Name: ユビキチンおよびユビキチン様依存性翻訳後修飾のプロファイリングと有意な変化の同定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: 学ぶユビキチンおよびユビキチン様翻訳後修飾のプロファイリング手法。レンチウイルスを用いた安定細胞株構築とデュアルタグ精製により、疾患関連の修飾変化を同定し、診断・予後バイオマーカー探索に応用できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、HVとMSにラ・リーグ・コントル・ル・ガン、ARC(協会はPS、INCa(国立デュガン研究所)とJIへのガノポールPACAに対して支援されました。IBISA(インフラ生物学サンテ・エ・アグロノミー)が支援するマルセイユ・プロテオミクス(marseille-proteomique.univ-amu.fr)、プレートフォルム・テクノロジー・エクス=マルセイユ、カンセロポールPACA、プロヴァンス=アルプ=コート・ダジュールレギオン、パオリ・カルメッテス美術館、レシェルシュ・アン・カンセロロジー・ド・マルセイユ美術館。

1. 6His-Flag-Ublを発現する安定細胞株の生成
注:pCCL-6HF-Ubl、pVSVGおよびデルタヘルパーを用いたHEK-293T細胞の共トランスフェクション。
<ol><li>0日目:6ウェルプレート中の種子293T細胞は、翌日に50〜70%の合流を得た。</li>
	<li>1日目:pCCL-6HF-UblまたはpCCL-GFPの1μg、pVSVGの1μgおよびデルタヘルパーベクターの1μgを組み合わせた50〜70%のコンフルエントセルを、レンチウイルス製造のためのトランスフェクション試薬およびプロトコルを使用する。トランスフェクションの6時間後、培地を形質転換する細胞に対応する新鮮なものに変える。6ウェルプレートに形質導入される細胞を播種し、翌日(転起開始日)に10〜20%の合流を得た。</li>
	<li>2日目:トランスフェクション後24時間、レンチウイルス粒子を含む培地を回収し、0.45μmフィルターを用いてフィルターをろ過する。必要に応じて、この時点で新鮮な培地を追加して、レンチウイルスの2番目のバッチを生成します。トランスフェクトされる細胞の培地(10~20%合流)をレンチウイルスを含むものに置き換えます。 注:レンチウイルス培地は、転移前に数日間+4°Cに保つか、または-80°Cで数ヶ月間保存することができます。</li>
	<li>標準インキュベーター(37°、5%CO2)で24時間~72時間の間にレンチウイルスを含む細胞をインキュベートし、新鮮な標準のものの培地を交換します。可能であれば、反転蛍光顕微鏡を用いてGFP発現をチェックし、伝達の効率を評価する:発現細胞の割合と細胞当たりの相対的な発現レベル。蛍光が検出されない場合は、形質転換される細胞の種類に応じて発現に時間がかかる場合があるため、さらに2〜3日待ちます。</li>
	<li>GFP対照が陽性の場合、抗Flag抗体を用いて免疫蛍光およびウェスタンブロットによる6HF-Ublの発現制御を行うのに十分な量を有するまで、すべての細胞を増殖させる。</li>
</ol>2. 修飾タンパク質の二重精製
注: バッファー 1: 6 M グアニジニウム HCl, 0.1 M Na2HPO4/NaH2PO4, pH 8.0, 0.5% トリトン X-100. バッファー 2: 50 mM NaH2PO4,150 mM NaCl, 1% Tween20, 5% グリセロール, pH 8.0. バッファ 3: 100 mM NH4HCO3, pH 8.0.
<ol><li>細胞リシス:準備ができたら、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を室温(RT)で少なくとも1回洗浄し、細胞リシスに進むか、または、液体N2でフラッシュ凍結し、-80°Cで保存する。リシスの場合は、RTで15cm皿あたり2mLのバッファー1を追加し、細胞スクレーパーを使用して50 mL円錐遠心管(最終体積約20mL)ですべてのリサートを回収します。</li>
	<li>1分間の休止で分離した30sのリサートを3回超音波処理します。</li>
	<li>超音波処理されたリザースを15分間15,000 x gで遠心分離します。</li>
	<li>細胞ストレーナー(40μm)を使用して新しいチューブに上清を移します。</li>
	<li>サンプルの濃度を決定し、必要に応じて調整して、同じ量のタンパク質と同じ体積を得ます。50~100mg(MiaPaCa-2細胞の直径15cmの10品)の間のタンパク質の総量を使用してください。</li>
	<li>タンパク質1mgあたり2μLのビーズを使用して、Ni2+-NTAビーズを追加します。</li>
	<li>RTで2.5時間の間に30 rpmで回転させます。</li>
	<li>5分間500×gでビーズをペレット。</li>
	<li>バッファー1の1 mLでビーズを洗浄し、サンプルを1.5 mLマイクロ遠心管に移し、氷上でチューブを移します。氷または4°Cですべての次のステップを実行します。</li>
	<li>10 mM イミダゾールを含む氷冷バッファー 2 の 1 mL で 2 回洗浄します。</li>
