Name: 環境と肥満相互作用のモデルとしての塩化ビニルと高脂肪食 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 学ぶ塩化ビニル慢性吸入法を用いたマウスモデルによる肝臓毒性評価。高脂肪食との相互作用を解析し、低濃度暴露下での安全性パラメータ再評価に貢献する非侵襲的プロトコルを解説します。

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この研究は、国立衛生研究所(K01 DK096042およびR03 DK107912)からジュリアン・バイアーへの賞によって資金提供されました。研究はまた、助成金番号P20GM113226の下で国立衛生研究所の国立総合医科学研究所の機関開発賞(IDeA)とアルコール乱用とアルコール依存症に関する国立研究所によって支援されました。国立衛生研究所は、賞番号P50AA024337の下で。コンテンツは、著者のみ責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

動物/VC実験はすべて環境衛生省によって承認され、実験動物ケアの安全衛生協会および手順は、地元の制度的動物ケアと使用委員会によって承認されました。
1. 精製・実験食への実験的セットアップと順応
<ol><li>C56Bl/6Jマウスの総数を決定する(1群当たり最小6-8匹)。 注:各ダイエット群の動物はさらに暴露群に細分化されます。研究を計画する際には、必ず必要な動物の総数を考慮してください。</li>
	<li>動物を識別し、重量を量る。これらのデータを記録します。</li>
	<li>通常のチョウから精製低脂肪(LFD)または高脂肪食(HFD)に切り替えて、吸入実験を開始する1週間前にマウスを新しい食事に順応させます(タイムラインについては図1参照)。</li>
	<li>食べ物と水のアドリビタムを提供します。ケージごとに与えられる食品を計量し、記録し、各給餌日に残りの食べ物を計量し、記録することによって、食品消費量を監視します。ケージあたり4匹のマウスを収容する場合は、週に2回約50gの食物を提供する。ケージあたり5匹のマウスを収容する場合は、週に2回約60gの食物を提供する。 注:精製された食事の供給中に、マウスが十分なペレットを持っていることを確認するために、食品の量を毎日チェックする必要があります。ペレットが不十分な場合、マウスは食物を「買いだめ」し、摂取量を増やす傾向がある。さらに、特にHFDはLFDよりもはるかに崩壊する傾向が、同様の効果を引き起こす。</li>
	<li>実験全体を通して動物を監視し、動物の健康が維持されていることを確認します。 注:毎週の体重増加と食品消費量は、代謝モニタリングと一緒に、全体的な動物の健康の指標を提供するために行うことができます。</li>
</ol>2. 塩化ビニル吸入暴露システム
注:「鼻のみ」から「全身」の暴露、手動から自動システムまで、複数の吸入暴露システムが市販されています。このグループによって以前に公開されたデータは、全身マニュアルシステム12、23、24から導出された。自動吸入暴露システムを示す図を図2に示す。
<ol><li>実験室と制御室の両方の希釈空気が、それぞれの流量測定装置に入る前に、高効率微粒子空気(HEPA)と活性炭ろ過、乾燥、圧力調整されていることを確認してください(マスフローコントローラ[MFC])]–実験室、ロタメータ制御室)。 注:コントロールチャンバでは、ロータメータはマウスへの気流を調節します。空気はチャンバーの上部に入り、マウスの下を通過し、次いでマウスの下で排気され、化学フードに入る前にHEPAフィルターを通過する。温度および相対湿度(RH)は部屋の中で測定される。実験室では、希釈空気がVCタンクからの空気と混合される。どちらのフローも MFC で調整されます。2つの混合物の比率は、実験室内のVCの濃度を決定する。VCは異なる方向を指す7つのジェット機が付いている分散機を通して露出室の上部に入る。VC はマウスを通過し、ケージ ラックの下に配置された 12 個の別個のポートを通って排気されます。このチャンバー設計は、以前に25の均質な毒性濃度を提供することが示されている。</li>
	<li>圧力、温度およびRHが実験および制御室の中から監視されることを確認する。</li>
	<li>化学フードの排気領域に入る前にチャンバの排気がHEPAフィルター、CO2プローブ、活性炭フィルターを通過し、マウスが許容できる換気を受けられるようにCO2レベルが監視されていることを確認します。</li>
