Name: 核/細胞質タンパク質の密売を監視する原発性慢性リンパ球性白血病細胞の細胞分画 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: 学ぶ原発性慢性リンパ球性白血病細胞の核・細胞質分画法。タンパク質の局在と輸送を解析し、治療効果を評価するための迅速かつ効率的な手法を習得できます。

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著者たちは、原稿を批判的に見直してくれたナターシャ・マリク博士に感謝したいと思います。この研究は、AMM(18003)に授与されたブラッドワイズプロジェクト助成金によって資金提供されました。FACS分析施設は、ハウアット財団が資金を提供しました。MWMはポール・オゴーマン白血病研究センターのフレンズから博士課程の学生によって資金提供され、JCはポール・オゴーマン白血病研究センターのフレンズから資金提供を受け、JHはブラッドワイズプロジェクト助成金(18003)によって資金提供されました。

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</ol>

著者は何も開示していない。

記載されたプロトコルは、一次CLL細胞からの核および細胞質画分の生成のための迅速かつ効率的な方法を提供し、その後の細胞刺激時の核と細胞質分画の間のタンパク質の結合の定量化そして薬物治療。提示されたデータは、Fを介したBCR架橋の有無において、二重mTOR阻害剤AZD8055を用いた治療時に、核分画と細胞質画分の間の特定のタンパク質の人身売買を検出する能力を示しています。ab')2フラグメント刺激(図3および図4)。これらの実験を個々のCLL患者サンプルからウェスタンブロットの定量化と結合することで、生成されたデータの客観的な分析を可能にし、タンパク質局在化における世界的な変化を定量化するために記載されたアッセイの堅牢性を実証する患者コホートから単離されたCLL細胞(図4)。細胞質画分の平均5つの患者サンプルがほぼ有意に達していることはデータから明らかである。CLL患者11の臨床的不均一性を考えると、これらの分析は通常、より大きな患者コホートで行われ、CLLの細胞応答のより完全な理解を得るために患者の特定の予後サブグループに焦点を当てた。特定の薬物治療に細胞。
提示されたデータは、分画の純度がこれらのマーカーによって確認されるにつれて、細胞質分画または核画分のいずれに排他的に存在するタンパク質マーカーを選択することの重要性を示す。β-チューブリンは細胞質画分確認に選ばれ、ラミンA/Cは核マーカーとして選ばれた。一般的に使用される追加のタンパク質は、細胞質画分またはBrg1(SMARCA4)、TFIIDおよびRNAポリメラーゼIIの核画分純度4、5を同定するためにGAPDHおよびα-チューブリンである。しかし、特定の画分で非常に濃縮されたタンパク質を選択する際には注意が必要であり、両方の画分(例えば、γ-tubulin)に存在しない(図2C)9。実際、GAPDHおよびアクチンは、一般的に細胞質タンパク質であると考えられているが、核12、13に局所化することができ、刺激または治療時に再配置しない分画マーカーを選択することの重要性を強調し、セルに適用されます。さらに、選択したタンパク質マーカーが細胞内画分画と共にWCLを実行することによって目的の細胞内で発現していることを確認することが重要である。
示した代表的な実験では、各条件(刺激/薬物治療)に同数のCLL細胞を用い、その後、分画試料を直ちに調製した。分画タンパク質/レーンの10 μgをロードすると、目的のタンパク質を検出するのに十分な材料が提供されます。これらのサンプルは、短期的な薬物治療と刺激(最大4時間)しか受けていないため、タンパク質レベルは各試料で同じままであり、タンパク質アッセイは行われなかった。しかし、細胞治療が延長された場合(18~72時間)、細胞内の細胞死または増殖のレベルは、適用される薬物/細胞刺激に依存して抽出されたタンパク質の質と量を著しく変化させ、治療中のタンパク質レベルを変化させる可能性がある。/刺激されたサンプル。これらの長期的な薬物治療の場合、ブラッドフォードアッセイまたは同等のタンパク質定量を用いて、ウェスタンブロッティングの前に、同じ量のタンパク質が免疫ブロットの各レーンで実行されることを確実にすることをお勧めします。洗剤の存在は、特定のタンパク質アッセイ14に干渉し得るが、この干渉は細胞分画タンパク質サンプルを希釈することによって低減することができる。さらに、完全なリシスバッファーをブランクとして使用し、試験対象のサンプルと同じ希釈を使用します。
ここで説明する知見の裏付けとなる証拠を提供するために、蛍光顕微鏡を用いて並列実験を行い、CLL細胞内のFOXO1の位置を解析し、これらの知見の可視化を可能にした5.さらに、生成された細胞下画分は、さらに下流分析における酵素活性アッセイまたはプロテオミクス分析にも使用することができる。

