Name: マウス神経新生時のノッチシグナル伝達ダイナミクスのリアルタイム生物発光イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 学ぶマウス神経幹細胞におけるノッチシグナル伝達の動態解析。高感度バイオルミネセンスイメージングシステムを用いて、遺伝子発現のリアルタイムモニタリングを実現し、細胞増殖と分化のメカニズム解明に貢献します。

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映像制作を応援してくださった岩本由美子さんに感謝します。また、磯村明宏の議論や画像解析のサポートにも感謝しており、トランスジェニック動物の生成に対する技術支援のための宮地仁、新庄裕司(オリンパス医学)、江川正敏(オリンパス医科)、石津拓也()オリンパス医科学)とオイン・クニタキ(アンドール・ジャパン)は、生物発光イメージングシステムの技術サポートと議論を行っています。この研究は、進化科学技術のコア研究(JPMJCR12W2)(R.K.)、革新的領域に関する科学研究のための助成(H.S.のためのMEXT 24116705およびR.K.のためのMEXT 16H06480)、科学研究のための補助金援助(C)(JSPS)によって支えられた18K06254)(H.S.)、武田財団(R.K.およびH.S.)、および文部科学省の生活システムへの動的アプローチのためのプラットフォーム。

動物の被験者を含むすべての手続きは、京都大学フロンティア生命医科学研究所の制度的動物管理利用委員会によって承認されています。
1. 生物発光レポーター
注:ルシフェラーゼレポーターは、分解シグナルを融合してプロモーター活性の急速なダイナミクスを測定するのに適しています。さらに、ルシフェラーゼ融合レポーターは、単一細胞におけるタンパク質ダイナミクスのモニタリングを可能にします。両方のタイプのレポーターは、単層培養(解離培養)および組織培養(スライス培養)実験に利用できる。
<ol><li>Dll1 プロモーターアクティビティを監視するためのレポーター17 注:遺伝子発現の急激な変化を監視するには、迅速な応答と不安定なレポーターが不可欠です。ホタルルシフェラーゼ(Fluc)は、フルオレセインレポーターと比較して急速な成熟を示す。ユビキチン融合ルシフェラーゼレポーター(Ub-Fluc)は急速な分解と急速なターンオーバーを示すので、生細胞20における動的遺伝子発現を監視することは非常に有用である。<ol>
<li>Dll1プロモーター駆動不安定性ルシフェラーゼレポーター、ユビキチン化ルシフェラーゼ(pDll1-Ub-Fluc、図1A上部パネル)を使用して、転写レベル17でDll1発現の急激な変化を監視する。</li>
		<li>このレポーターの安定した発現のためのpDll1-Ub-Flucを運ぶトランスジェニックマウスラインを生成する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dll1タンパク質ダイナミクスを監視するためのレポーター17.<ol>
<li>ノックインマウスの生成については、Dll1-ルシフェラーゼ融合タンパク質が発現するようにDll1コード領域の3'末端にルシフェラーゼcDNAを挿入する(Dll1-Flucレポーター、図1A、下部パネル)17。</li>
		<li>ルシフェラーゼ活性を測定することにより、タンパク質レベルでのDll1の発現ダイナミクスを監視する。</li>
		<li>組織レベルでのDll1タンパク質ダイナミクスをモニタリングするために、子宮エレクトロポレーションによって胚性脳波のNPCにDll1-Flucレポーターを導入する。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 生物発光イメージングシステム
<ol><li>感度の高い水冷CCDカメラを搭載した反転顕微鏡を用いて、生物発光ライブイメージングシステムを構築する。騒音を低減し、高感度を得るためには、-90°Cの最適化された温度でサーキュレータが提供する冷水でカメラを冷却します。</li>
	<li>生細胞/組織イメージングの場合は、インキュベーションシステムを設置し、温度と混合ガスを制御し、顕微鏡段階にします。</li>
	<li>不安定化ルシフェラーゼレポーターの発現をイメージングするには、高い数値角(NA:1.30)40xオイル浸漬対物レンズを使用します。このレンズの作動距離は0.2mmであり、単層細胞培養のみならずスライス培養にも利用できる。</li>
	<li>ルシフェラーゼとフルオレセインレポーター発現の二重モニタリングのために、LED照明装置を顕微鏡の光経路に取り付けます。</li>
	<li>顕微鏡に関連するソフトウェア(例えば、MetaMorphソフトウェアの多次元集録プログラム)を用いてタイムラプスイメージングを制御する。</li>
	<li>不安定なルシフェラーゼレポーターの信号が非常にかすかであるため、システム全体を暗い部屋に準備し、余分な光を避けるために、取得を防ぎます。</li>
</ol>3. 神経幹/前駆細胞(NPC)解離培養
<ol><li>NPC解離培養のための培養媒体、食器、試薬の調製<ol>
<li>DMEM/F12メディアで、最終濃度1x N2、1x B27、1mM N-アセチルシステイン、10 ng/mL bFGFおよび50 U/mLペニシリン/ストレプトマイシンを用いて神経幹/前駆細胞を培養するためのN2/B27メディアを用意します。</li>
		<li>EBSSメディアで7 U/mLパパイン、0.006%DNaseおよび1 mM N-アセチルシステインを含む解離のためのパパイン溶液を調製します。</li>
		<li>発光イメージング用ルシフェリンナトリウム溶液を100m調製します。N2/B27媒体中の希薄100mMルシフェリン溶液を1mMの最終濃度にする。 注:ルシフェリンは、オートフルオレセイン自体を示しています。ルシフェラーゼ蛍光デュアルイメージングの場合、特にEGFPは、ルシフェリンの濃度を0.5mMに低下させる方が良い。</li>