	<li>結合タンパク質を溶出するには、250 mM イミダゾールを含むバッファー 2 の 600 μL を追加し、4 °C で 2 時間回転します。</li>
	<li>500 x gで遠心分離してビーズをペレット化し、新しい予冷された 1.5 mL チューブに上清を移し、50 μL の抗フラグ M2 抗体コンジュゲートビーズを追加します。</li>
	<li>30 rpmで4°Cで2.5時間回転させ、バッファ2の500 μLで2回洗浄し、次いでバッファ3の500 μLで2回洗浄します。</li>
	<li>最終的な溶出には、0.1μg/μLのフラグペプチドを含むバッファ3を100μL加え、4°Cで1.5時間回転させます。</li>
	<li>500 x gで1分間遠心分離し、新しい予冷チューブに上清を移します。</li>
	<li>SDS-PAGEに10%(10°L)を取り、ゲルの銀染色を行い、精製品質を制御します。精製が良好に見える場合は、LC-MS/MSが残した90%を分析します。</li>
</ol>3. 質量分析データの処理により、Ub/Ubls PTM のプロファイルを生成し、それらの間の有意な相違点を特定する
注:MS分析の結果には、各サンプルで同定された各タンパク質の合計数のペプチドとピーク面積値(TOP 3ペプチド領域10の平均)を含む多くの情報が含まれています。これらのデータは、ペプチド数数またはピーク面積値、あるいはその両方を用いて処理することができる。ピーク面積を使用した計算では、これらの値は通常106の範囲にあるため、以下と同じ式を適用する前に、この順序で除算する必要があります。カウントの両方の方法論で得られた結果は、通常と同様に強い相関関係を示す必要があります。同定されたタンパク質ごとに、次の式を使用します。 非処理<img src="/files/ftp_upload/60402/60402eq1.jpg">ユビキチン試料中のv1ペプチド値(例えば、Ub - 薬物) ゲム<img src="/files/ftp_upload/60402/60402eq1.jpg">シタビン処理ユビキチン試料中のv2ペプチド値(例えば、Ub+薬物) 非処理<img src="/files/ftp_upload/60402/60402eq1.jpg">対照GFP試料中のk1ペプチド値(例えば、GFP - 薬物) ゲム<img src="/files/ftp_upload/60402/60402eq1.jpg">シタビン処理コントロールGFP試料中のk2ペプチド値(例えば、GFP+薬物)。
<ol><li>正規化: 次の式を使用して、ユビキチンと GFP の薬物処理細胞と未処理細胞の間の値を正規化します。正規化 v = V および正規化された k = K. V1=v1.(≥v1+ ≥v2) / (2. v1) ;V2=v2.(≥v1+ ≥v2) / (2. ≥v2) K1=k1.(≥k1+ ≥k2) / (2. ≥k1) ;K2=k2.(≥k1+ ≥k2) / (2.</li>
	<li>背景の除去:次の式を使用して、ユビキチンサンプルの値から対照サンプル(GFP)の値を減算し、両方の条件で同定されたタンパク質ごとに特定の値(V'1およびV'2)を得る。 V'1=V1-K1 の場合 V1-K1≥0;V'1=0 (V1-K1&lt;0 の場合) V'2=V2-K2 の場合 V2-K2≥0;V'2 =0 の場合 V2-Lt;0</li>
	<li>ユビキチンの変動(Var)。薬物によって誘導されるPTMの正と負の変動のスコア(-100と+100の間)を得るために、処理されたサンプルと未処理サンプルの特定の値の差を、以下のものを含むすべての値の合計で除算する次の式を使用します。制御(コントロールGFPでも同定されたタンパク質を罰する)を、100を掛ける。 Var = (V'2-V'1)/(V1+K1+V2+K2)*100 ;-100<var>-50 (PTM の抑圧) または 50 を超えるバリエーション (PTM の誘導) は、通常、有意と見なされます。</var></li>
	<li>自信(Conf)。0 ~ 100% の信頼度値を取得するには、次の式を使用します。 Conf = ((V1+V2)2/(1+V1+V2+K1+K2)2(*100 - 100/(1+V'1+V'2) ;値 0 (&lt;0) 50 を超える値は、通常、自信を持っていると見なされます。</li>
	<li>誘導/抑圧値のより良い分布を取得し、変動パラメータと信頼パラメータの両方を考慮するには、V <img src="/files/ftp_upload/60402/60402eq1.jpg"> VarとC <img src="/files/ftp_upload/60402/60402eq1.jpg"> Confの次の式を使用してVarとConfの値を乗算します。 =SI(V2&gt;0;((V2*C2)^2)/(10^6);-(V2*C2)^2)/(10^6)) 注:ピーク面積の値は通常、ペプチドカウントよりも正確であるため、ペルセウス(https://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus)のようなこの種のデータの解釈に特化した特定のソフトウェアを使用することが可能です。使用の推奨事項。</li>
</ol>