	<li>カスタムソフトウェアを使用して、吸入暴露中に環境変数を変更、監視、記録します。 注: 手動システムを使用する場合は、露出期間を通じて定期的に必要に応じて、手順 2.1-2.4 で説明した変数を監視およびキャリブレーションする必要があります。</li>
</ol>3. 露出前のセットアップ
<ol><li>技術者の安全のために実験および制御室のすべての気流を消しなさい。</li>
	<li>チャンバーごとに、チャンバードアを開き、排泄物鍋の上に吸収性寝具材料(吸収側アップ)を置きます。吸収性材料を濡らし、露光期間を通じて快適な湿度レベル(40-60%RH)を提供します。</li>
	<li>チャンバー内のVCの所望の露出レベルを設定します。サブOSHAリミット濃度の場合は、VCの0.85 ppmを使用します。チャンバへのVC配信のソフトウェア管理、検出器ベースのフィードバック制御を使用するか、システムに手動調整を使用します。 注:後者のアプローチは、チャンバ容積、チャンバーリフレッシュレート、気流および在庫供給からのVCガスの送達速度の知識を必要とします。これらの計算は、その後、定常状態12、24のチャンバ内のVC濃度の測定値によって検証され、較正されなければならない。チャンバー内のVCを測定するための最も一般的な技術は、サンプル空気12、24のガスクロマトグラフィー分析を介してである。VC配信の精度と精度に関するソフトウェア駆動型アプローチの利点は明らかです。しかし、手動アプローチも正確で一貫した12、24であることが示されている。 注意:VCは、高レベルで既知の毒性および発癌物質である。チャンバーのオン/オフを切り離しながら、適切な個人的な保護装置とガスの取り扱いを行使してください。</li>
</ol>4. 暴露ケージと動物の準備
<ol><li>ハウジングチャンバーからマウスを取り出し、吸入チャンバーケージラックの個々のケージに入れ(コントロールマウス用のケージラック1個、露出マウス用のケージラック)に入ります。ケージラック内の各マウスの配置を毎日ランダム化して、各マウスが露出室内で均一に露出されるようにします。各動物の番号とケージの配置位置を実験室ノートにマークします。</li>
	<li>各ケージラックをそれぞれのチャンバーに入れ、チャンバードアを閉じます。</li>
</ol>5. 露出の実施
<ol><li>VCガスタンクのバルブが開いた位置にあることを確認します。実験室の希釈流量が25 L/分に設定されていることを確認します。</li>
	<li>実験室で希釈された流れを開始する。制御室のロータメータが25 L/minに設定されていることを確認します。</li>
	<li>すべてのセンサー(流れ、温度、湿度、チャンバ圧力、CO2レベル)が正しく動作し、実験室と制御チャンバーの両方で期待される結果を表示していることを確認します。 注: VC フローは、希釈されたフローと必要な VC 濃度に基づいて計算および設定されます。</li>
	<li>露光全体を通して、実験室内で、露光時間、希釈流量、VCフロー、温度、湿度、チャンバ圧力、CO2レベル、および理論VC濃度が表示され、グラフ化され、記録されていることを確認します。制御室の温度と湿度も表示され、グラフ化され、記録されていることを確認します。 メモ:手動システムを使用する場合は、露出期間を通じて、必要に応じてVCフローをチェックし、調整する必要があります。</li>
	<li>露出中に問題が発生した場合は、VC フローをゼロに設定し、希釈流量を最大値に増やしてチャンバをすばやくパージします。</li>
	<li>露光時間(6時間/日)に達すると、ソフトウェアはVCフローを自動的にオフにします。15分の安全タイマーは、その後、VCをクリアするために実験室のための持続後の時間のために開始します。動物を安全に取り除いたら、ダイアログボックスの「OK」ボタンをクリックします。システムは測定値の記録を停止し、露出は終了します。 注: 手動システムを使用する場合、ユーザは露出時間の終了時にVCフローを手動でオフにし、露出終了時のVCクリアランスの時間を計算する必要があります。</li>
</ol>6. 露出後
<ol><li>VCガスタンクのバルブのストップコックを閉じた位置に回し、露出室内のすべての気流をオフにします。制御室に気流が流れなくなるまでロータメータを回します。</li>