		<li>35mmガラス底皿(ガラス径27mm)を、室温で1時間、ポリL-リジン(PLL)溶液の40μg/mLでコーティングします。インキュベーション後、プレート3xをPBSで洗い、乾燥させます。</li>
	</ol></li>
	<li>NPCの胚解離と解離<ol>
<li>CO2窒息と子宮頸部脱臼によって妊娠中のpDll1-Ub-lucトランスジェニックマウス(胚発生日12.5(E12.5)))を安楽死させた後、腹部を切り取り、子宮を取り出す。 注:研究者は、その機関の動物研究委員会の規則とガイドラインに従う必要があります。麻酔や痛みの軽減薬を使用する場合は、適切に使用してください。</li>
		<li>25 mLの氷冷PBSを含む10cmペトリ皿で子宮を移します。マイクロはさみと細かい鉗子を使用して、氷冷PBSで子宮から胚を取り出します。</li>
		<li>はさみを使って各胚の頭部を切り取り、氷冷DMEM/F12を含む10cmペトリ皿に移します。脳を取り巻く表皮と軟骨を取り除き、N2/B27メディアの氷冷3mLを含む35mmペトリ皿に脳を移します。</li>
		<li>死脳から左右の脳素を切り落とす (図 1Ba-f, C,D)。微細鉗子を使用して、脳素の表面を覆う髄膜を取り除きます(図1Bi)。再び微細鉗子を使用して、脳素から皮質のヤソ側部分を取り出す(図1Bg,h,j-l E)。</li>
		<li>P1000ピペットを使用して組織を新しい1.5 mLチューブに移し、P200ピペットで余分な媒体を取り外します。脳組織(皮質のペア)あたりパパイン溶液の0.1 mLを追加します。24°Cでインキュベーションを15分後、P1000ピペットでサンプルを10回軽くピペットします。24°Cで15分間、サンプルを再度インキュベートします。</li>
		<li>P1000ピペットでサンプルを10回軽くピペットします。400 x gと室温 (RT) で 3 分間サンプルを遠心分離します。上清を捨てる。</li>
		<li>DMEM/F12 メディアをペレットに 1 mL 追加します。P1000ピペットで10回軽くピペット。400 x gで3分間サンプルを遠心分離し、上清を廃棄します。これを少なくとも2回繰り返してください。</li>
		<li>ペレットに0.5 mLのN2/B27媒体を加え、ルシフェリン1mMを含み、よく混ぜます。細胞(1 x 106細胞)をPLLコーティングガラス底皿に播種します。CO2インキュベーター内の細胞を1時間培養する。細胞が皿に付着したら、1 mMルシフェリンを含むN2/B27媒体の2 mLを加える。</li>
	</ol></li>
	<li>NPC解離培養におけるルシフェラーゼレポーター発現の可視化<ol>
<li>解剖を実行する前に、発光ライブイメージングシステムを起動します。NPC培養の場合、ステージインキュベーターの温度を37°Cに設定し、ガス混合物の設定を20%O2、5%CO2に設定する。</li>
		<li>イマージョンオイルを対物レンズに入れます。サンプル皿を顕微鏡の段階に置きます。フィールドを手動で表示し、目的のセルの最適な位置とフォーカスを選択します。[ライブ] をクリックしてテスト イメージを取得します。</li>
		<li>多次元集録プログラムで24時間分の2次元(発光・明視野)取得によるタイムラプス取得を実行します。多次元集録プログラムを選択し、取得設定を以下のように設定します(ステップ3.3.6)。</li>
		<li>発光画像取得には、低転写速度(50kHz)、2 x 2/4 x 4ビニング、10分/5分露光時間のカメラ設定を使用します。明視野画像の取得には、中間転送速度(1 MHz)、1 x 1ビニング、100ミリ秒の露光時間の設定を使用します。</li>
	</ol></li>
</ol>4. 子宮エレクトロポレーションで
注:これは、神経前駆細胞にDll1-Flucレポーターを導入するために行われます。
<ol><li>エレクトロポレーション用工具・試薬の調製<ol>
<li>胚性脳症の心室にDNAを注入するためのマイクロキャピラリーを準備する。熱で草の毛細血管を伸ばし、研磨機でその先端を磨きます。</li>
		<li>色素(例えば、トリパンブルー)とDNAの混合物を調製する。各DNAの濃度はPBSで1μg/μLであり、最終濃度10%に染料を加える。 注:Dll1タンパク質ダイナミクスの可視化にはDNAの混合物を使用してください:Dll1-Fluc(Dll1タンパク質レポーター、図2E上部)およびpEF-EGFP(EFプロモーター駆動EGFP発現ベクター、図2E下部)は、トランスフェクトされた細胞の位置と形態を監視します。</li>
		<li>2種類の麻酔薬を調製する:ペントバルビタールの3.88 mg/mLとキシラジンの0.12%、滅菌1x PBS。</li>
		<li>操作中に無菌器具および外科手袋を使用してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>子宮エレクトロポレーションで<ol>
<li>3.88 mg/mL ペントバルビタールの 500 μL および 0.12% キシラジンの 500 μL を有する麻酔薬の腹腔内投与によって、時間妊娠 ICR マウス (E12.5) を麻酔する。 注:研究者は、動物実験の規制に従う必要があります。麻酔や痛みの軽減薬を使用する必要がある場合は、それらを適切に使用してください。</li>
		<li>髪をクリップし、外科スクラブで皮膚を消毒します。</li>
		<li>つま先ピンチ応答の欠如を確認します。ペダル反射が見えなくなったら、2-3cmを腹部を中線に沿って切り取ります。解剖された部分の周りにガーゼを入れ、切開部を乾燥させないように暖かいPBSでガーゼを濡らします。リング状の鉗子で右の子宮の角を穏やかに取り出し、胚の数を数えます。</li>
		<li>混合DNAの1~2μLを、マイクロキャピラリーで胚の脳波の心室にやさしく注入する。 注:注射が成功すると、子宮の表面上に色素の青色が見えます。</li>
		<li>電圧パルスを供給する前に子宮と電極を濡らし、胚の頭部を穏やかに保持します。正に帯電した電極を半球の側面に設定し、DNAを注入した。エレクトロポレーションのパルスの状態が50ミリ秒で30~50Vであることを確認し、パルスの間隔は1秒(50ミリ秒、ノンチャージ950ms)です。1つの胚に5パルスを提供し、負の荷電電極から気泡が発生することを確認します。 注:電極の方向:DNAが正極の側面の細胞に組み込まれていることを確認してください。この手順の間、電極の位置を移動しないでください。</li>