核と細胞質の間の高分子の輸送は、長い間、正常な細胞機能において重要な役割を果たすことが確立されており、癌細胞1、2でしばしば調節解除される。このような規制緩和は、核輸出を制御するタンパク質の過剰発現/突然変異に起因する可能性があります。そのようなタンパク質Exportin-1(XPO1)の1つは、核2から細胞質に>200核輸出シグナル(NES)含有タンパク質を輸出する輸送受容体である。XPO1貨物は、p53、FOXO家族およびIBを含み、作用1、2、3のそれらのメカニズムを阻害することによってそれらの不活性化に寄与する。さらにタンパク質の誤局性は、微小環境シグナルが癌細胞に影響を与える場合に起こり得る、ホスファチジル-イノシトール-3-キナーゼ(PI3K)/Akt経路などの細胞内シグナル伝達経路の活性化につながり、FOXOファミリーメンバーの不活性化と核4、5からのその後のエクスポート。このような腫瘍抑制タンパク質の誤局化は、多数の血液学的および固形腫瘍1,2,6の進行に関与している。
XPO1機能に結合し選択的に阻害する血液性悪性悪性腫瘍(急性骨髄性白血病(AML)/CLL)における臨床用低分子阻害性阻害薬の開発は、核と細胞質のコンパートメント間のタンパク質のシャトルに対する薬理学的薬剤の影響6,7,8.イメージング技術は、薬物治療の外部刺激時に細胞内のタンパク質の同定を有意に可能にするが、堅牢で支持的な並列技術の重要性は、確実に重要である。結果の妥当性を科学的な聴衆に知らせる。
患者の血液サンプルから単離された安静リンパ球および悪性CLL-B細胞は、高い核による核および細胞質画分の生成における課題を表す:細胞質比。堅牢で信頼性の高い実験データを生成するための実験条件の最適化は、将来の実験プログラムを計画するためにはもちろん重要です。ここで説明する方法は、核および細胞質画分におけるタンパク質の定量を可能にし、これらのタンパク質が細胞刺激および/または薬物治療によってどのように影響を受けるかを決定する。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL微量遠心チューブ</td><td>Griener Bio one</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>3 mLパスツールピペット</td><td>Griener Bio one</td><td>612398</td><td></td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm FACS Tubes</td><td>Elkay</td><td>2052-004</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tube</td><td>Griener Bio one</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tube</td><td>Griener Bio one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD5 FITC antibody</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>555352</td><td>表現型表面マーカー</td></tr><tr><td>抗CD19 PE Cy7抗体</td><td>BD バイオサイエンス557835</td><td></td><td>表現型表面マーカー</td></tr><tr><td>抗CD23 APC抗体</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>558690</td><td>表現型表面マーカー</td></tr><tr><td>抗CD45 APC Cy7抗体</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>557833</td><td>表現型表面マーカー</td></tr><tr><td>抗β-チューブリン抗体</td><td>細胞Signaling</td><td>2146</td><td>cytoplasmic marker</td></tr><tr><td>anti-&gamma;-Tubulin Mouse antibody (clone GTU-88)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5326</td><td></td></tr><tr><td>anti-FoxO1 (C29H4) Rabbit antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>2880</td><td></td></tr><tr><td>anti-Lamin A/C antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>2032</td><td>nuclear marker</td></tr><tr><td>anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>7076</td><td>二次抗体</td></tr><tr><td>抗ウサギ IgG, HRP結合抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>7074</td><td>二次抗体</td></tr><tr><td>抗Rpb1 CTD抗体(クローン4H8)</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>2629</td><td>核マーカー</td></tr><tr><td>BDFACS Canto II</td><td>BD Biosciences</td><td>By Request</td><td>Flow Cytometer</td></tr><tr><td>DAPIソリューション</td><td>BD Biosciences</td><td>564907</td><td>Live/Dead discriminator</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Σ</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Σ</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 6</td><td>GraphPad ソフトウェア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェア Histopaque1077 密度勾配培地</td><td>Σ</td><td>H8889</td><td></td></tr><tr><td>HyperPAGE 10 - 190 kDa タンパク質マーカー</td><td>バイオライン</td><td>BIO-33066</td><td>分子ウェイトマーカー</td></tr><tr><td>Image Studio Lite (version 5.2.5)</td><td>LI-COR</td><td>www.licor.com</td><td>Software</td></tr><tr><td>Labnet VX100</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Vortex</td></tr><tr><td>Nucelar Extract Kit</td><td>Active Motif</td><td>40010</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads</td><td>Thermofisher</td><td>01-111-42</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Thermofisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Plus 染色済みタンパク質ラダー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>26619</td><td>分子量マーカー</td></tr><tr><td>PBS錠</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BR0014G</td><td></td></tr><tr><td>ロゼットSep ヒト B 細胞濃縮カクテル</td><td>幹細胞技術</td><td>15064</td><td></td></tr><tr><td>シグマ 3-16P</td><td>SciQuip</td><td></td><td>遠心分離機</td></tr><tr><td>シグマ 1-15PK</td><td>SciQuip</td><td></td><td>遠心分離機</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr></tbody></table>

