Name: 内因性IRF5ダイメネレーションのネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動免疫ブロット解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 学ぶ 内因性IRF5ダイメレーションのネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動免疫ブロット解析。CAL-1細胞を用いたこの手法は、IRF5活性化の評価と免疫応答メカニズムの解明に有用です。

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このプロジェクトは、クローチャー財団とシティ大学のスタートアップファンドからの資金援助によって支援されました。私たちは、原稿の実験と批判的な読書の助けをチャウ研究所のすべてのメンバーに感謝します。

注:ここで説明するプロトコルは、TLR7/8のアゴニストであるレシキモド(R848)で処理されたCAL-1 pDC細胞株を使用しています。このプロトコルは、RAW 264.7(マウスマクロファージ株)、THP-1(ヒト単球細胞株)、BJAB(ヒトB細胞株)、ラモス(ヒトB細胞株)、およびMUTZ-3(ヒト樹状細胞株)23を含む他のヒトおよびマウス細胞タイプに適用されている。
1. CAL-1細胞の刺激
<ol><li>5%の胎児ウシ血清(FBS)、25 mM HEPES、および1xメルカプトエタノール(すなわち、完全なRPMI 1640培地)を含むRPMI 1640培地の20−25 mLを有する無菌条件下でT75フラスコでCAL-1細胞培養物を維持する。</li>
	<li>細胞を50 mL円錐形チューブに移します。 注:CAL-1細胞は非付着性である。付着細胞型の場合、細胞を収穫するために標準的なトリプシン化を行うことができる。</li>
	<li>細胞を室温(RT)で5分間200xgで遠心分離する。 上清を除去し、完全なRPMI 1640培地の8mLで細胞ペレットを再懸濁し、均質な単一細胞懸濁液を得る。</li>
	<li>血球計を使用して細胞を数えます。各ウェルに予熱された完全なRPMI 1640培地の4 mLを有する6ウェルプレートにウェルあたり1 x 106細胞の密度で細胞をシードする。37°Cで20-24hをインキュベートし、5%CO2で合流率が90%−95%に達するようにする(約1.5 x 106細胞に相当する)。</li>
	<li>6ウェルプレートのウェル当たり1mg/mL R848の4 μL(最終濃度1μg/mL)を加えて細胞を刺激します。また、R848処理なしの細胞とよく無刺激制御を設定します。</li>
	<li>R848がプレートを左右にゆっくりと揺らすことによって均等に分散していることを確認します。次いで、37°Cおよび5%CO2でインキュベーターで2−16hの細胞をインキュベートする。</li>
</ol>2. 細胞タンパク質の抽出
<ol><li>6ウェルプレートから5mL遠心管にセル懸濁液を移します。</li>
	<li>RTで200 x gで5分間遠心分離機を取り出し、リン酸緩衝生理食べ物(PBS)の1mLで細胞ペレットを再懸濁し、均質な単一細胞懸濁液を得た。</li>
	<li>セルサスペンションを1.5mL遠心チューブに移します。</li>
	<li>4°Cで0.5−1分間12,000 x gで短時間スピンダウンし、上清を慎重に取り除きます。</li>
	<li>1 Mトリス-HCl pH 7.4(最終濃度25m)、5MNaClの7.5mL(最終濃度150mM)、0.5mEdTA0.5mL(最終濃度1mM)、NP-40の2.5mL(最終濃度1%)を含むlysisバッファーを調製グリセロールの7.5 mL(最終濃度5%)脱イオン水の250 mLで(ddH2O)。使用直前のリシスバッファーに1xの最終濃度に100倍プロテアーゼ阻害剤単独使用カクテルを追加します。準備されたリシスバッファーを氷の上に保管してください。 注:プロテアーゼを持たないリシスバッファーは、4°Cで保存することができる。</li>
	<li>細胞ペレットを30μLの氷冷分解バッファーに再ステープルし、上下にピペッティングして混合します。</li>
	<li>氷の上で15~20分間インキュベートします。</li>
	<li>4°Cで15−20分の12,000 x gで遠心分離してライサートを明らかにする。上清を新しい1.5mL遠心分離管に移します。抽出物は常に氷の上に保管してください。 注:細胞の洗浄物は-20°Cまたは-80°Cで貯えることができる。サンプルを沸騰させないようにしてください。</li>
	<li>ブラッドフォード試薬を使用してタンパク質濃度を測定します。</li>
</ol>3. ネイティブページによるIRF5ダイアライゼーションの解析