		<li>他の胚についても手順4.2.3~4.2.4を繰り返し、子宮角を腹腔に戻します。左子宮角の胚に同じ手順を実行します。</li>
		<li>左側を戻した後、シルク縫合糸(4-0)で切開を針(17mm)で縫合します。切開を完全に閉じる前に、暖かいPBSを腹腔に入れる 注:縫合糸間の間隔は約2mmです。</li>
		<li>手術を終えた後、麻酔後の回復のために加熱パッドの上にマウスを置きます。マウスを個別に収納します。 注:研究者は、動物実験の彼らの地元の扇動規則に従う必要があります。痛みの軽減薬を使用する必要がある場合は、適切に使用してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 皮質スライスにおける発達皮質のスライス培養とルシフェラーゼレポーター発現の可視化
<ol><li>皮質のスライス培養のための培養媒体および試薬の調製<ol>
<li>N2/B27メディアで5%ウシ血清と5%馬血清を含む皮質スライスを培養するための濃縮媒体を準備します。</li>
		<li>解剖し、皮質のスライスを作るためのDMEM /F12媒体を通して気泡100%O2ガス。 メモ:酸素ガスを安全に使用するには、O2シリンダーをシリンダーキャビネットに収納し、酸素濃度計で空気中の酸素濃度を監視してください。</li>
		<li>濃縮媒体中の100mMルシフェリンナトリウム溶液を1mMの最終濃度に希釈する。 注:ルシフェリンは、オートフルオレセイン自体を示しています。ルシフェラーゼ蛍光デュアルイメージングの場合、特にEGFPは、ルシフェリン(0.5mM)の濃度が低い方が良い。</li>
		<li>マルチガスインキュベーターを37°Cに40%O2、5%CO2に設定します。</li>
	</ol></li>
	<li>胚の解剖と蛍光レポーターの発現の検討<ol>
<li>レポーター(E13.5)が子宮エレクトロポレーション(ステップ4.2)で導入される妊娠中のマウスを安楽死させた後、腹部を切断し、子宮を取り出す。 注:研究者は、動物実験の規制に従う必要があります。麻酔や痛みの軽減薬を使用する場合は、適切に使用してください。</li>
		<li>PBSを含む10cmのペトリ皿に子宮を移します。マイクロはさみと細かい鉗子を使用して、PBSの子宮から胚を取り出します。各胚の頭部を切り取り、DMEM/F12媒体を含む10cmのペトリ皿に100%O2ガスで泡立たせて移します。DMEM/F12メディアで脳を取り巻く表皮と軟骨を取り除く。</li>
		<li>リング状の鉗子でペトリ皿のふたの上に脳を置き、蛍光立体顕微鏡の段階で蓋を置きます。励起光の下で蛍光タンパク質を発現する皮質の領域を確認する(図2A,B)。</li>
		<li>DMEM/F12メディアの30 mLを充填したシリコーンゴム製のまな板に脳を移し、100%O2ガスで泡立たせた。細かい鉗子によって脳素の表面を覆う髄膜を取り除く。</li>
		<li>後側脳の内側と側面の間の境界を切断し、マイクロ手術ナイフまたは細かい鉗子を使用して2つの半球に分けます。マイクロ手術用ナイフを使用して、ストライプのような皮質をカットし、皮質のスライスを作ります(図2C,D)。ピペットを使用してミディアムでピペットスライスし、35ミリメートルの皿で濃縮されたメディアに転送します。</li>
		<li>濃縮されたメディアとガラス底の皿に培養インサートにスライスを置きます。細かい鉗子を使用してスライスの方向を修正します。スライスの切断サーフェスをカルチャ挿入のサーフェスに設定します。ピペットで余分なメディアを取り外します。マルチガスインキュベーターでスライスを40%O2、5%CO2を37°Cで30分間インキュベートします。</li>
		<li>1 mMルシフェリンを含む濃縮メディアをガラス底皿に培養インサートの外側に300μL加えます。</li>
	</ol></li>
	<li>スライス培養におけるルシフェラーゼレポーター発現の可視化<ol>
<li>解剖を開始する前に、発光ライブイメージングシステムを開始します。皮質スライス培養物の次の条件を使用してください: 40% O2, 5% CO2および 37 °C.</li>
		<li>40倍の対物レンズに浸漬油を入れます。サンプル皿を顕微鏡の段階に置きます。蛍光の試験画像を取得し、励起光の照明下で目的の領域に位置とフォーカス平面を設定します。</li>
		<li>タイムラプス取得を24時間分の3-ジメンタル(発光、蛍光、明視野)による取得を実行する(図2F-H)。発光画像取得には、低転写速度(50kHz)、2x2/4x4ビニング、10分/5分露光時間のカメラ設定を使用します。蛍光および明視野画像取得には、中間転送速度(1 MHz)、1x1ビニング、100ミリ秒の露光時間の設定を使用します。</li>
	</ol></li>
</ol>6. 画像処理と解析
<ol><li>各画像を接続し、スタックイメージを作成します。[ファイル] メニューの [イメージ シーケンスの読み込み] をクリックします (インポート |)をクリックし、取得した画像が保存されるフォルダを選択します。ファイル名に含まれる単語をFile 名の列に入れます。</li>
	<li>生物発光画像の宇宙線のノイズを除去するには、ImageJ/Fijiのスパイクノイズフィルタープラグインを適用します。スタックイメージを開き、 (スパイクノイズフィルタ) をクリックします。</li>
	<li>Savitzky ゴレイテンポラル フィルタープラグインを適用して、レポーター式の明確なダイナミクスを取得します。スタック イメージを開き、[ Savitzky ゴレイテンポラル フィルター] をクリックします。</li>
	<li>レポーター式の強度を測定するには、Z軸プロファイル Plusプラグインを各セルに適用します。セルを選択し、ROI、対象地域を設定し、[Z 軸プロファイルプラス]をクリックします。
</li>
</ol>