核/細胞質タンパク質の密売を監視する原発性慢性リンパ球性白血病細胞の細胞分画

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

高分子の核輸出は、がん細胞でしばしば規制解除される。p53のような腫瘍抑制タンパク質は、その作用機序を破壊する異常な細胞局在化のために非アクティブにすることができる。慢性リンパ球性白血病(CLL)細胞の生存は、他の癌細胞の中でも、細胞質シャトルへの核の自由化によって支援され、少なくとも部分的には輸送受容体XPO1の規制緩和および構成的活性化を通じてPI3K媒介シグナリング経路。疾患の病態生物学におけるそのようなタンパク質の役割をより深く理解するためには、細胞内位置の文脈における個々のタンパク質の役割を理解することが不可欠である。さらに、細胞刺激の根には、細胞内タンパク質の密売の文脈において、細胞刺激および特定の薬理学的阻害剤の作用機序の下にあるプロセスを同定することは、そのメカニズムのより包括的な理解を提供する。アクション。ここで説明するプロトコルは、原発性慢性リンパ球性白血病細胞からの核および細胞質画分の最適化およびその後の効率的な生成を可能にする。これらの画分は、細胞刺激および薬物治療における核と細胞質画分の間のタンパク質取引の変化を決定するために使用することができる。データは、免疫蛍光画像と並行して定量化および提示できるため、堅牢で定量化可能なデータを提供できます。