<ol><li>Prabakaran, S., Lippens, G., Steen, H., Gunawardena, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modification%3A+Nature%27s+escape+from+genetic+imprisonment+and+the+basis+for+dynamic+information+encoding%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Systems+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Post-translational modification: Nature's escape from genetic imprisonment and the basis for dynamic information encoding.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. , (2012).</li>
<li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+function+of+ubiquitin-like+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Origin and function of ubiquitin-like proteins.</a> Nature. 458 (7237), 422-429 (2009).</li>
<li>Kirkpatrick, D. S., Weldon, S. F., Tsaprailis, G., Liebler, D. C., Gandolfi, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+identification+of+ubiquitinated+proteins+from+human+cells+expressing+His-tagged+ubiquitin%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic identification of ubiquitinated proteins from human cells expressing His-tagged ubiquitin.</a> Proteomics. 5 (8), 2104-2111 (2005).</li>
<li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteomics+approach+to+understanding+protein+ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A proteomics approach to understanding protein ubiquitination.</a> Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).</li>
<li>Matsumoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+analysis+of+the+human+ubiquitin-related+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Large-scale analysis of the human ubiquitin-related proteome.</a> Proteomics. 5 (16), 4145-4151 (2005).</li>
<li>Hjerpe, R., Rodríguez, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+approaches+for+characterizing+ubiquitinated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Efficient approaches for characterizing ubiquitinated proteins.</a> Biochemical Society Transactions. 36 (5), 823-827 (2008).</li>
<li>Bonacci, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+new+mechanisms+of+cellular+response+to+chemotherapy+by+tracking+changes+in+post-translational+modifications+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of new mechanisms of cellular response to chemotherapy by tracking changes in post-translational modifications by ubiquitin and ubiquitin-like proteins.</a> Journal of Proteome Research. 13 (5), 2478-2494 (2014).</li>
<li>Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-like+protein+conjugation+and+the+ubiquitin-proteasome+system+as+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (1), 29-46 (2011).</li>
<li>Hoeller, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+ubiquitin+system+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeting the ubiquitin system in cancer therapy.</a> Nature. 458 (7237), 438-444 (2009).</li>
<li>Silva, J. C., Gorenstein, M. V., Li, G. Z. Z., Vissers, J. P. C., Geromanos, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+of+proteins+by+LCMSE%3A+a+virtue+of+parallel+MS+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification of proteins by LCMSE: a virtue of parallel MS acquisition.</a> Molecular & Cellular Proteomics. , (2006).</li>
<li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li>
</ol>

著者たちは何も開示する必要はない。

私たちは、主要なユビキチンファミリーメンバーによって修飾されたタンパク質のプロファイルを生成するための堅牢で信頼性の高い方法論を開発しました。実際、このプロトコルを適用して、ユビキチン、およびSUMOとNedd8によってPTMのプロファイルを生成し、特定の遺伝子の過剰発現またはノックダウンに応じて治療7に関連する変更を検出することに成功しました(データはそうではありません)示されている)、および多様な化学療法薬に対する耐性表現型を獲得した細胞において。
マニピュレータが注意する必要がある手順中の重要な手順はごくわずかです。ビーズ(Ni-NTAまたはアンチフラッグ結合)のピペットの場合、粘性グリセロールベースのバッファーに懸濁されているので、特にアンチフラグビーズを徹底的に再サスペンドし、先端の端部を少しカットしてセクションを増やすことが重要です。もう一つの予防措置は、ビーズの積み重ねを避けるためにゆっくりとピペットすることです。追加の重要なステップは、イミダゾールとフラグペプチドとの溶出です。きれいなハミルトン注射器は、非特異的タンパ...