<ol><li>Ross, S. E., Greenberg, M. E., Stiles, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+helix-loop-helix+factors+in+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Basic helix-loop-helix factors in cortical development.</a> Neuron. 39, 13-25 (2003).</li>
<li>Pontious, A., Kowalczyk, T., Englund, C., Hevner, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+intermediate+progenitor+cells+in+cerebral+cortex+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Role of intermediate progenitor cells in cerebral cortex development.</a> Developmental Neuroscience. 30, 24-32 (2007).</li>
<li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).</li>
<li>Paridaen, J. T., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+during+development+of+the+vertebrate+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis during development of the vertebrate central nervous system.</a> EMBO Reports. 15, 351-364 (2014).</li>
<li>Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+neurogenesis%3A+toward+an+understanding+of+the+development+and+evolution+of+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).</li>
<li>Louvi, A., Artavanis-Tsakonas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+in+vertebrate+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Notch signaling in vertebrate neural development.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7, 93-102 (2006).</li>
<li>Pierfelice, T., Alberi, L., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+in+the+Vertebrate+Nervous+System%3A+An+Old+Dog+with+New+Tricks%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Notch in the Vertebrate Nervous System: An Old Dog with New Tricks.</a> Neuron. 69, 840-855 (2011).</li>
<li>Bray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signalling%3A+a+simple+pathway+becomes+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Notch signalling: a simple pathway becomes complex.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 678-689 (2006).</li>
<li>Bray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signalling+in+context%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Notch signalling in context.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 722-735 (2016).</li>
<li>Kopan, R., Ilagan, M. X. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Canonical+Notch+Signaling+Pathway%3A+Unfolding+the+Activation+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Canonical Notch Signaling Pathway: Unfolding the Activation Mechanism.</a> Cell. 137, 216-233 (2009).</li>
<li>Ishibashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+expression+of+helix-loop-helix+factor+HES-1+prevents+mammalian+neural+differentiation+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Persistent expression of helix-loop-helix factor HES-1 prevents mammalian neural differentiation in the central nervous system.</a> The EMBO Journal. 13, 1799-1805 (1994).</li>
<li>Ohtsuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hes1+and+Hes5+as+notch+effectors+in+mammalian+neuronal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Hes1 and Hes5 as notch effectors in mammalian neuronal differentiation.</a> The EMBO Journal. 18, 2196-2207 (1999).</li>
<li>Ohtsuka, T., Sakamoto, M., Guillemot, F., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+the+Basic+Helix-Loop-Helix+Genes+Hes1+and+Hes5+in+Expansion+of+Neural+Stem+Cells+of+the+Developing+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Roles of the Basic Helix-Loop-Helix Genes Hes1 and Hes5 in Expansion of Neural Stem Cells of the Developing Brain.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 30467-30474 (2001).</li>
<li>Kageyama, R., Ohtsuka, T., Kobayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hes+gene+family%3A+repressors+and+oscillators+that+orchestrate+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Hes gene family: repressors and oscillators that orchestrate embryogenesis.</a> Development. 134, 1243-1251 (2007).</li>
<li>Shimojo, H., Ohtsuka, T., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillations+in+Notch+Signaling+Regulate+Maintenance+of+Neural+Progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Oscillations in Notch Signaling Regulate Maintenance of Neural Progenitors.</a> Neuron. 58, 52-64 (2008).</li>
<li>Imayoshi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillatory+control+of+factors+determining+multipotency+and+fate+in+mouse+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors.</a> Science. 342, 1203-1208 (2013).</li>
<li>Shimojo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillatory+control+of+Delta-like1+in+cell+interactions+regulates+dynamic+gene+expression+and+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis.</a> Genes and Development. 30, 102-116 (2016).</li>
<li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillatory+expression+of+the+bHLH+factor+Hes1+regulated+by+a+negative+feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop.</a> Science. 298, 840-843 (2002).</li>