一次CLL細胞の実験を計画する際、アッセイに多数の細胞(&gt;50 x 106細胞)が必要な場合、解凍を必要とする凍結保存細胞ではなく、新たに単離されたCLL細胞を使用する必要がありますが、これは必ずしもそうではありません。可能。これは、凍結/解凍プロセスにより、CLL細胞の最大50%が死亡する可能性があるためです。ここに記載されている密度遠心分離を用いてWCC&gt;40 x 106/mLを用いてCLL細胞を濃縮することで、高純度(≥95%)で高い細胞回収が可能プライマリ CLL セルの。示されたサンプルでは、WCC=177 x 106/mL:30mL血液試料5x109細胞から回収し、これは全細胞の94%の細胞収率を表す。フローサイトメトリーによるこのサンプルの分析は、FSC/SSC上でゲーティングした後のCLL細胞マーカーCD19とCD5の二重表面発現によって示される&gt;95%のCLL細胞の純度を明らかにした、DAPI陰性(生存細胞)であった単一細胞(図1)。
細胞質分画の最適化手順は、細胞質画分率の調製中に洗剤比の範囲(1:20~1:60)を用いて行った(ステップ3.4)。その後、核分画とWCLを用意した(それぞれ手順3.5と3.6)。免疫ブロットは、CLL細胞株MEC1(図2A)および一次CLL細胞(図2B)の結果の画分に対して行った。ブロットをラミンA/C(核;74/63 kDa)およびβ-チューブリン(細胞質;55kDa)の画分マーカーについてプローブし、細胞分画の成功を確認した。分画は、MEC1細胞に対する最適な洗剤レベルが1:60希釈(図2A)であり、一次CLL細胞に最適である1:30希釈(図2B)と比較して、濃縮によって示される。核タンパク質と分数の細胞質タンパク質の欠如とその逆.WCLは全タンパク質を表し、細胞下画分のプローブに使用される抗体の陽性対照として機能します。分画マーカーとして適切なタンパク質を選択することが重要である:図2Cは、RNAポリメラーゼII(Rpb1 CTD;250 kDa)およびラミンA/Cをマーカーとして消したMEC1細胞から調製された核/細胞質分画の免疫ブロットを示す。核画分は、β-チューブリンおよびγ-チューブリン(50kDa)が細胞質マーカーとして用いた。γ-チューブリンが細胞質に富むことは明らかであるが、前に示したように、核では発現が明らかである。
実験条件が最適化されると、実験を行うことができます。示された実施例では、核および細胞質画画におけるFOXO1の細胞下局在化は、MEC1細胞における二重mTORC1/2阻害剤AZD8055の有無におけるB細胞抗原受容体(BCR)を有する細胞の刺激時に決定された(図 3A)および一次 CLL セル (図 3B)5,10.いずれの実施例でも、高度に濃縮された核分画および細胞質画分の生成は、細胞質画分におけるラミンとβチューブリンのほぼ排他的発現によって示された。いずれの細胞型でも、NDCと比較してAZD8055を用いた治療後の細胞質においてFOXO1発現が減少し、核コンパートメントにおけるFOXO1発現の増加を伴い、タンパク質転位を実証した(図3)。データ解釈の主観性を取り除くために、5つの主要なCLLサンプルから個々の免疫ブロットを細胞下画分内で定量した(ステップ4;図4Aは、各試料の内部負荷制御としてそれぞれの核または細胞質タンパク質を用いて、次いで、示されているように、非刺激(米国)薬物制御(NDC)制御に各分数を正規化する。結果のグラフは、核と細胞質画の間のFOXO1運動の傾向を示し、AZD8055は細胞質におけるFOXO1発現のレベルを低下させ、同時に核内の発現を増加させる。さらに、細胞質FOXO1発現の標高はBCR架橋で明らかである。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>チューブ</td>
			<td>チューブ名</td>
			<td>セル/ビーズ</td>
			<td>抗原</td>
			<td>フルオロフォア</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>染み込みなし</td>
			<td>細胞</td>
			<td>Na</td>
			<td>Na</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>シングルステイン</td>
			<td>ビーズ</td>
			<td>CD5</td>
			<td>Fitc</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>シングルステイン</td>
			<td>ビーズ</td>
			<td>CD19</td>
			<td>PE-サイ7</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>シングルステイン</td>
			<td>ビーズ</td>
			<td>CD23</td>
			<td>Apc</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>シングルステイン</td>
			<td>ビーズ</td>
			<td>CD45</td>
			<td>APC-Cy7</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>シングルステイン</td>
			<td>細胞</td>
			<td>生存 率</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>CLLステイン</td>
			<td>細胞</td>
			<td>CD5、CD19、CD23、CD45、生存率</td>
			<td>FITC、PE-Cy7、APC、APC-Cy7&amp;DAPI</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:CLL細胞のフローサイトメトリーに必要なサンプルチューブの理想的なセットを示す表。各実験には、得られた結果を正確に分析するための適切なコントロールをすべて含める必要があります。