	<li>各チャンバーからドアを取り外して、マウスに換気を与えます。ケージラックをチャンバーから取り外します。フードの下で、露出ケージからマウスを取り出し、ハウジングケージに戻します。すべてのマウスを定期的なケージに一晩住むハウジングのために彼らのハウジングルームに戻って輸送します。</li>
	<li>排泄物鍋からの廃棄物は、機関の環境保健サービスによって化学的危険とみなされる可能性があるため、環境衛生安全省(DEHS)承認のバイオハザードコンテナに処分してください。実験および制御システムのためのチャンバードア、排泄鍋、露出ケージラックおよび露出室をきれいにしなさい。</li>
</ol>7. 暴露中のチャンバー内のVC濃度の検証
<ol><li>各露光(3時間)の途中で実験室内のVC濃度の測定を行う。</li>
	<li>VC検出器チューブとプリトリートチューブのガラスチップを破ります。VC検出器チューブのフローアウト端を検出器チューブポンプに取り付けます。VC検出器チューブのフローインエンドを、短いチューブでプリトリートチューブのフローアウトエンドに取り付けます。短いチューブをプリトリートチューブのフローインエンドに取り付けます。</li>
	<li>マウスの呼吸ゾーンの近くにあるサンプリングポートの1つからプラグを取り外します。プリトリートチューブのフローインエンドからサンプリングポートにチューブを取り付けます。</li>
	<li>フルインポジションから、検出器チューブポンプのピストン上のハンドルをフルアウト位置まで伸ばします。これは90 sの期間にわたってVC検出器の管にサンプリングされたガスの100 mLを引っ張る。90sを待った後、ハンドルを押し込み直します。</li>
	<li>合計 400 mL が VC 検出器チューブに引き込られるように、手順 7.4 をさらに 3 回繰り返します。</li>
	<li>チャンバーのサンプリングポートからチューブを取り外し、プラグをポートに挿入し直します。VC検出器チューブの色の変化を調べて、チャンバー内のVC濃度を確認します。</li>
	<li>VC検出器チューブの読み取り値を実験室ノートに記録し、理論値と比較します。VC検出器チューブとプリトリートチューブを適切な容器に入れます。</li>
</ol>8. 吸入暴露実験の終了
注:吸入暴露開始後6、8、または12週間後に所望の時間点が与えられると、実験は終了し、動物は安楽死させられます(タイムラインについては図1を参照)。
<ol><li>安楽死の時間の前にマウスを4時間速くする。 注:この手順は、代謝分析のための空腹時血糖値とインスリンレベルの決定を可能にします。</li>
	<li>麻酔の後に排泄を続ける米国獣医学会(AVMA)のガイドラインと一致する安楽死アプローチを使用してください。</li>
	<li>各マウスに腹腔内注射によってケタミン/キシラジン(100/15 mg/kg)を投与し、麻酔を誘発する。 注:塩化ビニル暴露がその有効性を妨げる可能性があるため、安楽死前の麻酔薬としてペントバルビタールナトリウムを避けてください。</li>
	<li>下大静脈からクエン酸ナトリウム溶液(最終、0.38%)に血液を採取し、血液凝固を予防し、サンプル保存を行います。</li>
	<li>肝臓や他の所望の臓器を削除します。液体窒素中の肝臓およびスナップ凍結部分を解剖し、凍結標本培地に埋め込み、10%緩衝ホルマリンをヒストロジー用に固定する。</li>
	<li>遠心分離を介して血液から血漿を分離し、クイトプラズマを適切なチューブに移し、分析に必要になるまで-80°Cで保存します。</li>
	<li>肝障害の組織学的指標を評価するには、5μMホルマリン固定パラフィン埋め込み肝臓切片でヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色を行い、明視野顕微鏡で画像を得る。</li>
	<li>血漿トランスアミナーゼレベルを得るために、市販のキットを使用してシトレートプラズマ上でアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)とアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)運動性アッセイの両方を行います。 注: 品質管理の場合、C57Bl/6J マウスの血漿トランスアミナスは LFD+VC グループの通常の範囲(35-45 IU/L)である必要がありますが、HFD+VC グループの値は高くする必要があります(図 3C)。</li>
</ol>