ここで提案される方法は、特定の状態(治療、分化など)に関連する潜在的な変化を同定するために、培養哺乳動物細胞からユビキチンファミリーメンバーによって媒介されるPTMを研究することに専念している。PTMはタンパク質の機能の調節の最後のステップを表す 1.実際、一度翻訳機械によって製造されると、ほとんどのタンパク質は、その活性、分子相互作用、および細胞内位置1を調節する異なる種類のPTMを受けるわけではない。PTMの多くは、タンパク質のユビキチンファミリーによって媒介されるもの、ユビキチン自体およびすべてのユビキチン様、細胞内または部分的に細胞質タンパク質2を調節する可能性を有する。それらはそれ自体がタンパク質であるため、互いに共役することができ、多様なトポロジの均質および異種鎖を形成し、それぞれが特定の調節機能に関連する2。この複雑な機械を解読し、理解するためには、ツールが必要です。多くのアプローチは、独自の長所と短所を持って、世界中で開発され、ここでは培養細胞に適した高性能なものを提案します。
この方法の主な利点は、その精度です。実際、単離された修飾タンパク質の純度は、2つのタグ(6HisとFlag)と2つのステップ手順の組み合わせ使用によって高度に改善され、したがって、単一のタグ融合Ub/Ubl3、4よりもはるかに選択的である。6Hisタグの存在は、完全変性状態での精製の第一段階を可能にし、それによってユビキチン結合ドメインまたはユビキチン化されたものに結合する他のタンパク質を含むタンパク質の共精製を回避する。これは、特異的抗体5またはタンデムユビキチン結合要素(TUBEs)6のいずれかを用いたユビキチン化プロテオームの親和性精製に基づく他のいくつかのアプローチによって遭遇する技術的問題である。重要なことに、この技術は、モノおよび異なる種類の多言語の両方が7を同定したので、いくつかの他のアプローチの場合と同様に、特定のタイプのユビキチン化の精製を支持するバイアスではない。したがって、いったん発見されると、ユビキチン化の変化は、関連するユビキチン化の正確な種類を特定するために、標準的な生化学的アプローチによってより詳細に検討されなければなりません。
最後に、このプロトコルのもう一つの技術的な利点は、レンチウイルスの使用であり、それは容易かつ迅速に、正常な細胞挙動を妨げることなく、タグ付き修飾剤の妥当なレベルの発現を有する安定した発現細胞株を作成する。
ユビキチン化の重要な役割の1つはプロテアソーム分解のためのタンパク質を標的とすることであるのに対し、潜在的に最も細胞内または部分的に細胞内タンパク質1に対する他の多くの調節特性を有することが知られている。これらの機能の数は、タンパク質のような多くのユビキチンの存在によってさらに増強され、ほぼすべての細胞機構を調節するタンパク質のファミリーを形成する1.彼らの改変は、細胞生物学に大きな影響を与える可能性があり、癌9のような病理学的状況8を導いたり、参加したりすることができる。したがって、ツールは、この広大な風景を探索し、新しい治療目標として役立つことができる病理学的状態に関連する変化を識別するために必要とされます。
このプロトコルは、励起タグ付き Ub/Ubl を発現するために伝達する必要があるため、培養中の細胞専用です。これらの安定した細胞株を作成すると、2Dまたは3Dまたは異種移植片の培養物からUblプロファイルを生成し、PTMプロファイルの研究に適用できるさまざまな実験モデルの地平線を拡張することができます。