<ol><li>上部(-)および下部(+)室電気泳動バッファーを調製する。上部チャンババッファーは、1xネイティブPAGE実行バッファー内の0.3%デオキシコリントナトリウム(NaDOC)で構成され、下部チャンバは1xネイティブPAGE実行バッファのみで構成されています。 注:すべての新しい実行のための新鮮な上部のチャンバーバッファを準備します。</li>
	<li>3%-12%ネイティブPAGEゲルを井戸をゆがめずに水で十分に洗い流します。ゲルをミニゲルタンクにセットし、櫛を取り除きます。4°Cの冷たい部屋で、または氷の上で30分間150Vでゲルを前もって実行します。 注:プリランニングは、ゲルの実行を妨げる可能性のある過剰なアンモニアおよび過硫酸イオンを除去します。</li>
	<li>プリランの間に、氷上に保持されている細胞タンパク質を4倍のネイティブサンプルバッファーと混合して、読み込み用のサンプルを準備します。</li>
	<li>プリラン後、サンプルあたり10−15 μLの最終容積でタンパク質を10~15 μg積み込みます。 注:タンパク質の過負荷は、塗りつぶしを引き起こす可能性があります。</li>
	<li>ゲルを85Vで30分間、2時間150Vで走らせる。 注:異なるラボで使用される機器や細胞株の違いを考慮すると、タンパク質サンプルの濃度、電圧、実行時間にわずかな変更を加えることで、このプロトコルを最適化するのに適している場合があります。実行時間を増やしながら、事前実行電圧と実行電圧を下げると、ダイマーの解像度と結果の一貫性が向上する場合があります。</li>
	<li>ゲルをSDSランニングバッファ(25 mMトリスpH 8.3、250 mMグリシン、0.1%SDS)に30分間RTで浸します。 注:撹拌は必要ありません。時折、バンドの強度は、主にIRF5のモノマー形態に影響を与えるデオキシコール酸(DOC)の存在下で非効率的な伝達に起因するタンパク質の量に比例しない場合があります。転送の前にSDS実行中のバッファにゲルを浸すと、この問題は解決します。ゲルは壊れやすい。ゲルの底部(すなわち、より高いパーセンテージ)の端から細かい注意を払って取り扱います。</li>
</ol>4. IRF5の免疫ブロット分析
<ol><li>ポリビニリデレンジフッ化物(PDVF)膜をメタノールに約5分間浸して活性化します。</li>
	<li>膜の一角に切り取って、その向きを示します。気泡が内部に閉じ込められていないことを確認するために、特別な注意を払って、メーカーのプロトコルに記載されている順次注文に従って転送サンドイッチを組み立てます。</li>
	<li>転写カセットをタンクに入れ、氷の上で1時間20Vで転送します。 注:すべてのインキュベーションを実行し、ロッキングシェーカーで後続のステップで洗います。</li>
	<li>転送が完了した後、プラスチック鉗子でカセットから膜を取り外します。RTで45分間ブロッキングバッファー(TBS)で膜をブロックします。 注:5% BSA を持つ TBS バッファーは、ブロッキング バッファとしても使用できます。</li>
	<li>表1に記載されている一次抗体で膜をインキュベートする。1x TBST洗浄バッファー(20 mMトリス、pH 7.0、150 mM NaClおよび0.1%ツイーン20)で膜を3分間洗浄します。洗浄2xを繰り返します。</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>ディルーション</td>
			<td>ディルーション バッファ</td>
			<td>インキュベーション</td>
			<td>コメント</td>
		</tr>
<tr>
<td>一次抗体(抗IRF5)</td>
			<td>1/1,000</td>
			<td>TBS ブロッキング バッファ</td>
			<td>RTで4 °Cまたは2hで一晩</td>
			<td>希釈抗体は、アジ化ナトリウム0.02%の存在下で4°Cで保存した場合、数回再利用することができる。</td>
		</tr>
<tr>
<td>二次抗体(抗ウサギ)</td>
			<td>1/10,000</td>
			<td>TBS ブロッキング バッファ</td>
			<td>RTで45分</td>
			<td>希釈抗体は、アジ化ナトリウム0.02%の存在下で4°Cで保存した場合、数回再利用することができる。</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">
注:希釈はメーカーによって異なるため、最適化する必要があります。</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:免疫ブロッタ化手順で使用される抗体の仕様。
<ol start="6"><li>表1に記載されている二次抗体で膜をインキュベートする。1x TBST洗浄バッファーで3分間膜を洗浄します。洗浄2xを繰り返します。</li>
	<li>適切なゲルドキュメンテーションシステムを使用してブロットをスキャンします。</li>
</ol>