<img alt="CDマーカー、リンパ球同定、細胞集団解析を示すフローサイトメトリーグラフ。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60426/60426fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図1:濃縮CLL患者の代表的なフローサイトメトリー分析プロット。個々のCLL患者の末梢血から濃縮された単核CLL細胞をFSC-A対SSC-Aを用いてゲートし、次いでFSC-A対FSC-H(A)を用いて二重を除外した。 染色されていない細胞(チューブ1)と補償制御(チューブ2-6)を使用して、細胞を検出し、蛍光チャネル間を補正するフローサイトメーターを設定し、蛍光シグナルが正しく検出されたことを確認しました。(B)CD19およびCD5蛍光チャネルにおける陰性染色(無染色細胞;チューブ1)の一例。ライブ(DAPI陰性)およびCD45陽性細胞をゲート(C)とCD19+CD5+(95.5%)CD19+CD23+ (91.2%)DAPI内の細胞-CD45+母集団が決定された(D)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60426/60426fig01large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="ウェスタンブロット分析図;核/細胞質画分におけるタンパク質の局在化;ラミン、チューブリン、Rpb1。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60426/60426fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 図2:核/細胞質画分画の最適化細胞質および核画分、および全細胞凝集物(WCL)は、CLL細胞株(A)MEC1または(B)に記載されている患者の末梢血から濃縮された一次CLL細胞の細胞ペレット(10〜20x106細胞)から調製した。手順 3.細胞質画分率を調製する際の洗剤比の範囲(1:20~1:60)を用いて細胞内画分分の最適化を行った(ステップ3.4に記載)。得られたサンプルを免疫ブロロットし、抗ラミンA/C(核)および抗βチューブリン(細胞質)抗体を用いてプローブし、WCLと並んで細胞分画の成功を確認した。分子量マーカーは、ブロット(M)の左側に示されている。*細胞リシスに最適な洗剤条件を示します。(C)刺激の不在(+または-BCR架橋)の存在下で、対照条件(NDC)または薬物治療(8055)を有するMEC1細胞からの核および細胞質画分の免疫ブロト。ブロットは、抗Rbp1 CTD(クローン4H8;RNAポリメラーゼIIサブユニットB1を認識)、抗ラミンA/C、抗βチューブリンまたは抗γチューブリン(クローンGTU-88)抗体を用いてプローブし、細胞外画分を同定した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60426/60426fig02large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="ウェスタンブロット分析、核および細胞質タンパク質の局在化、BCR、FOXO1、ラミン、β-チューブリン。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60426/60426fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 図3:細胞内分画は、CLLにおける核と細胞質間のFOXO1のシャトルを示す。(A)MEC-1細胞および(B)一次CLL細胞を100nM AZD8055(8055)で30分間前処理し、または示されているように未処理(NDC)のままにし、その後BCRを1時間または米国を残した。次に、核および細胞質画分を調製し、免疫ブロロットした。抗ラミンA/C(核)および抗βチューブリン(細胞質)抗体による分画の確認を行った後、抗FOXO1抗体を用いてFOXO1タンパク質発現に対して薬物治療とBCRライゲーションの両方の効果を評価した。Mは分子量マーカーを示す。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60426/60426fig03large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="タンパク質発現分析、FOXO1 イムノブロット、デンシトメトリー結果。実験、細胞質対核。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60426/60426fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 図4:定量的ウェスタンブロット分析(デンシトメトリー)の働いた例。(A)デンシトメトリーは、オンラインで入手可能なウェスタンブロット分析ソフトウェアを用いて行った。簡単に言えば、解析リボン内で、信号強度を計算するために画像内のタンパク質バンドの周りに長方形が描かれました。図示は、細胞質/核分画を受けたCLL患者サンプルの代表的なウェスタンブロット画像のデンシトメトリーである。細胞質および核画分は、細胞質(β-チューブリン)および核(ラミンA/C)マーカーの発現によって区別される。特定の条件に対するFOXO1の正規化発現は、分析される分数に応じて、FOXO1に対して得られたシグナルをβ-チューブリンまたはラミンA/Cに対する対応するシグナルで割ることによって計算することができる。相対FOXO1式(米国車両制御に対して)は、所定のセルラー画分の米国車両制御の正規化されたFOXO1式によって所定の条件の正規化されたFOXO1式を除算することによって計算することができる。(B)細胞質(左)または核(右)のFOXO1発現レベルを示すグラフは、各細胞画分内でUS-NDC制御に正規化された。グラフ上の赤い点は、示されている作業例です。このデータは、US-NDC±SEM.P値と比較したFOXO1式の平均折り目変化を、両尾学生ペアt検定によって決定した。n = 5つの個々のCLL患者サンプル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60426/60426fig04large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、原発性慢性リンパ球性白血病細胞からの核および細胞質画分の最適化およびその後の効率的な生成を可能にする。これらのサンプルは、タンパク質の局在化と、細胞刺激および薬物治療時に核と細胞質区画の間で起こるタンパク質の密売の変化を決定するために使用されます。