<table><tbody><tr><td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220-5ML</td><td>は、すべてのFlagタグ付きタンパク質に結合します</td></tr><tr><td>抗Flag M2抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3165</td><td>は、ub/ubl</td></tr><tr><td>細胞ストレーナー40 &microの6His-Flagタグ付き発現を検出します。グア</td><td>ニジン溶解細胞から浮遊ペレットを除去する</td><td>Falcon</td><td>352350</td></tr><tr><td>フラグペプチド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3290</td><td>アンチフラグビーズからタグ付きタンパク質を溶出</td></tr><tr><td>グアニジン塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50933</td><td>細胞溶解物中の全タンパク質を変性させるために使用されるカオトロピック剤</td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td>は<td>、Ni-NTAビーズから6His結合タンパク質を溶出します</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>ThermoFisher</td><td>L3000015</td><td>HEK-293T細胞をトランスフェクションしてレンチウイルスを産生</td></tr>します <tr><td>Lobindチューブ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z666491</td><td>は貴重な材料の吸収を回避します</td></tr><tr><td>メンブレンフィルター、0.45 & マイクロ;m</td><td>Millipore</td><td>HAWP04700F1</td> 6His タグの<td>レンチウイルス supernantant</td></tr><tr><td>Ni-NTA</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td>精製をろ過する</td></tr></tbody></table>

ユビキチンおよびユビキチン様依存性翻訳後修飾のプロファイリングと有意な変化の同定

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

ユビキチン(ub)およびユビキチン様(ubl)依存性タンパク質の翻訳後修飾は、タンパク質の安定性、活性、相互作用、および細胞内局在を制御することにより、細胞内の基本的な生物学的調節的役割を果たします。それらは細胞が信号に応答し、環境の変化に適応することを可能にする。これらのメカニズム内の変更は、神経変性疾患や癌などの深刻な病理学的状況につながることができます。ここで説明する技術の目的は、培養細胞株からub/ubls依存PTMプロファイルを迅速かつ正確に確立することです。異なる条件から得られた異なるプロファイルの比較は、例えば治療によって誘発されるような特定の変化の同定を可能にする。レンチウイルス媒介細胞伝達は、修飾剤(ユビキチンまたはSUMO1またはNedd8のようなubl)の2タグ(6HisおよびFlag)バージョンを発現する安定な細胞株を作成するために行われる。これらのタグは、ユビキチンの精製を可能にし、したがって、細胞からのユビキチン化タンパク質の。これは 2 段階の精製プロセスを通じて行われます: 最初の 1 つは 6His タグを使用して変性状態で実行され、2 番目のタグは Flag タグを使用してネイティブ状態で実行されます。これは、その後、液体クロマトグラフィーによって同定され、半定量され、タンデム質量分析(LC-MS/MS)技術が続く、非常に特異的かつ純粋な修飾タンパク質の単離につながります。Excelソフトウェアを使用したMSデータの容易な情報分析により、バックグラウンド信号を排除することでPTMプロファイルの確立が可能になります。これらのプロファイルは、標準的な生化学技術による検証から始めて、より具体的に研究される特定の変化を識別するために、各条件間で比較されます。

培養哺乳動物細胞の伝達は、GFPおよび6HF-Ub発現細胞を作成する MiaPaCa-2細胞をトランスデュースするために後で使用されるレンチウイルスを産生するために、70%コンフルエントHEK-293T細胞は、pCCL-6HF-ユビキチンまたはGFP/デルタヘルパー/pvSvGの3つのベクターの等量で共トランスフェクされる。24時間の製造後、レンチウイルス粒子を含む培地を回収し、濾過する。この時点で、反転顕微鏡で293T細胞を発現するGFPの緑色蛍光をチェックすることによりトランスフェクションの効率を制御することができる。これは、細胞の100%近くである必要があります。MiaPaCa-2細胞は、レンチウイルス上清を1〜3日間インキュベートする。レンチウイルス導入の有効性は、まずGFP形質細胞のGFP蛍光を見ることによって制御される(図1A上部パネル)。GFP発現量は細胞によって異なるが、その100%は蛍光でなければならない。この制御が完了す...

このプロトコルは、治療または表現型などの特定の状態に関連するこれらの種類の翻訳後修飾(PTM)の変化を同定するために、ユビキチン(Ub)およびユビキチン様(Ubls)特異的プロテオームを確立することを目的としています。