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</ol>

WTゴールドスミスは、説明されたシステムのテンプレートであるIEStechnoに金銭的な関心を持っています。残りの著者は開示するものは何もない。

VC強化NAFLDのこのモデルは、全身吸入パラダイムにおけるサブOSHA限界VC暴露の効果を評価する新しい方法である。このモデルは研究者がVCの低レベルだけでサブ肝毒性および感作効果を研究することを可能にする。実際、この共暴露モデルは、強化された肝障害、血漿ALTおよびASTおよび中等度の炎症の上昇を達成する一方で、心臓などの他の臓器系に大きく影響しない一方で、この濃度23である。この慢性モデルは全身吸入室を必要とするが、ストレスおよび露出の集中を最小にする。ここで紹介するプロトコルはソフトウェア主導のアプローチですが、手動アプローチは露出12、24の正確で一貫した方法でもあることを私たちの経験から明けています。また、揮発性有機化合物暴露22に起因する他の臓器損傷23を含む複数の研究領域に容易に適用可能である。特に、このモデルは、環境化学物質および基礎疾患5に対するヒト共暴露の病因に近い可能性がある。
同様の結果を得るには、プロトコル最適化の特定の重要なステップを達成する必要があります。例えば、研究者は、チャンバ内のVCまたは他の毒性物質の濃度が所望の暴露範囲内(すなわち、低レベル、サブOSHA、または急性レベル)内であることを確立する必要があります。吸入室のこのステップを最適化することは、関心のある人的暴露のモデルを成功させるために重要です。第2に、1日当たりの露光時間および実験期間の調整も変更され得る。このグループの利益に応じて、職業的暴露設定が達成され、食事療法の追加パラメータも研究された。しかし、環境および急性暴露も、このプロトコルでモデル化され得る。
この作業は、VC(職業・環境)の現在の暴露限界が安全であるというパラダイムに挑戦します。実際、VCの現在のOSHA暴露限界は1ppmであるが、このモデルは、この限界以下のVCの濃度がマウスのHFDによって引き起こされる肝障害を増強するのに十分であることを証明した。このプロトコルは、研究者が研究し、新しい毒性暴露パラダイムを特徴付け、TASHをモデル化することを可能にします。
これは、慢性、低用量VC暴露の最初のモデルです。以前の研究は、VC暴露のサロゲートとして非常に高いボーラス濃度、急性暴露または活性代謝産物を使用しました。これらのアプローチはすべて、ヒトへの暴露に対する知見の関連性を低下させる。したがって、TASH-NAFLD相互作用のこの新しいモデルは、研究者が低レベルVC暴露の複雑な相互作用を調べるために必要なプラットフォームを提供します。
毒性誘発性肝障害のこのモデルは、他の揮発性有機化合物に使用することができ、また、肝臓および他の臓器系に影響を与える可能性のある他の相互作用を研究するためにも、8,22,23.さらに、このモデルは、さらに、この流行毒性24に対する作用様式の介入療法および詳細な機械的研究を調査するために使用することができる。VCは公知の発がん性物質26、27、28であるため、この暴露パラダイムはVC誘発癌の研究のためにも改変することができる。アルコール性肝疾患のような他の共罹患率も、VC共暴露によって増強され得る。さらに、多価不飽和脂肪18、29、30、または異なるタイプの炭水化物31およびこのモデルにおけるVCとの共暴露など、異なるタイプの脂肪を研究することが興味深いであろう。実際、これらの要因のすべては、肝臓損傷の発症に差分効果を有することが知られており、VC誘発性肝疾患に役割を果たす可能性があります。
結論として、これは環境毒性誘発性肝障害の新しい吸入モデルであり、慢性的で低レベルのVC暴露のための暴露パラダイムを確立する。このモデルで使用されるVCの濃度は、それ自体が肝毒性のサブ肝毒性であり、マウスの別の因子(HFD)によって引き起こされる肝障害を増強する。このモデルは、研究者が慢性VC毒性のメカニズムと介入を研究することを可能にし、露出したヒト被験者を見て、暴露の危険性が最も高い翻訳研究に役立つ可能性があります。