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著者は何も開示していない。

ここで説明するプロトコルは、内因性IRF5のモノマーと薄暗の両方の形態を区別する修正されたネイティブPAGEです。特殊なイメージングフローサイトメトリー技術23、27、28、30を用いて内因性IRF5活性化の検出を報告する研究はほとんど行われていない。このプロトコルは、一般的な技術と一般的な試薬とツールを使用して、活性化の初期イベント中に内因性IRF5活性化状態を評価します。このプロトコルは、IRF5 のモノマー形式と薄暗い形式を区別できるように、標準のネイティブ PAGE プロトコルを簡単に変更する必要があります。それは他の細胞株23を使用して研究に容易に適応することができる。この改変されたネイティブPAGEプロトコルは、非特異的タンパク質干渉なしで、その2つの形態で内因性IRF5を明確に解決することができる(<strong clas...

インターフェロン調節因子5(IRF5)は、特に炎症性サイトカインおよびI型インターフェロン(IFN)1、2の放出において、免疫応答を調節する上で顕著な役割を果たす重要な転写調節因子である。 、3.IRF5の誤認は、全身性エリテマトース、多発性硬化症、関節リウマチなどに関連するIRF5遺伝子座の様々な多型によって明らかなように、多数の自己免疫疾患の一因である4、5,6,7,8,9,10.したがって、内因性IRF5活性化状態に対する堅牢な検出アッセイは、生理学的に関連する細胞コンテキストにおけるIRF5の調節経路および下流効果を理解するために重要である。
IRF5は、単球、樹状細胞(DC)、B細胞、およびマクロファージ1、11で構成的に発現される。他のIRFファミリー転写因子と同様に、IRF5は潜伏状態の細胞質に存在する。活性化すると、IRF5はリン酸化され、ホモダイマーを形成し、その後核に転移し、I型IFNおよび炎症性サイトカインをコードする遺伝子の特定の調節要素に結合し、最終的にこれらの遺伝子1の発現を誘導する。 ,2,11,12,13.IRF5は、エンドソームに局在するTLR7、TLR8、およびTLR9などの様々なトール様受容体(TLR)の下流の自然免疫応答を調節し、シグナル伝達1、11、14にMyD88を使用する。これらのTTLは、主に感染15、16、17、18の症状である一本鎖RNA(ssRNA)および非メチル化CpG DNAなどの外来核酸種を認識する。IRF5は、細菌、ウイルス、および真菌感染症19、20、21に対する免疫応答を調節することが示されている。免疫系におけるIRF5の影響力と多様な役割を考えると、IRF5活性を増強または減衰させることは、治療薬22の開発のための新しい道として役立つ可能性がある。したがって、異なる細胞型におけるIRF5活性を調節する経路およびメカニズムを徹底的に調査できるように、内因性IRF5の活性化状態を監視するプロトコルを開発することが重要である。
我々の知る限りでは、このプロトコルの開発前に、内因性IRF5活性化のための生化学的またはゲル電気泳動アッセイは公表されていない。リン酸化は、IRF5活性化の重要な第一歩であることが示されており、IRF5活性13にとって重要なセリン残基の発見と確認につながったリン特異的IRF5抗体が開発された。しかし、抗体は、免疫沈殿または過剰発現時にリン酸化IRF5を明確に検出する一方で、我々の手の中の全細胞リサートにおけるIRF5リン酸化を検出することができない(データは示されていない)。二量体化はIRF5活性化の次のステップであり、このステップを調査する多くの重要な研究は、通常IRF511、12を発現しない無関係な細胞型において、エピトープタグ付きIRF5の過剰発現に依存していた。、24、25。これまでの研究では、二分化されたIRF5が必ずしも核に転移するとは限らないため、必ずしも完全に活性化されるとは限らないことが示されている。内因性IRF5核局在化のためのアッセイは、イメージングフローサイトメトリー27によるIRF5活性化を評価するために開発された。このアッセイは、特に一次細胞型28、29型においてIRF5活性を理解するために重要な研究に適用され、分野の知識を大幅に進歩させた。しかし、このアッセイは、研究者が広く利用できない特殊な機器に依存しています。さらに、IRF5規制経路を解剖し、上流のレギュレータおよび経路成分を同定しながら、活性化の初期段階を調査する必要が生じることがよくあります。本研究は、分子生物学ツールを搭載したラボで行うことができるIRF5の初期活性化イベントに対して、堅牢で信頼性の高い生化学的アッセイを提供します。ここで説明するプロトコルは、特にIRF5核局在化23のイメージングフローサイトメトリック解析などの直交アッセイと組み合わせると、IRF5作用の経路とメカニズムを調べるのに非常に役立ちます。27,28,30.
天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ネイティブPAGE)は、タンパク質複合体31、32を分析するために広く使用されている方法である。ドデシルスルフェートポリアクリルアミドゲル電気泳動ナトリウムとは異なり、ネイティブPAGEは、その形状、サイズ、および電荷に基づいてタンパク質を分離します。また、退化31、33、34、35なしでネイティブタンパク質構造を保持します。提示されたプロトコルは、ネイティブPAGEのこれらの機能を利用し、IRF5のモノマーとダイメリックの両方の形式を検出します。この方法は、内因性リン酸化IRF5を検出できる適切な市販の抗体がないため、早期活性化事象を検出するために特に重要である。以前は、いくつかの公開された研究では、ネイティブ PAGE を使用して IRF5 ダイアライゼーションを評価していました。しかし、これらの研究の大半は、活性化状態2、13、24、36、37を分析するために外因性エピトープタグ付きIRF5の過剰発現に依存していました.本研究は、ヒト血漿細胞細胞系樹状細胞(pDC)ラインにおける改変されたネイティブPAGE技術を介して内因性IRF5ダイアライゼーションを解析するためのステップバイステッププロトコルを提示し、そこでIRF5活性がその機能1に重要であることが示された。 38、39、40。この同じ技術は、他の細胞株23に適用されている。