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

このプロトコルは、特定の同定されたタンパク質を同定し、半定量化することによってユビキチンおよびユビキチン様翻訳後修飾のプロファイルを生成する簡単な方法です。この技術の主な利点は、レンチウイルスを使用して1週間以内に安定した細胞発現ラインを作り出し、タンパク質を特異的に精製するための2つのタグを使用することです。実際、この種の翻訳後修飾はほとんどの生物学的機能に関与しており、このメカニズムの変化はほとんどの疾患に見られる。したがって、これらの変化を同定することは、予後および/または診断として、そしてもちろん分子標的として役立つかもしれない。ユビキチンは真核細胞の中で最も保存されたタンパク質の一つであり、その生存のために不可欠です。したがって、この種の方法は、哺乳類から酵母まで、あらゆる真核生物モデルに適用することができます。しかし、私たちのレンチウイルスシステムは細胞の研究に限定されています。全体の手順は、時には長い潜伏時間とかなり長いので、1の代わりに2日間にわたってそれを行うことができます。ニッケルビーズからの溶出は、マイナス20で、フラグビーズを追加する前に凍結することができます。このプロトコルには、精製の最終的な成功を保証するために重要なステップが多数含まれているため、翻訳後修飾プロファイルを正確に確立します。この手順のデモンストレーションは、ミルナ・スウェイデンとアウレリー・ドブリック(研究室の博士課程の2人の学生)によって行われます。まず、播種するDMEMのウェルあたり2ミリリットルの6ウェルプレートにHEK 293T細胞の6番目に0.5倍の10を加え、摂氏37度、炭酸ガス5%、湿度100%でインキュベートします。翌日、50~70%合流が達成される。pCCL-6HFユビキチン様またはpCCL-GFPの1マイクログラム、PBS VGの1マイクログラム、レンチウイルス産生のためのトランスフェクション試薬とプロトコルを使用したデルタヘルパーベクターの1マイクログラムを組み合わせて細胞をコトランスフェクトする。トランスフェクションの6時間後、トランスフェックされる細胞の培地に対応する新鮮なものに培地を変更する。その翌日に10~20%の合流を得るために、標準的な培養培地を用いて6ウェルプレートに導入する細胞をシードします。トランスフェクションの24時間後、レンチウイルス粒子を含む培地を回収し、0.45ミクロンフィルターを用いて濾過する。レンチウイルスを含む濾過培地によって導入される細胞の培地を交換する。レンチウイルスを含む細胞を摂氏37度と5%の二酸化炭素のインキュベーターで24〜72時間インキュベートし、新鮮で標準的な1つで培地を交換します。反転蛍光顕微鏡を用いてGFPの発現をチェックし、トランスダクションの効率を評価します。蛍光が検出されない場合は、さらに2〜3日待ちます。GFPコントロールが緑色蛍光で陽性の場合、ここに示すように、免疫蛍光による6-His-FLAGユビキチン様の発現制御を行うのに十分になるまで全ての細胞を増殖させ、抗FLAG抗体を用いてウェスタンブロットを使用する。15センチメートルの皿で細胞を成長させた後、リン酸緩衝生理食塩水で培養皿を室温で少なくとも1回洗う。細胞のリシスを開始するには、室温で各15センチメートル皿にバッファー1の2ミリリットルを追加します。セルスクレーパーを使用して、すべてのライセートを50ミリリットル円錐形遠心分離管に回収します。ライステイトを30秒間3回超音波処理し、1分間の休止で区切ります。15,000回gで超音波処理されたライセートを15分間遠心分離する。40ミクロンの細胞ストレーナーを介して新しいチューブに上清を移します。超音波処理と遠心分離後にライセートをフィルタリングすることは非常に重要です。これを行わない場合、多くの非特異的タンパク質の共精製が行われ、それによってバックグラウンドが増加し、PTMプロファイルのサイズが大きく低下する可能性があります。新しいファルコンチューブに50と100ミリグラムの間のタンパク質の同量を転送します。各チューブに、1ミリグラムのタンパク質につき2マイクロリットルのビーズの量でニッケルイオンNTAビーズを加えます。チューブを回転器の上に置き、室温で2時間半回転させます。その後、5分間500回gでビーズをペレット化する。