<li>Kageyama, R., Ohtsuka, T., Shimojo, H., Imayoshi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Notch+signaling+in+neural+progenitor+cells+and+a+revised+view+of+lateral+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dynamic Notch signaling in neural progenitor cells and a revised view of lateral inhibition.</a> Nature Neuroscience. 11, 1247-1251 (2008).</li>
<li>Masamizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+the+somite+segmentation+clock%3A+revelation+of+unstable+oscillators+in+the+individual+presomitic+mesoderm+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 1313-1318 (2006).</li>
<li>Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+pulsing+in+genetic+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional roles of pulsing in genetic circuits.</a> Science. 342, 1193-1200 (2013).</li>
<li>Purvis, J. E., Lahav, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+and+decoding+cellular+information+through+signaling+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics.</a> Cell. 152, 945-956 (2013).</li>
<li>Luker, G. D., Pica, C. M., Song, J., Luker, K. E., Piwnica-Worms, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+26S+proteasome+activity+and+inhibition+in+living+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Imaging 26S proteasome activity and inhibition in living mice.</a> Nature Medicine. 9, 969-973 (2003).</li>
<li>Yamaguchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+Cellular+Clocks+in+the+Suprachiasmatic+Nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synchronization of Cellular Clocks in the Suprachiasmatic Nucleus.</a> Science. 302, 1408-1412 (2003).</li>
<li>Kiyohara, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BMAL1+C+terminus+regulates+the+circadian+transcription+feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The BMAL1 C terminus regulates the circadian transcription feedback loop.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10074-10079 (2006).</li>
<li>Behar, M., Hoffmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+temporal+codes+of+intra-cellular+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">Understanding the temporal codes of intra-cellular signals.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 20, 684-693 (2010).</li>
<li>Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+Gene+Expression+in+a+Single+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stochastic Gene Expression in a Single Cell.</a> Science. 297, 1183-1186 (2002).</li>
<li>Nelson, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillations+in+NF-kappaB+signaling+control+the+dynamics+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Oscillations in NF-kappaB signaling control the dynamics of gene expression.</a> Science. 306, 704-708 (2004).</li>
<li>Purvis, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+dynamics+control+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">p53 dynamics control cell fate.</a> Science. 336, 1440-1444 (2012).</li>
<li>Hansen, A. S., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter+decoding+of+transcription+factor+dynamics+involves+a+trade-off+between+noise+and+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Promoter decoding of transcription factor dynamics involves a trade-off between noise and control of gene expression.</a> Molecular Systems Biology. 9, 704(2014).</li>
<li>Hansen, A. S., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cis+Determinants+of+Promoter+Threshold+and+Activation+Timescale%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">cis Determinants of Promoter Threshold and Activation Timescale.</a> Cell Reports. 12, 1226-1233 (2015).</li>
<li>Johnson, H. E., Toettcher, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+Dynamics+Control+Cell+Fate+in+the+Early+Drosophila+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Signaling Dynamics Control Cell Fate in the Early Drosophila Embryo.</a> Developmental Cell. 48, 361-370 (2019).</li>
<li>Badr, C. E., Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging%3A+Progress+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging: Progress and applications.</a> Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).</li>
<li>Nakajima, Y., Ohmiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+assays%3A+multicolor+luciferase+assay%2C+secreted+luciferase+assay+and+imaging+luciferase+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence assays: multicolor luciferase assay, secreted luciferase assay and imaging luciferase assay.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 5, 835-849 (2010).</li>
<li>Nakajima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+beetle+luciferase+for+high-resolution+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Enhanced beetle luciferase for high-resolution bioluminescence imaging.</a> PLoS One. 5, (2010).</li>
<li>Stacer, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoLuc+reporter+for+dual+luciferase+imaging+in+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals.</a> Molecular Imaging. 12, (2013).</li>
</ol>