<table><tbody><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Life Technologies, HK</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>300 W/250 V 電源 230 V AC</td><td>Life Technologies, HK</td><td>PS0301</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IRF5 antibody</td><td>Bethyl Laboratories, USA</td><td>A303-385</td><td></td></tr><tr><td>BIOSAN ロッカーシェーカー (冷蔵室安全)</td><td>EcoLife, HK</td><td>MR-12</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Buffer, pH 8, 0.5 M 4x 100 mL</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td>15575020</tr><tr><td>グリセロール 500 mL</td><td>Life Technologies</td><td>15514011</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Life Technologies, HK</td><td>15527013</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG DyLight 800 標識抗体</td><td>LAB-A-PORTER/Rockland, HK</td><td>610-145-002-0.5</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG DyLight 800標識抗体</td><td>LAB-A-PORTER/Rockland, HK</td><td>611-145-002-0.5</td><td></td></tr><tr><td>Halt protease inhibitor cocktail (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific, HK</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies, HK</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>LI-COR Odyssey Blocking Buffer (TBS)</td><td>Gene Company, HK</td><td>927-50000</td><td></td></tr><tr><td>Mini Tank blot module combo;トランスファーモジュール、アクセサリー</td><td>Life Technologies、HK</td><td>NW2000</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE 3-12% ゲル、10 ウェルキット</td><td>Life Technologies、HK</td><td>BN1001BOX</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE ランニングバッファー 20x</td><td>Life Technologies、HK</td><td>BN2001</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE Sample Buffer 4x</td><td>Life Technologies、HK</td><td>BN2003</td><td></td></tr><tr><td>NP-40 Alternative、ノニルフェニルポリエチレングリコール</td><td>錫ハング/Calbiochem, HK#</td><td>492016-100ML</td><td></td></tr><tr><td>PBS 7.4</td><td>Life Technologies, HK</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td><td>Bio-gene/Merck Millipore, HK</td><td>IPFL00010</td><td></td></tr><tr><td>Protein assay kit II (BSA)</td><td>Bio-Rad, HK</td><td>5000002</td><td></td></tr><tr><td>R848</td><td>Invivogen, HK</td><td>tlrl-r848</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies, HK</td><td></td><td></td>61870127</tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>ThermoFisher</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム &ge;97% (滴定)</td><td>ブリキ ハング/シグマ、HK</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Life Technologies、HK</td><td>15504020</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Tin Hang/Sigma、HK</td> <td>#P9416-100ML</td><td></td></tr></tbody></table>

内因性irf5ダイメネレーションのネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動免疫ブロット解析

Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis Immunoblot Analysis of Endogenous IRF5 Dimerization