1ミリリットルのバッファー1でビーズを洗い、サンプルを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移します。チューブを氷の上に置きます。10ミリモルルイミダゾールを含む氷冷緩衝液2の1ミリリットルで2回洗浄します。タンパク質を溶出させるには、250ミリモルイミダゾールを含むバッファ2の600マイクロリットルを加え、摂氏4度で2時間回転させます。500回gで1分間遠心分離してビーズをペレット化した後、上清を新しい予め冷却した1.5ミリリットルチューブに移し、抗FLAG M2抗体共役ビーズを50マイクロリットル加えます。摂氏4度で2時間半30rpmで回転させます。その後、バッファー2の500マイクロリットルで2回洗浄し、その後、バッファー3の500マイクロリットルで2回洗浄します。最終的な溶出のために、1マイクロリットル当たり0.01マイクログラムでFLAGペプチドを含むバッファ3の100マイクロリットルを加え、1 1/2時間摂氏4度で回転させる。500回gで1分間遠心した後、上清を新しい予冷チューブに移します。SDS-PAGEにロードするために10マイクロリットルを取り、精製品質を制御するためにゲルの銀染色を行います。精製が良く見える場合は、LC-MSが残した90%を分析してください。正規化を実行するには、ユビキチンと GFP の薬物処理細胞と未処理の細胞の間の値を正規化する式を使用します。背景を除去するために、ユビキチンサンプル中の値からコントロールサンプルGFPの値を減算し、両方の条件で同定された各タンパク質に対して特定の値を得た。ユビキチン化の変動を得るために、薬物によって誘発されるPTMの正および負の変動に対してマイナス100と100の間のスコアを得る。処理されたサンプルと未処理サンプルの特定の値の差は、コントロール内の値を含むすべての値の合計で除算され、100 を掛けます。PTMの抑制を表すマイナス50以下の変動、またはPTMの誘導を表す50以上は有意であると考えられる。この数式を使用して、50 を超える 0 ~ 100%の値の間の信頼値を得る場合は、通常、信頼できると見なされます。誘導値と抑圧値のより良い分布を得るために、および変動と信頼度の両方のパラメータを考慮するには、この式を使用して分散値と信頼度値を乗算します。本研究では、哺乳動物細胞の培養細胞の導入が達成され、GFPおよび6-ヒスチジンFLAGユビキチン発現細胞を作成した。レンチウイルス導入の有効性は、GFP導入細胞のGFP蛍光を見て最初に制御された。FLAG-ユビキチンの発現は、トランスデューシングされた細胞の割合を示す抗FLAG抗体を用いた免疫蛍光染色法によって行われた。外因性FLAG-ユビキチンの発現量を制御するために、トランスデューセ細胞からのライセートをSDS-PAGEによって分析し、続いて抗FLAG抗体を用いてウェスタンブロットを分析した。ユビキチン化タンパク質の精製後、最終溶出の10%を使用して、ゲルのSDS-PAGEおよび銀染色による精製物質の量および完全性を制御した。バックグラウンドGFPサンプル減算は、50%を超えるスコアで有意にユビキチン化された364個のタンパク質を同定し、これらのユビキチン化タンパク質の遺伝子セット濃縮分析を行い、それらが関与した生物学的プロセスを強調するために行った。ジェムシタビン誘発性ユビキチン化による潜在的相互作用ネットワーク。これは、関与するタンパク質のユビキチン化の増加または減少によって強く影響を受ける機能的相互作用ネットワークの同定につながった。また、ゲムシタビン治療後にPCNAのユビキチン化が増加することも確認された。両方の溶出ステップの後に、背景の大幅な増加をもたらす可能性があるため、いくつかのビーズの転送を避けることは非常に重要です。この手順では、異なる条件を比較することによって、特定の変更の識別を可能にする特定の翻訳後の変更を生成します。最初の次のステップは、少なくとも生化学的アプローチに基づいて関心の変化を検証する。膵臓がん細胞の新しい方法とメカニズムを特定するために、ユビキチンベースの翻訳後修飾を探求するこの方法を開発しました。このプロトコルやその他の世界的に開発されて以来、異なる生物学的プロセスを解読するためにうまく採用されてきました。レンチウイルスは、少なくともBL-2実験室で使用されなければならない。グアニジンは強力な変性剤であり、慎重に使用する必要があります。超音波処理器はまた耳に有害であり、次の推奨事項を使用する必要があります。