著者は相反する金銭的利害関係を持っていない。

ノッチシグナル伝達の成分は、ソミト形成時に同期して振動発現を示すが、神経新生時には同期がとれないので、後者の場合には静的解析によって発現ダイナミクスを捕捉するのが困難になる。したがって、Hes1やDll1などのノッチ シグナリング コンポーネントの表現ダイナミクスを明らかにするには、リアルタイム監視が必要です。Hes1およびDll1振動の式の期間は非常に短いため、約 2 ~ 3 時間、表現のダイナミクスを監視するには迅速な応答と不安定なレポーターが必要です。そのために、生物発光レポーターとイメージングシステムを開発しました。生物発光レポータールシフェラーゼは、このような環状遺伝子発現の急速なターンオーバーを追跡するために、急速な成熟運動および高感度を示す。記者の急速な回転率は、非常にかすかな信号が生成につながります。生物発光レポーターが生成するこのようなかすかな信号を検出するために、超低読み出し速度(50kHz)の高感度の水冷CCDカメラを含む最適化された生物発光イメージングシステムを使用し、ノイズを最小限に抑えます。さらに、高い開口(N.A.)対物レンズにより、不...

哺乳類の脳は、様々な種類のニューロンとグリア細胞で構成されています。すべての細胞は神経幹/前駆細胞(NPC)から生成され、最初に増殖してその数を拡大し、次にニューロンに分化し始め、最後にグリア細胞1、2、3、4、5を生み出します。細胞がニューロンに分化すると、細胞の増殖や数の増加はできないため、後の段階までNPCのメンテナンスが重要になります。細胞間相互作用を介したノッチシグナル伝達は、NPC6、7を維持する上で重要な役割を果たす。ノッチリガンドは、隣接する細胞の表面上の膜タンパク質、ノッチと相互作用し、ノッチタンパク質を活性化します。活性化後、ノッチタンパク質のタンパク質分解が起こり、それによってノッチ(NICD)の細胞内ドメインを細胞膜から核8、9、10に放出する。核では、NICDはHes1およびHes5(Hes1/5)のプロモーター領域に結合し、これらの遺伝子の発現を活性化する。 Hes1/5 は、プロニューラル遺伝子Ascl1およびニューロゲニン1/2 (Neurog1/2)11,12,13,14の発現を抑制します。プロニューラル遺伝子は神経分化を誘発するので、Hes1/5はNPCの維持に重要な役割を果たします。さらに、プロニューアル遺伝子はノッチリガンドデルタ様1(Dll1)の発現を活性化することができるので、Hes1/5もDll1の発現を抑制する。したがって、Dll1 の式は、ノッチシグナリングを介して Dll1 に対して隣接するセルが負の結果になります。このようにして、細胞は隣接する細胞が同じ運命をたどるのを阻害し、横方向阻害8と呼ばれる現象である。発達中の脳では、側面阻害は様々な異なる細胞型を生成する役割を果たす。
単一細胞レベルでのリアルタイムイメージングは、NPC15、16、17におけるノッチシグナリングの成分の動的表現を明らかにする。ノッチシグナル伝達はHes1の発現を活性化しますが、Hes1タンパク質は独自のプロモーターに結合し、独自の発現を抑制します。さらに、Hes1は非常に不安定なタンパク質であり、ユビキチン-プロテアソーム経路によって分解される。したがって、独自のプロモーターの抑圧は短命であり、その後、転写が再び開始されます。このようにして、Hes1の発現は、2時間サイクル18における転写レベルと翻訳レベルの両方で振動する。Hes1の振動発現は、順番に、Ascl1、Neurog2、およびDll1などの下流標的遺伝子の振動発現を、周期的な抑制15、16、17、19を介して誘導する。プロニューラル遺伝子は神経分化を誘発する可能性がありますが、その振動発現は神経分化には不十分です。むしろ彼らの持続的な発現は、神経の分化のために不可欠です。プロエン神経遺伝子の振動発現は、神経分化14、15、16を誘導するのではなく、NPCを維持するために重要である。Dll1の発現は、神経新生やソミトジェネシスなどの様々な形態形成の間の転写および翻訳レベルの両方で振動する。Dll1の動的発現は、正常な形態形成およびDll1の安定した発現が神経新生およびソミト形成17の欠陥を誘発する上で重要である。これらの知見は、遺伝子発現およびタンパク質動態のダイナミクスが様々な発達イベントの調節に及ぼす重要な機能を示している(すなわち、異なる発現ダイナミクスが細胞挙動において異なる出力を生み出す)。
ノッチシグナル伝達のダイナミクスを分析するために、組織や細胞の静的解析は絶えず変化しているため不十分です。単一細胞のリアルタイムイメージングは、遺伝子発現のダイナミクスを明らかにする強力なツールです。ノッチシグナル伝達分子の動的発現は、2〜3時間の間に急速な環状応答を受ける。この迅速な周期的発現は、リアルタイムモニタリングのための2つの困難な問題を提示する:(1)分子の発現が低レベルに抑制され、(2)急速な回転率は高速応答レポーターを必要とする。これらの問題を克服するために、我々は以前に生物発光リアルタイムイメージング法20を開発した。生物発光レポーターは蛍光レポーターよりも感度が高く成熟時間が短いため、生細胞の急激なダイナミクスをモニタリングすることができます。リアルタイムビジュアライゼーションを用いて、これまで考えられていたよりも多くの遺伝子が動的発現を示していることがわかりました。また、生細胞における発現およびタンパク質ダイナミクスを示す報告の数および様々な生物学的事象におけるこれらのダイナミクスの意義が増加しており、遺伝子発現21、22におけるダイナミクスの基本的な役割を示唆している。
本報告では、解別培養と皮質スライス培養の両方において、NPCにおけるノッチリガンドDll1の発現を可視化する方法について説明する。単一細胞レベルでのDll1転写のダイナミクスをモニタリングするために、pDll1-Ub-Flucレポーターを担うトランスジェニックマウスの胚性脳から由来するNPCの解離培養物を生成した。生体内のDll1タンパク質ダイナミクスをモニタリングするために、皮質のNPCにDll1-Fluc融合レポーターを導入し、皮質スライス培養におけるNPCにおけるレポーターの発現を可視化した。リアルタイムイメージングにより、生細胞における遺伝子発現やタンパク質ダイナミクスの様々な特徴を高い時間分解能で捉え得ることができます。