インターフェロン調節因子5(IRF5)は、免疫応答を調節するための重要な転写因子である。トール様受容体ミエロイド分化一次応答遺伝子88(TLR-MyD88)シグナル伝達経路の下流で活性化される。IRF5活性化は、細胞質から核へのリン酸化、ダイマライゼーション、およびその後の転移を伴い、様々な炎症性サイトカインの遺伝子発現を誘導する。IRF5活性化のための検出アッセイは、IRF5関数とその関連経路を研究するために不可欠です。本論文では、CAL-1ヒト血漿細胞系樹状細胞(pDC)ラインにおける内因性IRF5活性化を検出する堅牢なアッセイについて説明する。このプロトコルは、モノマーおよびダイマーの形でIRF5を区別できる改変された非脱電性電気泳動アッセイで構成されており、IRF5活性化を分析するための手頃な価格で敏感なアプローチを提供します。

抗IRF5抗体を用いた免疫ブロット(IB)を、2時間1μg/mL R848で無刺激または刺激したCAL-1細胞に対して行った(図1)。細胞リサテを調製し、ネイティブPAGEを行った。非刺激されたCAL-1細胞では、IRF5は、その単数形に対応するネイティブPAGE上の単一バンドとして検出された。R848を用いたCAL-1細胞を2時間治療すると、IRF5モノマーのレベルは、IRF5の薄暗い形態に対応したゆっくりと移動するバンドの蓄積の同時増加と共に減少した。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60393/60393fig01.jpg"> 図1:TLR7/8アゴニストで刺激した場合、CAL-1細胞で内因性IRF5を二質化した。CAL-1細胞を未処理またはR848で処理した。タンパク質サンプルは、天然のPAGEによって解決され、続いて抗IRF...

CAL-1血漿細胞性樹状細胞株における内因性インターフェロン調節因子5ダイアライゼーションを分析するためのネイティブウェスタンブロット法が記載されている。このプロトコルは、他のセルラインにも適用できます。

内因性IRF5ダイメネレーションのネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動免疫ブロット解析

Interferon regulatory factor 5 (IRF5) is a key transcription factor for regulating the immune response. It is activated downstream of the Toll-like ...

