Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Michael Vilkhovoy; David Dai; Sandra Vadhin; Abhinav Adhikari; Jeffrey D. Varner

doi:10.3791/60329

JoVE Journal
Biochemistry

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Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

逆相液体クロマトグラフィー-質量分析法による無細胞タンパク質合成代謝の絶対定量

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08:06 min

October 25, 2019

DOI: 10.3791/60329-v

Michael Vilkhovoy¹, David Dai¹, Sandra Vadhin*¹, Abhinav Adhikari*¹, Jeffrey D. Varner¹

¹Robert Frederick Smith School of Chemical and Biomolecular Engineering,Cornell University

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

ここでは、無細胞タンパク質合成反応において中枢炭素およびエネルギー代謝に関与する40種類の化合物を定量するための堅牢なプロトコルを提示する。無細胞合成混合物は、逆相液体クロマトグラフィーを用いて効果的な分離のためにアニリンで誘導体化され、同位体標識内部標準を用いて質量分析法によって定量される。

無細胞タンパク質合成は、タンパク質のインビトロ生産のためのシステムおよび合成生物学における新しい技術です。無細胞タンパク質合成システムは細胞壁を持たないため、代謝産物に直接アクセスできます。このプロトコルでは、中枢炭素およびエネルギー代謝に関与する40の代謝産物の絶対測定を定量化し、無細胞代謝を特徴付けることを可能にする。

このプロトコルは、アニリンを使用した化合物の転移に依存するため、より良い分離と質量分析の分解能が向上します。さらに、代謝物の絶対定量化のために、アニリンにラベルを付ける同位体を持つ内部標準を使用します。タグ付き代謝物は、鉄の抑制の効果を排除するコエルテを、します。

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