非常に低いレベルで呼吸する空気中に多数の毒性物質が存在します。塩化ビニル(VC)は、ポリ塩化ビニル(PVC)プラスチック製品1を作成するために業界で使用されるモノマーガスである。これは、一般的な環境肝毒性物質、既知の発癌物質であり、ATSDR有害物質優先リスト2に#4にランクされています。人間の健康に及ぼす毒性の影響や既存の共罹患率との相互作用をよりよく理解するためには、ヒトの暴露を模倣する暴露モデルを確立することが重要である。このグループの主な目的は、低濃度での慢性VC暴露の肝効果を研究することです。VCは肝臓にその主な効果を発揮し、脂肪症を引き起こすことが示されている(高濃度で)、壊死、線維症、肝硬変3、4、ならびに肝細胞癌(HCC)およびそれ以外の非常にまれな肝血管肉腫5を有する毒性関連性脂肪性肝炎(TASH)。TASHは何十年も人口の中に存在していた可能性が高いが、研究者4、6によって特徴付けされず、過小評価されたままでした。VC暴露に対する直接的な毒性の懸念を実証する研究の結果、労働安全衛生局(OSHA)は、8時間の作業日7で許容可能な暴露閾値を1ppmに引き下げた。暴露閾値は低下しているが、このVC濃度が人間の健康に及ぼす影響は不明である7.また、肝疾患などの既存の罹患率に対するVC曝露の影響は、8ではほとんど不明である。この知識ギャップは、非アルコール性脂肪性肝疾患(NALFD)4、6、7、9、10、11、12の世界的な流行の増加に起因して、今日特に重要です。重要なことに、VCは最近、他の原因13から肝疾患の独立した危険因子であることが示されている。したがって、このプロトコルの目的は、揮発性環境毒性物質、基礎的な肝損傷のコンテキストにおけるVCへの暴露のための関連する吸入モデルを開発し、ヒト暴露を模倣し、VC誘発またはVC増強肝障害の潜在的な、新しいメカニズムを同定することであった。
多くの環境毒性物質および汚染物質の暴露の主な経路は吸入によってである。いったん吸入されると、化合物は肺を介して全身循環に入り、肝臓に移動し、排泄される前に肝酵素によって代謝活性化され、14、15、16になる。多くの場合、体内の毒性と損傷を引き起こすこれらの活性代謝産物.このグループおよび他の人による以前の研究は、VCガス17、18への暴露のためのサロゲートとしてVC代謝産物を使用してきました。他のグループは、VCの吸入モデルを使用しています。しかし、非常に高い暴露レベル(>50 ppm)は、急性毒性、重度の肝障害、および腫瘍発達19を誘発するために実施された。これらの研究は、VC誘発発癌性の重要な情報とメカニズムを提供しているが、彼らは他の要因との微妙な効果や複雑な相互作用を再現していないので、人間の暴露にはあまり関連していません。
ここで説明するVC吸入と高脂肪食(HFD)モデル(タイムラインは図1を参照)は、マウスがヒト暴露をより密接に模倣する条件下で毒性物質にさらされる慢性、低用量VC暴露(すなわち、サブOSHA濃度)の最初のモデルである。実際、このモデルからのデータは、代謝経路20への影響、酸化ストレスおよびミトコンドリア機能障害4などのVC曝露ヒトで観察される結果を要約した。頭部のみモデルや鼻のみのモデル21のような吸入の他のマウスモデルは、動物を拘束する必要があり、動物にストレスを引き起こす。ここでは、この全身暴露法は、動物への注射や不必要なストレスを必要としません。動物は食物と水へのアドリビタムアクセスを有し、1日あたりの決定された時間数と週に1日の間、より大きな吸入室内に置かれる。さらに、VCが別の肝毒性に対する感受性を変更するという概念は、このグループ12によって最初に実証された新しい発見であり、直接肝毒性に必要な濃度をはるかに下回る濃度でのVC暴露に影響を及ぼす。
吸入暴露のこの方法は、我々の環境に存在する他の揮発性有機化合物を含む様々な気体毒性物質への曝露を模倣するために使用することができる。実際、揮発性有機化合物は、環境毒性物質の大規模なグループであり、工業化された地域でより一般的であり、その結果、特定の集団が慢性暴露のリスクが高くなる22.このプロトコルは、さまざまな実験的な質問に合わせて変更できます。投与される化合物の時間および濃度の長さは、変化させることができる。最初は肝障害の判定のために開発されたが、他の臓器系はこのモデル23で研究されている。動物との慢性暴露の研究を目指すが、動物のストレスを最小限に抑えたい研究者は、このモデルの使用を検討すべきである。