このプロトコルは、刺激の初期のイベント中に内因性IRF5活性化を評価するために商業的に取得することができる試薬およびツールと一緒に広く使用されている技術を利用する。他の細胞コンテキストでIRF5生物学を調査するために簡単に適用することができます。ネイティブ PAGE は広く使用されている手法ですが、明確で堅牢で、解釈可能で再現可能な結果を得ることは技術的に困難です。市販のランニングバッファとゲルシステムを使用すると、変動を最小限に抑えることができます。そして細部に注意を払うことが不可欠であり、経験は良い結果を得るために成功するための鍵です。この変更されたネイティブ PAGE プロトコルには、成功の鍵となる細かな詳細を含む多くのステップが含まれます。視覚的なデモンストレーションは、研究者にとって有益であろうこれらの詳細を示すことができます。完全なRPMI 1640培地で、T75フラスコで37°C、炭酸ガス5%でCAL-1細胞培養を維持します。細胞を刺激する準備ができたら、50ミリリットルの円錐管に移し、200 x gで5分間遠心分離します。上清を取り除き、ペレットを培地に再懸濁させて均質な単細胞懸濁液を得た。その後、ヘモサイトメーターで細胞を説明し、各ウェルに4ミリリットルの予熱媒体を備えた6ウェルプレートに1ウェルあたり1,000,000個の密度で播種します。翌日、合流度が90〜95%に達するために20〜24時間培養し、1ミリリットル当たり1ミリグラムの4マイクロリットルをウェルあたり1ミリグラムの4マイクロリットルを添加して細胞を刺激し、細胞とR848治療を受けずにコントロールを十分に残すことを確認する。プレートを左右に軽く揺らし、R848を均等に分散させ、摂氏37度と炭酸ガス5%で2~16時間インキュベートします。インキュベーション後、プレートから5ミリリットルの遠心分離チューブに細胞懸濁液を移します。細胞を200xgで5分間遠心し、その後上清を取り除き、PBSの1ミリリットルでペレットを再懸濁する。セル懸濁液を1.5ミリリットルチューブに移し、摂氏4度で30〜60秒間12,000 x gでスピンダウンし、上清を慎重に取り除きます。原稿の指示に従ってリシスバッファーを準備し、使用する準備ができるまで氷の上に保管します。細胞ペレットを氷冷リシスバッファーの30マイクロリットルに再懸濁し、ピペットを上下に混合します。その後、氷の上にチューブを15〜20分間インキュベートします。摂氏4度で12,000xgで15〜20分間遠心分離機でライセートを明確にし、上清を冷やした1.5ミリリットルチューブに移し、常に氷の上に抽出物を保持します。次に、ブラッドフォード試薬を用いてタンパク質濃度を測定する。原稿の指示に従って上下の室内電気泳動バッファーを準備し、3〜12%天然PAGEゲルを水で十分に洗い流し、井戸を歪めることなく、デオキシコール酸ナトリウムを取り扱う際に特別な注意を払う必要があります。薬品の取り扱いには、ラボコート、安全ゴーグル、マスクなどの保護用PPEが必要です。その後、ゲルをミニゲルタンクにセットし、くしを取り除き、準備した上下室内電気泳動バッファーを追加し、摂氏4度の冷たい部屋または氷の上で30分間事前に実行します。一方、氷上の細胞タンパク質を4Xネイティブサンプルバッファーと混合して、サンプルをロードできるように準備します。プレランが完了したら、各ウェルに10〜15マイクログラムのタンパク質をロードし、85ボルトで30分間ゲルを実行し、続いて150ボルトで2時間実行します。次に、ゲルをSDS走行バッファーに室温で30分間浸します。ポリビニリデンジフルオリド膜をメタノールに約5分間浸して活性化します。膜の片隅に切り取って向きを示し、製造業者のプロトコルに従って転写サンドイッチを組み立てます。転写カセットをタンクに入れ、氷の上で1時間20ボルトで移します。その後、プラスチック製鉗子でカセットから膜を取り出し、ロッキングシェーカーで45分間室温でブロッキングバッファ内の膜をブロックします。次に、一次抗体を摂氏4度または室温で2時間インキュベートし、揺れながら1XTBST洗浄バッファーで3分間洗浄します。次に、室温で1XTBST洗浄バッファーを使用して再び二次抗体で膜をインキュベートし、洗浄を繰り返す。次に、適切なゲルドキュメンテーションシステムを使用してブロットをスキャンします。このプロトコルを用いて、R848で刺激または非刺激を受けたCAL-1細胞を免疫ブロットで分析した。非刺激型CAL-1細胞において、IRF5は、その単量体形態に対応するネイティブPAGE上で単一のバンドとして検出された。刺激を受けた細胞の場合、IRF5モノマーのレベルは低下し、一方でダイマーのレベルは増加した。抗IRF5抗体を有するイムノブロットを、様々な構成体にトランスフェクトした293T細胞を過剰発現させるIRF5上で行った。未感染制御ではIRF5は検出されず、抗IRF5抗体の特異性を示した。単量体IRF5に対応する単一のバンドは、IRF5を過剰発現する293 T細胞でのみ検出された。IRF5活性化タンパク質をコードする構築物が共入化した際に、IRF5の二量体形態に対応するゆっくりと移動するバンドが現れた。しかし、I-Iに関連するタンパク質であるNMDA5は、IRF5二量体化を誘導しなかった。Bis-Trisの勾配ゲルの使用は、IRF5の単量体および二量体形態の分離を可能にしたこのゲル電気泳動系の特定のpHおよび化学組成のために、非常に重要である。また、非変性天然サンプルバッファー内の細胞ライセートをリジングおよび保存することは、天然のタンパク質構造を保持します。ここでは、ネイティブのPAGE酸に合わせた市販のものを使用しました。これと大いに補完する追加の方法は、ImageStreamイメージングフローサイトメトリーシステムを利用してIRF5核転座を評価する、二量体化後のIRF5活性化中の物質である。プロトコルと組み合わせると、IRF5のアクティベーションに関連するステップを検証する他の種類のテストとして機能します。炎症反応の重要な調節因子であるIRF5は、感染および免疫、自己免疫疾患、癌、および人間の健康にとって重要な他の多くの疾患において重要な役割を果たしている。IRF5および関連する転写因子を標的とする治療薬の開発にも取り組みがあります。このプロトコルは、多様な分野の研究者がIRF5生物学を理解し、調査することを可能にします。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

定量的な、高スループット、リアルタイム、及びSiO上にラベルフリー生体分子の検出（DNA、タンパク質など）...

干渉反射イメージングセンサー（IRIS）を用いた生体分子の検出

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タンパク質間相互作用を研究するための抗エピトープタグアフィニティーゲルによる免疫沈降(英語)

学ぶ 内因性IRF5ダイメレーションのネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動免疫ブロット解析。CAL-1細胞を用いたこの手法は、IRF5活性化の評価と免疫応答メカニズムの解明に有用です。

内因性IRF5ダイメネレーションのネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動免疫ブロット解析

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