<table><tbody><tr><td>生物発光イメージングシステム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷水循環器(チラー)</td><td>Julabo</td><td>型:F12-ED</td><td></td></tr><tr><td>冷却CCDカメラ</td><td>Andor 技術</td><td>型式:iKon-M 934</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーターシステム</td><td>TOKAI HIT</td><td>型式:INU-ONICS</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>型式:IX81</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>型式:IX83</td><td></td></tr><tr><td>LED照明装置</td><td>CoolLED</td><td>型式:pE1</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph</td><td>MOLECULAR DEVICES</td><td>型式:40000</td><td></td></tr><tr><td>ミックスガスコントローラー</td><td>トッケン</td><td>型式:TK-MIGM OLO2</td><td></td></tr><tr><td>対物レンズ</td><td>オリンパス</td><td>型式:UPLFLN 40X O</td><td></td></tr><tr><td>解剖用準備<>ストロング</ストロング>/</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ディスセクション顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>型式:SMZ-2B</td><td></td></tr><tr><td>蛍光立体顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>型式:MZ16FA</td><td></td></tr><tr>細<td>鉗子</td><td>デュモン</td><td>イノックス No.5</td><td></td></tr><tr><td><ストロング>ハサミ、マイクロハサミ</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>リング状鉗子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm プラスチック ペトリ ディッシュ</td><td>グライナー</td><td>664160-013</td><td></td></tr><tr><td>35 mm プラスチック ペトリ ディッシュ</td><td>グライナー</td><td>627160</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ナカライ テスク</td><td>14249-24</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>invitrogen</td><td>11039-021</td><td></td></tr><tr><td> NPC 用試薬解離培養</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27サプリメント</td><td>invitrogen</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>invitrogen</td><td>13256-029</td>ストック<td>溶液:1 &mu;0.1% BSA/PBS</td></tr><tr><td>D-luciferin</td><td>Nacalai Tesque</td><td>01493-85</td><td>原液:100mM 0.9% 生理食塩水</td></tr><tr><td>DNase</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003172</td><td>原液:1000U/ml in EBSS</td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003188</td><td></td></tr><tr><td>ガラス底皿</td><td>IWAKI</td><td>3910-035</td><td></td></tr><tr><td>N2 サプリメント (100x)</td><td>invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-アセチル-システイン</td><td>Sigma</td><td>A-9165-25G</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003178</td><td>原液:EBSS</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Nacalai Tesque</td><td>09367-34</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma</td><td>P-6281</td><td>40 mg/ml in DW</td></tr><tr><td>子宮内エレクトロポレーション用製剤</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mlシリンジ</td><td>テルモ</td><td>181228T</td><td></td></tr><tr><td>電極</td><td>ネッパジェイン</td><td>7mm</td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポレーター</td><td>ネッパジェイン</td><td>CUY21 EDIT</td><td></td></tr><tr><td>鉗子ガー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ゼ</td><td>川本</td><td>7161</td><td></td></tr><tr><td>マイクロキャピラリー</td><td>自社</td><td></td><td></td>製</tr><tr><td>PBS</td><td>ナカライ テスク</td><td>14249-24</td><td></td></tr><tr><td>ペントバルビタール</td><td>キョリツセイヤク</td><td>ソムノペンチル</td><td></td></tr><tr><td>リング型鉗子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ハサミ・マイクロハサミ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>縫合針</td><td>秋山メディカル製作所 CO</td><td>F17-40B2</td><td></td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>バイエル</td><td>セラクタル</td><td></td></tr><tr><td>スライス培養のための調製</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10cmプラスチックペトリ皿</td><td>グ</td><td>ライナー664160-013</td><td></td></tr><tr><td>35mmプラスチックペトリ皿</td><td>グ</td><td>ライナー627160</td><td></td></tr>文化<tr><td>インサート</td><td>ミリポア</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>invitrogen</td><td>11039-021</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Σ</td><td>172012-500ML</td><td></td></tr><tr><td>細鉗子</td><td>デュモン</td><td>INOX No.5</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>馬血清</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>マイクロサージカルナイフ</td><td>アルコン</td><td>19ゲージ Vランス</td><td></td></tr><tr><td>マルチガスインキュベーター</td><td>パナソニック</td><td>MCO-5MUV-PJ</td><td></td></tr><tr><td>N2/B27 media</td> 自社<td>製</td><td></td><td>ref. NPC dissociatioin culture</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Nacalai Tesque</td><td>14249-24</td><td></td></tr><tr><td>リング型鉗子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ハサミ・マイクロハサ</td><td></td><td></td><td></td></tr>ミ <tr><td>シリコンゴムまな板</td><td>自社製</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウス神経新生時のノッチシグナル伝達ダイナミクスのリアルタイム生物発光イメージング

Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis

ノッチシグナル伝達は、細胞間相互作用によって神経幹/前駆細胞の維持を調節する。ノッチシグナリングの成分は動的発現を示す。ノッチシグナル伝達エフェクターHes1およびノッチリガンドデルタ様1(Dll1)は、神経幹/前駆細胞において振動的に発現される。これらの遺伝子の振動発現の期間は非常に短い(2時間)ため、その周期発現を監視することは困難である。このような遺伝子発現またはタンパク質ダイナミクスの急速な変化を調べるには、迅速な応答レポーターが必要である。その速い成熟運動と高感度のために、生物発光レポータールシフェラーゼは、生きている細胞の急速な遺伝子発現変化を監視するのに適しています。プロモーター活性をモニタリングするために不安定化ルシフェラーゼレポーターと、単一細胞分解能でタンパク質ダイナミクスを可視化するためのルシフェラーゼ融合レポーターを使用しました。これらの生物発光レポーターは、急速な回転率を示し、非常に弱い信号を生成します。そこで、このようなかすかな信号を検出する高感度生物発光イメージングシステムを開発しました。これらの方法により、生きている細胞や組織における様々な遺伝子発現ダイナミクスをモニタリングすることが可能となり、実際の細胞状態を理解するのに役立つ重要な情報である。

遺伝子Hes1/7の表現は、様々な細胞株および通血中に2時間振動サイクルを示す。さらに、振動の期間は非常に短く、mRNAとタンパク質の両方が約20分の半減期で非常に不安定です。応答が遅いレポーターを使用すると、このような急速なダイナミクスを追跡することができず、安定したレポーターを使用すると、遺伝子発現が振動する間に徐々に蓄積します。したがって、レポーターは、このような周期的に発現される遺伝子の急速な回転を監視するために急速に分解されなければならない。これらの問題を克服するために、ルシフェラーゼレポーターを使用して発振器の動的発現を監視しました。生物発光レポーターは成熟時間が短く、感度が高いため、ウルトラジアン発振器の急速ダイナミクスを監視することができます。蛍光レポーターと同様に、ルシフェラーゼレポーターは、遺伝子コード配列に融合することによりタンパク質の発現ダイナミクスを監視することができます(図1A、図2Eおよび<strong ...