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

核と細胞質の間で高分子の輸送を調査する技術を開発し、腫瘍抑制タンパク質の誤局在化を特定することは、CLLの病因の深い理解を得て、新しい治療法の開発を助けるために不可欠です。このプロトコルは、原発CLL細胞から核分画および細胞質分画を生成するための迅速かつ効率的な方法を提供する。これらの画分は、酵素活性アッセイ、プロテオーム解析、ウェスタンブロッティングを含む下流の実験で使用することができます。この技術は、腫瘍内の治療法および微小環境シグナルが、CLL細胞および潜在的に他のB細胞悪性腫瘍における核と細胞質の間のタンパク質の閉じ込めをどのように変化させるかについての我々の理解を広げる。この方法は、タンパク質の位置を決定したり、必要に応じてタンパク質の動きを引き付けるために使用することができます。使用する予定の各セルラインに洗剤勾配を適用して、高度に富んだ核および細胞質画分の最適な生成を確実にします。ジョディ・ヘイとマイケル・モレスと並んで、この手順を実証することは、私の研究室の技術者ジェニファー・カッセルズです。以前に同意した慢性リンパ性白血病患者から、白血球数を伴うEDTA採血管で末梢血サンプルを取得する。ヒトの血液サンプルは、血液媒介ウイルスを含む可能性があるため、危険とみなされるべきです。これらのサンプルはクラス2のバイオセーフティキャビネットで取り扱い、ユーザーは常にラボコートと手袋を着用していることを確認してください。消毒剤中の血液汚染物質を処分する。白い細胞数が1ミリリットル当たり4000万個以上の場合は、RT CLL洗浄バッファで1対1の比率でサンプルを希釈します。次に、アリコートRT密度勾配媒体をサンプル用の適切なサイズの円錐遠心管に入れた。サンプルを慎重に培地の上に、遠心分離機を400 x gでRTで30分間重ねます。プラスチック製のパスツールピペットを使用して、CLL洗浄バッファーの密度勾配媒体の界面で収集した単核細胞の白層を穏やかに収穫する。この単層を新鮮な50ミリリットル円錐形遠心分離管に移します。細胞を洗浄するには、この単層に40ミリリットルのCLL洗浄バッファーを加え、遠心分離機を室温で10分間300 x gで加えます。上清を捨て、チューブの底面をフリックしてペレットを再中断し、この洗浄を繰り返します。上清を捨て、チューブの底部を再度フリックし、ペレットの大きさに応じてCLL洗浄バッファのセットボリュームで細胞ペレットを再中断します。細胞を数えた後、細胞の純度を確認するために細胞をフローサイトメトリーに計った後、刺激または薬物治療の準備ができて必要な細胞密度で組織培養プレートに細胞を入れる。刺激および/または薬物治療の後、インキュベーションは完了した。セルを摂氏4度で5分間200 x gの遠心分離機でそれぞれ標識された1.5ミリリットルマイクロフュージチューブとペレットに移します。上清を捨て、ホスファターゼ阻害剤を用いて氷冷PBSの1ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁する。摂氏4度で5分間200 x gで遠心分離機。上清を取り除き、これらの細胞全体の抽出ペレットを氷の上に保管して、さらなる準備をします。細胞質分画を調製するには、細胞ペレットを1x高トニックバッファーの 50 マイクロリットルに静かに再中断します。細胞が膨らむのを許すために、氷の上で15分間インキュベートする。特定の細胞タイプに使用する洗剤の最適濃度を決定するために洗剤勾配を行った後、各サンプルに0.8〜2.5マイクロリットルの洗剤を加え、最高の設定で渦を10秒間加えます。細胞のリシスを確認するには、洗浄剤を添加する前後の位相コントラスト顕微鏡で細胞を観察します。すべての細胞は、明るいハローとして現れる細胞質に囲まれた密で暗い核を有する。一度lysed, 摂氏4度で30秒間14,000 x gでサンプルを遠心分離します。慎重に、ペレットを乱すことなく、上清をあらかじめ冷蔵ラベル付きマイクロフュージチューブに移し、さらに分析するまでこの細胞質分率を摂氏80度で保存します。核分率の汚染を防ぐために、細胞質分画の完全な除去を確認してください。核分画を含む残りのペレットに、完全なリシスバッファーの50マイクロリットルを追加し、上下にピペットをピペットすることによって再中断します。核膜に関連するタンパク質を可溶化するには、2.5マイクロリットルの洗剤を添加し、最高の設定に渦を10秒間加え、氷上で30分間インキュベートします。30秒間の最高の設定と遠心分離機の渦。その後、上清を事前に冷蔵標識されたマイクロフュージチューブに移し、さらに分析されるまでこの核分率を摂氏80度で保存します。