profiling-ubiquitin-ubiquitin-like-dependent-post-translational

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

ユビキチン化は、3つの酵素のセットによって行わキー翻訳後修飾である。この変更に関与する遺伝子の変異が様々なヒト疾患に関連付けられています。ここで、我々は培養細胞でのタンパク質のユビキチン化を検出するためのプロトコルを説明...

タンパク質のユビキチン化の検出

現在のプロトコルは、機能的に相同脱ユビキチン化酵素の活性を測定する方法を詳述します。特殊なプローブは、共有結合酵素を変更し、検出を可能にします。この方法は、新たな治療標的を同定する可能性を保持しています。...

細胞株および組織試料中の脱ユビキチン化酵素の活性を測定する方法

複数の調査、ターゲット蛋白質の翻訳後修飾を内因性は非常に挑戦的なすることができます。ここで説明したテクニックを活用開発特定 PTM ターゲットでターゲットのアセチル化、ユビキチン化、sumo 化 2/3、およびチロシンのリン酸化の変更を検出する親和性のマトリックス最適化された換散バッファーとフィルター システム1...

標的タンパク質の翻訳後修飾の内因性プロファイルを識別するために包括的な免疫沈降濃縮システムを活用

複雑な生体試料から生じるユビキチン化タンパク質を起源とするdiGlyペプチドの精製、検出、同定方法を紹介します。提示された方法は、ユビキチノメ分析の深さのレベルに関して、再現性、堅牢性、および優れたメソッドを上回る。...

ペプチド濃縮と質量分析によるタンパク質ユビキチン化部位の検出

ユビキチン化は、細胞プロセスで重要な役割を果たし、デュビキチン化によって緊密に調整される翻訳後修飾です。両方の反応の欠陥は、人間の病理の下にある。精製成分を用いてインビトロでユビキチン化・デュビキチン化反応を行うためのプロトコルを提供します。...

ヌクレオソームヒストンのインビトロユビキチン化とデュービキチン化アッセイ

この方法はユビキチン鎖トポロジーにおけるグローバルな変化の評価を記述する。この評価は、質量分析法に基づく標的プロテオミクスアプローチの適用によって行われます。...

並列反応モニタリングによるユビキチン連鎖解析

このワークフローは、定量的なグローバルプロテオーム分析のために、複数のタンパク質翻訳後修飾(PTM)を同時に時間効率とコスト効率の高い濃縮のパフォーマンスを説明します。このプロトコルは、ペプチドレベルPTM濃縮を複数の結合抗体で利用し、続いてデータ非依存の獲得質量分析を行い、PTMクロストークに関する生物学的洞察を得る。...

定量化とサイトローカリゼーションのための2つの翻訳後修飾の同時アフィニティエンリッチメント

我々は、哺乳動物細胞における特定の基質およびE3ユビキチンリガーゼのユビキチル化アッセイのための詳細なプロトコルを提供する。HEK293T細胞株をタンパク質過剰発現に使用し、ポリユビキチル化基質を免疫沈降によって細胞溶解物から精製し、SDS−PAGEで分解した。イムノブロッティングを用いて、この翻訳後修飾を可視化した。...

哺乳動物細胞溶解物におけるE3ユビキチンリガーゼによる基質ユビキチル化の評価

本プロトコルは、トポイソメラーゼ阻害剤およびホルムアルデヒドによって誘導されるユビキチン化、SUMO化、およびADPリボシル化を含む、DNA-タンパク質架橋(DPC)およびそれらの翻訳後修飾(PTM)を検出および定量するための改変方法を強調し、それによってDPCおよびそのPTMの形成および修復の研究を可能にする。...

DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

ここで使用した実験は、分子ドッキングとプローブ技術を組み合わせて、伝統的な漢方薬の低分子とタンパク質標的との間の相互作用を予測および検証する方法を示しています。...

分子ドッキングおよび脱ユビキチン化酵素プローブ技術に基づくUCHL3活性阻害のための漢方薬化合物のスクリーニング

ユビキチン化は細胞内タンパク質機能の重要な調節因子です。ここでは、哺乳類細胞における基質タンパク質のユビキチン化レベルを検出するための2つの細胞溶解法を説明し、それらのユビキチン化レベルの解析効果を比較します。HEK293T細胞内のタンパク質過剰発現は一時的なトランスフェクションによって誘導され、ウビキチン化タンパク質はウェスタンブロット解析によって検出されました。...

SMAD2/SMURF2をモデルとした哺乳類細胞溶解液におけるユビキチン検出の比較戦略

学ぶユビキチンおよびユビキチン様翻訳後修飾のプロファイリング手法。レンチウイルスを用いた安定細胞株構築とデュアルタグ精製により、疾患関連の修飾変化を同定し、診断・予後バイオマーカー探索に応用できます。

ユビキチンおよびユビキチン様依存性翻訳後修飾のプロファイリングと有意な変化の同定

さらに動画を探す