<table><tbody><tr><td>ALT/AST試薬</td><td>サーモフィッシャー</td><td>TR70121、TR71121</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6Jマウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>000664動物</td>実験は、<td>関連するすべての倫理および動物福祉規制に準拠しなければならず、 適切な政府および施設の動物管理および使用委員会によって審査および承認されなければなりません。これは慢性的な研究であるため、4〜6週齢の雄または雌のマウスを使用することをお勧めします。</td></tr><tr><td>CO2モニター</td><td>IEStechno</td><td>Ex-Sens</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma</td><td>E6003</td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリン</td><td>シグマ</td><td>HHS16</td><td></td></tr><tr><td>吸入暴露チャンバーシステム</td><td>IEStechno</td><td>GasExpo</td><td>吸入暴露チャンバーシステムには、カスタムソフトウェア、インターフェース、コントローラーハブが含まれています</td></tr><tr><td>飽和脂肪酸 (13%) コントロールダイエット</td><td>Teklad Diets</td><td>TD.120336</td><td></td></tr><tr><td>飽和脂肪(42%)ダイエット</td><td>Teklad</td>ダイエット <td>TD.07511</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム</td><td>Sigma</td><td>71497</td><td></td></tr><tr><td>塩化ビニル</td><td>MATHESON TRI-GAS</td><td>Series 3590-CGA *</td><td>ガスの取り扱いには注意が必要です</td></tr></tbody></table>

環境と肥満相互作用のモデルとしての塩化ビニルと高脂肪食

Vinyl Chloride and High-Fat Diet as a Model of Environment and Obesity Interaction

豊富な環境汚染物質である塩化ビニル(VC)は、高レベルで脂肪性肝炎を引き起こしますが、より低いレベルでは安全であると考えられています。いくつかの研究は、直接肝毒性としてVCの役割を調査しているが、VCは、高脂肪食(HFD)によって引き起こされる非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)のような他の要因に肝臓の感受性を変更するという概念は新しい。このプロトコルは、VCへの慢性的で低レベルの暴露の影響を評価するための露出パラダイムを記述します。マウスは吸入暴露の開始の1週間前に低脂肪または高脂肪食に順応し、実験を通してこれらの食事に留まる。マウスは、吸入室内のVC(サブOSHAレベル:<1 ppm)または室内空気に6時間/日、5日/週、最大12週間さらされます。動物は体重増加と食物消費のために毎週監視されています。VC暴露のこのモデルはVC吸入だけで過度の肝臓傷害を引き起こさない。しかし、VCとHFDの組み合わせは、肝臓病を有意に高める。この共露光モデルの技術的な利点は、拘束することなく、全身暴露です。さらに、条件は、基礎的な非アルコール性脂肪性肝疾患とVCへの複合暴露の非常に一般的な人間の状況に近いので、VCは肥満の合併症として肝臓損傷の発症のための環境リスク因子であるという新しい仮説を支持する(すなわち、NAFLD)。この作業は、VC(職業・環境)の現在の暴露限界が安全であるというパラダイムに挑戦します。このモデルの使用はVC暴露の危険に新しい光および懸念を与えることができる。毒性誘発性肝障害のこのモデルは、他の揮発性有機化合物のために使用することができ、肝臓や他の臓器系に影響を与える可能性のある他の相互作用を研究.