全細胞のライセートの場合、細胞全体の抽出ペレットを100マイクロリットルの完全なリシスバッファーに再中断し、上下にピペット処理します。完全な細胞のリシスを確実にするために、5マイクロリットルの洗剤を加え、氷の上で30分間インキュベートします。最高の設定で渦を30秒間、そして摂氏4度で20分間14,000 x gの遠心分離機。上清を冷蔵マイクロフュージチューブに移し、さらに分析するまでこの全セルライセートを摂氏80度で保存します。核と細胞質の分画の間のタンパク質の密売を定量化するには、定量的にウェスタンブロット分析を行い、画像をインポートします。イメージリボンに画像を表示するには、[表示]グループの[選択]ボタンをクリックし、[ケミチャンネル]をクリックします。[表示を選択]ダイアログが開き、必要に応じてさらに調整が可能になります。明るさやコントラストを含む画像 LUT のタブで調整可能なスライダーを使用して、追加の機能強化を実装します。微調整を行うには、[カーブ]タブを使用します。データ分析の場合は、まず [解析] リボンをクリックします。1 つのチャンネルのみを分析するには、チャンネルの「チャンネルを表示しない」サムネイルをクリックして、分析していないチャンネルの選択を解除し、目的のチャンネルのみを表示します。信号の強度を定量化するには、[長方形の追加] をクリックして、画像に長方形を追加します。タンパク質バンドなどのフィーチャの中心をクリックして、周囲に長方形を配置します。目的のシェイプを追加した後、[選択]をクリックして、カーソルを選択ツールに戻します。バックグラウンド ノイズを減算するには、[背景] グループの最初のボタンをクリックし、ドロップダウン メニューから [中央値] を選択します。[背景]ダイアログで枠線の幅を 3 に設定し、背景計算に使用する画像背景を最も適したセグメントを選択します。データをエクスポートするには、表の上にある [図形] タブをクリックします。密度測定では、シグナル列の値が必要です。シグナルは、図形のピクセルの強度値または合計から、その領域内の背景の積を引いた値の合計です。次に、[レポート] ボタンをクリックし、[名前を付けて保存] または [スプレッドシートの起動] をクリックします。保存されたスプレッドシート内の各プレーンまたは変数の対象となるタンパク質の正規化された発現を計算するには、目的のタンパク質に対して得られたシグナルを、対応するタンパク質負荷制御バンドのシグナルで割ります。イメージをエクスポートするには、表の上にある [イメージ] タブをクリックし、エクスポートするイメージをクリックします。スライド プレゼンテーションなどのデジタル形式でイメージを使用する場合は、ソフトウェア アイコンをクリックし、[エクスポート] にカーソルを合わせ、[デジタル メディアのイメージ] をクリックして、必要に応じてイメージを保存します。密度遠心分離を用いて、1ミリリットル当たり4000万を超えるWCCを有するCLL細胞の濃縮は、高い細胞回収を可能にする。FSCおよびSSC上での測定後のフローサイトメトリーによるサンプルの分析は、CLL細胞マーカー、CD19およびCD5の二重表面発現によって示されるようにCLL細胞の純度が95%以上であることを明らかにした。CLL細胞株、Mac-1、および一次CLL細胞の結果の分画に対して免疫ブロットを行った場合、分画は、一次CLL細胞の1〜30に比べて、Mac-1細胞の最適な洗剤レベルが1〜60希釈であることを示した。核および細胞質画分におけるFOXO1の細胞内局在化がMac-1および一次CLL細胞で決定された場合、細胞質画分における核およびベータチューブリンにおけるラミンのほぼ排他的な発現によって、高度に富んだ分画の生成が示された。FOXO1発現は、AZD 8055による処理後の細胞質において減少し、NDCと比較して、核コンパートメントにおけるFOXO1発現の増加を伴い、タンパク質転位を示す。5つの主要CLLサンプルからの個々の免疫ブロットを細胞内分画内で定量した後、AZD 8055は細胞質におけるFOXO1発現のレベルを低下させ、核内の発現を増加させることが判明した。BCR架橋増加細胞質FOXO1発現.タンパク質の分解を防ぐために、すべての試薬とサンプルを氷の上に保管してください。この手順で生成された細胞内分画は、FOXO1の細胞位置とそのDNA結合活性との間に平行に描かれるようにしたFOXO活性アッセイなどの酵素活性アッセイにも使用することができる。この技術の開発により、選択的阻害剤に応答してCLL細胞内の特定のタンパク質の密売に対処し、堅牢で定量化可能なデータセットを生成するための並列免疫蛍光研究を支援しました。

