は、タンパク質のインビトロ生産のためのシステムおよび合成生物学における新しい技術です。無細胞タンパク質合成システムは細胞壁を持たないため、代謝産物に直接アクセスできます。このプロトコルでは、中枢炭素およびエネルギー代謝に関与する40の代謝産物の絶対測定を定量化し、無細胞代謝を特徴付けることを可能にする。このプロトコルは、アニリンを使用した化合物の転移に依存するため、より良い分離と質量分析の分解能が向上します。さらに、代謝物の絶対定量化のために、アニリンにラベルを付ける同位体を持つ内部標準を使用します。タグ付き代謝物は、鉄の抑制の効果を排除するコエルテを、します。化合物の正確な定量化を可能にする。フードで作業し、550マイクロリットルのアニリンと337.5マイクロリットルのLC-MSグレードの水を組み合わせます。遠心分離管に12モル塩酸の112.5マイクロリットル。ボルテックスウェル、およびpH 4.5と摂氏4度で6モルアニリン溶液を保存します。6モル炭素-13アニリン溶液を調製するには、pH 4.5で、炭素-13アニリンの250ミリグラムと132マイクロリットルの水と、12モル塩酸の44マイクロリットルを組み合わせます。ボルテックス井戸、摂氏4度で保管してください。1 ミリリットル EDC 溶液あたり 200 ミリグラムを準備するには、 EDC の 2 ミリグラムを 10 マイクロリットルの水に溶解して、サンプルごとにタグ付けします。そして、よく渦。サンプルを調製するために、無細胞タンパク質合成反応でタンパク質をクエンチおよび沈殿させ、無細胞合成反応に等量の氷冷100%エタノールを添加することによって。サンプルを12,000倍gで遠心し、摂氏4度で15分間遠心する。サンプルの上清を新しい遠心管に移します。炭素12アニリン溶液でサンプルをラベル付けするには、サンプルの6マイクロリットルを新しい遠心管に移し、水で体積を50マイクロリットルにします。1ミリリットルのEDC溶液に200ミリグラムの5マイクロリットルを加え、炭素-12アニリン溶液をよく混ぜ、チューブに5マイクロリットルを移す。室温で2時間穏やかな揺れで反応を渦。2時間後、シェーカーからチューブを取り外し、ヒュームフードに移します。各反応に1.5マイクロリットルのトリエチルアミンを加え、アニリンタグ付け反応を停止し、化合物を安定化させる。遠心分離機を13で、500回gで3分間行う。そして上清を保存します。カーボン13アニリン溶液で内部標準をラベル付けするには、内部ストック溶液を50マイクロリットルの最終体積で80マイクロモルに希釈します。1ミリリットルEDC溶液あたり200ミリグラムの5マイクロリットル、およびよく混合された炭素13アニリン溶液の5マイクロリットルを加える。室温で2時間穏やかな揺れで反応を渦。2時間後、シェーカーからチューブを取り出し、フュームフードの反応に1.5マイクロリットルのトリエチルアミンを加えます。遠心分離機で13、500回g3分間、上清を保存します。タグ付けされた内部標準とタグ付きサンプルを占うために、オートサンプラーバイアルにそれぞれ25マイクロリットルを混ぜます。LC-MS手順で分析します。次に、タグなし代謝物の標準曲線を作成し、まず、50マイクロリットルの体積で、タグなし代謝物のストック溶液を異なる濃度に希釈する。1ミリリットルのEDC溶液に200ミリグラムの5マイクロリットルを加え、各濃度に炭素-12アニリン溶液を5マイクロリットル加えます。室温で2時間穏やかな揺れで反応を渦。そしてトリエチルアミン処理を進める。以前のようにLC-MSで分析する前に遠心化。LC-MSを初期化した後、メーカーの指示に従って、5マイクロリットルのサンプルをカラムに注入します。カーボン-12アニリンタグ付きサンプルに対する適切なmoverzイオン強度を取得する。次に、同じサンプルの5マイクロリットルを再び注入します。カーボン-13アニリンタグ付き規格のmオーバーzイオン強度を取得します。このプロトコルでは、大腸菌系無細胞タンパク質合成において緑色蛍光タンパク質を発現する代謝産物を定量化した。中枢炭素およびエネルギー代謝に関与する40の代謝産物を、内部標準を用いて検出・定量した。アニリンでタグ付けされなかった5つの代謝産物の標準曲線も開発されました。これらの経路に関与する多様な代謝産物は、リン酸化糖、ホスホカルボン酸、カルボン酸、ヌクレオチド、および共因子のクラスであった。さらに、この方法により、グルコース-6リン酸、フルクトース-6リン酸などの構造異性体対の分離が1回のLC-MSランで可能になった。最も重要なステップは、非タンパク質化サンプルをアニリンで標識することです。アニリン溶液は分離するので、安全の良い慣行を維持しながら、迅速かつ効果的に作業することが重要です。この方法は、40の代謝産物の定量化と無細胞代謝を特徴付けるのに役立ちます。しかし、その他の化合物は、定量化できるアミノ酸などの無細胞混合物中にある。これは、無細胞代謝のより包括的な外観を提供するのに役立ちます.この方法は、無細胞系は複雑な代謝を有することを明らかにした, まだより良いエネルギー効率と炭素収量のために利用することができる潜在的に利用することができる動作.このプロトコルは、触媒としてEDCを使用してアニリンで化合物をタグ付けすることに依存しています。これらの試薬は危険であり、注意して使用する必要があります。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