実験の過程で、動物の体重と食物消費量を毎週監視し、動物の健康を確保し、生体内代謝を評価した。図3Aは、12週間の実験における体重と食物消費量を示す。体重は週1回測定し、食品消費量は全群について週2回測定した。すべてのマウスは研究の過程を通して体重を増やした。一方、HFD群中のマウスはLFD群のマウスとしてより体重が増加したが、VCに曝露されたマウスは、それぞれの対照群のマウスよりも体重が増えなかった。食品消費量は、すべてのグループ間で異なっていなかった12,24.
図3Bは、一般的な形態の分析のためにH&amp;Eで染色された肝臓切片の代表的な顕微鏡写真を示す。LFDグループでは、VCは病理学的変化を引き起こさなかった。HFD給餌は、脂肪症(脂肪蓄積)およびVC暴露がこの効果を増加させた。さらに、HFD群におけるVC曝露は、いくつかの炎症性病巣12、24をもたらした。
血漿トランスアミネアゼ(ALTおよびAST)レベルは、肝臓損傷の指標として測定され、高いトランスアミネアゼレベルは、肝臓の損傷の指標である。LFD群では、VCはトランスアミネアゼレベルを増加させなかった。HFD単独では、わずかに増加したトランスアミネアゼレベルおよび重要なVCは、この効果を有意に強化した(図3C)12、24。
体重対体重比を各群について算出した。HFD は肝臓と体重の比率を有意に増加.しかし、VCはこの効果を有意に増加させなかった(図3D)12.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60351/60351fig01.jpg"> 図 1: 吸入モデルの手順の概要マウスはそれぞれの低脂肪(13%飽和脂肪)または高脂肪(42%飽和脂肪)を1週間アドリビタムに与え、精製された食事に順応させる。1週間後、マウスは吸入レジメンに導入される。そのために、マウスは、&lt;1 ppm(0.85 ppm ± 0.1 ppm)のサブOSHAレベルVC濃度(0.85 ppm ±0.1 ppm)または室内空気(制御)に曝露するための最先端の全身吸入室に置かれ、6時間/日、5日/週、12週間です。吸入手順の間、マウスは食物および水への自由なアクセスを許される。12週で、マウスは午前中に安楽死させる。このモデルは慢性暴露のより長い期間に延長することができる。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60351/60351fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60351/60351fig02.jpg"> 図2:吸入室設計均質な毒性濃度を提供する自動吸入暴露システムの図を示す。カスタムソフトウェアを使用すると、吸入暴露中に環境変数を変更、監視、記録できます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60351/60351fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60351/60351fig03.jpg"> 図3:塩化ビニルだけでは、肝臓の外傷を引き起こさないが、食事誘発性肝疾患を増強する。(A) 体重と食品消費量を毎週監視した。(B)H&amp;E染色による一般的な肝形態の代表的な顕微鏡写真が示されている(倍率=200x)。(C)キチン化血漿を暴露期間の終わりに回収し、肝障害の指標としてトランスアミネアゼ酵素活性について分析した。(D)肝重量は、異なる実験時間点で決定し、全身重量と比較した。結果は、それぞれのLFD制御と比較して平均±SEM.b, p &lt; 0.05 VC の不在と比較して.グループごとのサンプルサイズ n = 8−10。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60351/60351fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルの目標は、過度の肝臓損傷を引き起こさないが、むしろ既存の肝臓の損傷を悪化させる低レベルの毒性暴露のマウスモデルを開発することであった。このパラダイムは、人間の暴露と安全と考えられる毒性濃度への暴露時に起こる微妙な変化をよりよく再現します。

Vinyl chloride (VC), an abundant environmental contaminant, causes steatohepatitis at high levels, but is considered safe at lower levels. Although ...