subcellular-fractionation-primary-chronic-lymphocytic-leukemia-cells

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顕微鏡のカバーグラス上に、哺乳動物細胞の in...

接着および非接着性の哺乳動物細胞の in situ細胞下分画で

このビデオでは、末梢血から慢性リンパ性白血病(CLL)細胞を分離する技術について説明しています。このプロトコルでは、ヒト患者の血液サンプルからCLL細胞を分離し、その後の核画分および細胞質画分の効率的な生成を実現します。...

密度勾配遠心分離法:末梢血からCLL細胞を単離する方法

このビデオでは、白血病細胞から細胞内画分と核分画を生成する方法である白血病細胞からの細胞内画分の調製について説明しています。核画分と細胞質画分は、さらに下流の分析に使用できます。...

白血病細胞からの細胞内画分の調製:白血病細胞から細胞画分および核画分を生成する方法

ここでは、カップル2プロテオミクス技術、すなわち2次元電気泳動（2DE）および質量分析（MS）は、一次サンプルの2つ以上のグループ間で差次的に発現/翻訳後修飾タンパク質を同定するためのプロトコールを記載する。このアプローチは、一緒に機能的な実験と、予後マーカー/治療標的の同定および特徴を可能にします。...

タンパク質機能に2DE  - ゲルスポットから：慢性リンパ性白血病で、HS1から学んだレッスン

&gt;jove_content&lt;ここで説明するプロトコールは、異なる条件下で培養された慢性リンパ性白血病(CLL)細胞のプリン代謝を測定するために、逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)を使用する簡単で再現性のある方法を表しています。...

HPLCベースのアッセイは、ヒト慢性リンパ球性白血病細胞における細胞外ヌクレオチド/ヌクレオシド代謝を監視します

このプロトコルは、NLS-NES-GFPタンパク質の核内取り込みにおけるリアルタイム変化を定量化することにより、運動ニューロン様NSC-34細胞内の核細胞質輸送速度を敏感に測定する方法を記載する。...

運動ニューロン様NSC-34細胞内のリアルタイムでの核細胞質輸送を測定するアッセイ

このプロトコルでは、異なる細胞周期の段階に主な急性リンパ芽球性白血病細胞を分離する遠心浄化の使用について説明します。...

遠心浄化によって異なった細胞周期の段階で主に急性リンパ性白血病細胞の調製

慢性リンパ性白血病 (CLL) は西部の世界で最も一般的な白血病です。NFAT 転写因子は、開発と様々 な細胞タイプにおける活性化の重要なレギュレータです。NFAT2 の新規標的遺伝子を識別するために CLL 細胞のクロマチン免疫沈降 (チップ)...

慢性リンパ性白血病の新規 NFAT2 ターゲット遺伝子を識別するクロマチン免疫沈降法

記載されているプロテオミクスワークフローは、目的とするタンパク質の免疫親和性濃縮と標識フリー質量分析法を用いて核細胞内分画からタンパク質相互作用パートナーを同定するためのプロテオミクスワークフローである。このワークフローには、細胞内分画、免疫沈降、フィルター支援サンプル調製、オフラインクリーンアップ、質量分析、下流バイオインフォマティクスパイプラインが含まれます。...

大規模核インターロームプロファイリングのためのラベルフリー免疫沈降質量分析ワークフロー

この分画プロトコルにより、研究者は哺乳類細胞から細胞質、核、ミトコンドリア、および膜タンパク質を単離することができます。後者の2つの細胞内画分は、等密度密度勾配を介してさらに精製される。...

等密度勾配精製によるU937細胞の細胞分画

本プロトコルは、培養細胞を用いて核および細胞質画分からRNAを単離し、qPCRを用いて検証するための効率的で柔軟な方法を提供します。これは、他のRNA調製キットの代替品として効果的に機能します。...

初代細胞および培養細胞からの細胞質および核長鎖RNAの調製

学ぶ原発性慢性リンパ球性白血病細胞の核・細胞質分画法。タンパク質の局在と輸送を解析し、治療効果を評価するための迅速かつ効率的な手法を習得できます。

核/細胞質タンパク質の密売を監視する原発性慢性リンパ球性白血病細胞の細胞分画

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