このプロトコールは、細胞からの遊離およびエステル化された生理活性脂肪酸の抽出および分析を実証します。脂肪酸は、安定同位体希釈、キラル液体クロマトグラフィー、電子捕獲、大気化学イオン化、多重反応モニタリング質量分析(SID-LC-ECAPCI-MRM/MS)を用いて正確に定量されます。...

ターゲット安定同位体希釈液体クロマトグラフィー - 質量分析のための細胞の脂質の抽出

還元ジメチル化（REDIラベリング）によるペプチドの安定同位体標識は、正確な質量分析に基づく定量的プロテオミクスのための迅速、安価な戦略である。ここでは、ほぼすべてのサンプルタイプに適用することができるのRediアプローチを使用してタンパク質混合物の調製および分析のためのロバストな方法を示す。...

安定同位体標識するための還元ジメチル化を用いた定量的プロテオミクス

癌細胞プロテオームの詳細な分析は、新規の薬物標的と診断バイオマーカーの同定を容易にします。ここでは、液体および固体腫瘍に由来するがん細胞亜集団における(リン酸化)プロテオームの定量解析のための実験ワークフローについて説明します。これは、細胞濃縮戦略と定量的なSuper-SILACベースの質量分析を組み合わせることで達成されます。...

液体および固形腫瘍由来の癌細胞のプロテオームの定量的質量分析プロファイリング

このプロトコルは、選択された反応モニタリングを使用して、複雑な生物学的サンプル内の標的タンパク質の絶対定量アッセイを実行する方法を説明しています。これは、マウスマクロファージ走化性シグナル伝達経路のタンパク質を正確に定量するために使用されました。標的ペプチドの選択、アッセイ開発、定性的および定量的アッセイについて詳しく説明します。...

絶対タンパク質定量のための質量分析法を選択反応モニタリング

ここでは、高解像度 (〜 30,000) の MS モノクローナル抗体のスパイク ペプチド水準の定量化のためのペプチド断片の検出続くペプチド前駆体のイオン移動度分離と相まってガスクロマト...

液体クロマトグラフィーによるイオン移動 QTOF 質量分析法によるタンパク質のバイオ医薬品の宿主細胞蛋白質の定量化のための HS MRM アッセイ

in vitro系の代謝能力は、薬物や毒物の生体内変化及び処分のための重要な要件です。このプロトコルでは、我々は、私は細胞培養で代謝相を評価するための基準の代謝プローブのアプリケーションを記述します。...

のフェーズI代謝コンピテンシーを特徴づけるために質量分析とルミネベースのアプローチ<em&gt;インビトロ</em&gt;細胞培養

正確に高分解能質量分析計を接続した液体クロマトグラフィーによる定圧ラベリング、広範な分別、バイオインフォマティクス...

定圧ラベリング、豊富な液体クロマトグラフィー、質量分析法、およびソフトウェアによる定量化して深いプロテオームをプロファイリング

プロトコルは、複雑な溶解物ベースの無細胞系における代謝反応を研究するための屈折率または質量分析検出に結合された高速液体クロマトグラフィー法を記述する。...

リセートベースの無細胞システムにおける代謝物プロファイリングのためのリキッドクロマトグラフィー結合と屈折率または質量分析法検出

このプロトコルは、パルスSILACによる老化細胞および非分裂細胞の代謝標識、非標的質量分析分析、およびタンパク質半減期の合理化された計算のためのワークフローを記述します。...

代謝標識および質量分析による老化および非分裂培養細胞におけるタンパク質代謝回転率の測定

ここでは、さまざまな細胞タイプの細胞表面プロテオームの特性評価のためのプロテオミクスワークフローについて説明します。このワークフローには、細胞表面タンパク質の濃縮、その後のサンプル調製、LC-MS/MSプラットフォームを使用した分析、および専用ソフトウェアによるデータ解析が含まれます。...

細胞表面プロテオームのラベルフリー定量のための「Cell Surface Capture」ワークフロー

学ぶ無細胞タンパク質合成における中央炭素・エネルギー代謝の40代謝物質の絶対定量法。アニリン誘導体化と逆相液体クロマトグラフィー-質量分析法を用いて、合成生物学研究のための正確な定量プロトコルを確立する。

逆相液体クロマトグラフィー-質量分析法による無細胞タンパク質合成代謝の絶対定量

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