塩化ビニルは、現在の安全制限を下回る濃度での食事などの他の要因によって引き起こされる肝臓の損傷を悪化させます。したがって、平均母集団の使用パラメータを再評価する必要があります。この技術の主な利点は、動物に最小限のストレスを引き起こしながら、人間の暴露を密接に模倣する慢性的で非侵襲的な吸入プロトコルを使用することです。この手順のデモンストレーションは、ポストドクターのアンナ・ラングと、私の研究室の大学院生のレジーナ・シュネゲルバーガーです。吸入実験開始の1週間前に、実験動物のすべてを量り、ケージごとに与えられる低脂肪または高脂肪食の量を量る。食品および水のアドリビタムを提供し、各暴露群の通常のチャウを必要に応じて低脂肪または高脂肪の食事チャウに置き換えます。各給餌日の終わりに残りの食物を計量し、実験全体を通してマウスを監視して、動物の健康状態が維持されるようにします。塩化ビニル吸入露光システムを設定するには、実験室と制御室の両方の希釈空気が高効率の粒子状空気と活性炭が濾過され、乾燥し、圧力調整されてから、それぞれの流量測定装置に入るようにしてください。温度と相対湿度が実験室および制御室内から監視されていることを確認し、チャンバー排気がHEPAフィルター、二酸化炭素プローブ、および活性炭フィルターを通過してから、化学フードの排気領域に入り込み、マウスが許容可能な換気を受けられるようにします。カスタム ソフトウェアを使用して、吸入時の環境変数を変更、監視、記録できます。吸入暴露のためにチャンバを準備するには、実験室および制御室内のすべての空気の流れをオフにすることから始めます。各チャンバーのドアを開け、吸収性寝具材を置き、排泄物鍋の上に吸収剤側を上に置きます。次いで、吸収材を湿潤し、露光期間を通して約40〜60%の相対湿度の快適な湿度レベルを提供し、実験室内に塩化ビニルの所望の露光レベルを設定する。チャンバーの準備ができたら、マウスを吸入室ケージラック内の個々のケージに移し、ラック内の各マウスの配置を毎日ランダム化して、各マウスがチャンバー内で均質に露出していることを確認します。次に、ケージラックをそれぞれのチャンバーに設置し、チャンバーのドアを閉めます。吸入暴露実験を行う場合、塩化ビニルガスタンクのバルブが開放位置にあることを確認し、実験室の希釈液流量を1分あたり25リットルに設定します。制御チャンバのロタメーターが毎分25リットルに設定されていることを確認し、すべてのセンサーが正しく動作していることを確認し、実験室と制御室の両方で期待される結果を表示します。露光を通して、実験室の露光時間、希釈液流、塩化ビニル流量、温度、湿度、チャンバー圧力、二酸化炭素レベル、および理論塩化ビニル濃度を監視し、記録する。制御チャンバの温度と湿度も表示、グラフ化、記録されていることを確認します。各露光の途中で、塩化ビニル検出器チューブとプレトリートチューブのガラス先端を破り、塩化ビニル探知管の端部を検出器チューブポンプに取り付けます。塩化ビニル探知器チューブの端の流れを退却管の流れに取り付け、プレトリートの終わりに流れに短いチューブを取り付けるために、短いチューブを使用してください。呼吸ゾーン近くのサンプリングポートの1つからプラグを取り外し、遠く離れ管の端にある流れからサンプリングポートにチューブを取り付けます。フルイン位置から、検出器チューブポンプのピストンのハンドルをフルアウト位置まで伸ばし、チャンバーから塩化ビニル探知管に100ミリリットルのサンプルガスを引き出します。90秒後、ハンドルを押し戻します。最後のガスサンプルが得られたら、チャンバーのサンプリングポートからチューブを取り外し、プラグをポートに再挿入します。塩化ビニル検出器管の色変化を検査し、チャンバー内の塩化ビニル濃度を確認し、検出器チューブの読み取りを記録して理論値と比較します。暴露中に問題が発生した場合は、塩化ビニルの流れをゼロに設定し、希釈液の流れを最大値に増やして、チャンバーを素早くパージします。露光時間に達すると、ソフトウェアは自動的に塩化ビニルの流れをオフにします。15分の安全タイマーは、塩化ビニルをクリアするために実験室の持続時間をカウントダウンし始めます。動物を安全に削除したら、[OK]をクリックします。露光期間の終わりに、塩化ビニルガスタンクバルブストッパーコックを閉じた位置に回し、露光チャンバ内のすべての空気の流れをオフにします。空気が制御チャンバーを通って流れなくなるまでロタメーターを回し、各チャンバからドアを取り外します。チャンバーからケージラックを取り外し、マウスをラミナーフローフードの下の自宅のケージに戻します。その後、機関の安全衛生規則に従って排泄物パンから任意の廃棄物を処分し、チャンバーのドア、パン、露出ラック、およびチャンバーをきれいにします。ここでは、12週間の実験の週単位の体重および隔週の食物消費量が示されている。すべてのマウスは、この研究の過程を通じて体重を増やしました.しかし、高脂肪食群のマウスは低脂肪食群のマウスに比べて体重が増えたが、塩化ビニルにさらされたマウスはそれぞれの対照群のマウスよりも体重が増えなかった。食品の消費量もグループ間で異なっていませんでした。これらの代表では、H&E染色された肝臓切片の顕微鏡写真、塩化ビニルは低脂肪食群にあからず病理変化を起こさなかった。高脂肪食餌は有意に増加した脂肪症、塩化ビニル暴露によってさらに悪化した。また、高脂肪食群における塩化ビニル暴露は、炎症病巣をもたらした。低脂肪食動物では、塩化ビニルはトランスアミナーゼレベルを増加させなかったが、高脂肪食単独ではトランスアミナーゼ発現がわずかに増加し、この効果の有意な増強は塩化ビニルに曝露された高脂肪食群において観察された。また、高脂肪食は肝臓対体重比を有意に増加させたが、塩化ビニルはこの効果に有意に影響を与えなかった。このプロトコルを実装する場合は、人間による塩化ビニルへの不注意な暴露が避けないように、適切な安全対策が講じられているように常に注意してください。この手順は、動物の健康、福祉、臓器の損傷に対する塩化ビニル暴露の影響の短期的、長期的、および累積的な影響に関する質問に答えることができます。これらの研究は、環境・職業リスク評価の分野に影響を及ぼします。例えば、私たちのグループは現在、塩化ビニルと食事の間の機械学的相互作用を研究しています。

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Research

JoVE Journal

Medicine

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