神経幹/前駆細胞は、細胞イベントの異なる結果につながるノッチシグナル伝達成分の様々な発現ダイナミクスを示す。このような動的発現は、遺伝子発現の急速な変化の可視化を可能にする高感度生物発光イメージングシステムを用いて、静的解析ではなくリアルタイムモニタリングによって明らかにすることができる。

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic ...

この方法は、細胞増殖と分化における遺伝子発現ダイナミクスの重要性、特に神経幹細胞におけるノッチシグナル伝達分子のダイナミクスに関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ライブイメージングによって非常に高精度でインビトロとインビボの両方の遺伝子発現を監視できることです。この手順を実証するのが、この新技術を開発した研究室の下條宏助教授です。NPCへのDll1 Fルシファーゼレポーターの導入については、胚の日12.5〜14.5妊娠中のマウスでペダル反射への応答の欠如を確認してから、正中線に沿って腹部を通して2〜3センチメートルの切開を行う。切開の周りにPBS浸しガーゼを置き、リング状の鉗子を使用して慎重に右の子宮ホーンを抽出します。胚を数えた後、マイクロキャピラリーを使用して、混合Dll1 FルシフラーゼレポーターDNAの1〜2マイクロリットルを各胚のテレンセバロンの心室に注入する。注射が成功すると、子宮の表面に青い染料が観察されます。エレクトロポレーションの場合は、PBSで子宮と電極を湿潤し、第1の胚の頭部を軽くつかむ。正に荷電した電極をDNAが注入された半球の側に設定し、30~50ボルトの50ボルトのパルスを5個提供し、パルス間に1秒間の休止を行い、負に帯電した電極から気泡が発生することを確認します。すべての胚が注入されたら、左子宮角を腹部に戻し、17ミリメートルの針を使って4-0シルク縫合糸で切開を閉じ、閉鎖を完了する前に腹腔に温かいPBSを入れる。解離されたNPC培養を設定するには、胚の日12.5から14.5の妊娠中のDll1ユビキチン化されたルシフェラーゼトランスジェニックマウスから25ミリリットルの氷冷PBSを含む10センチメートルのペトリ皿に子宮を置き、マイクロハサミと細かい鉗子を使用して子宮から胚を取り除きます。胚を切断した後、氷冷DMEM/F12を含む新しい10センチメートルのペトリ皿に頭部を置き、各脳を取り巻く表皮および軟骨を取り除く。3ミリリットルの氷冷N2B27培地を含む解剖顕微鏡の下で、脳を35ミリメートルの皿に移します。右と左のテレンスファロンを、ジエンスファロンから取り出します。細かい鉗子を使用して、テレンセバロンの表面を覆う髄膜を取り除き、テレンセックスの側側部分をテレンセグロンから解剖する。目的の神経組織がすべて単離されたら、P1000ピペットを使用してサンプルを個々の1.5ミリリットルチューブに移し、P200ピペットを使用して各チューブから余分な培地を吸引します。皮質対当たり100マイクロリットルのパパイン溶液を加え、サンプルを摂氏24度で15分間置きます。インキュベーションの最後に、サンプルを新しいP1000ピペットで10回そっとピペットし、チューブを摂氏24度に戻します。インキュベーションの終了時に、サン

real-time-bioluminescence-imaging-notch-signaling-dynamics-during

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

現在のビデオは、開発ゼブラフィッシュの脳内の個々の神経前駆細胞のライブイメージングを実行するためのエレクトロポレーション、共焦点顕微鏡の組み合わせを活用する方法を示しています。...

開発ゼブラフィッシュ前脳におけるクローン関連の神経前駆細胞のタイムラプスライブイメージング

リアルタイムでイメージング胚組織では、長期間にわたって挑戦されています。ここでは、高い空間分解能と時間分解能で長時間ニワトリ脊髄の細胞とサブ細胞の変化を監視するためのアッセイを示す。この手法は、神経系や胚の他の地域に適応することができます。...

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ここでは、のために必要なツールを開発...

ex vivoでマウス神経上皮における単一細胞分裂のライブイメージング

出典:Breid, S., et.al. α-Synuclein Fibrilsの末梢接種後のトランスジェニックマウスにおける神経炎症の生物発光イメージング。J. Vis. Exp.

トランスジェニックマウスにおける神経炎症の生物発光イメージング

出典:Ciraku, L., et.alです。乳がんの脳転移性腫瘍の成長を研究し、標的とするためのex vivo Brain Sliceモデル。J. Vis. Exp.(2021).このビデオは、器官型マウス脳スライスにおけるルシフェラーゼ発現腫瘍細胞のイメージングを示しています。ルシフェリンを培地に添加し、プレートをin...

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出典: Shimojo, H., et al.マウス神経新生中のノッチシグナル伝達動力学の実時間生物ルミネセンスイメージングJ. Vis.

3次元イメージングによる脳スライスにおけるリアルタイム遺伝子発現モニタリング

出典: Weber, R. Z., et al., Inbrainrebral Transplantation and in vivo Bioluminescence Tracking of Human Neural Progenitor Cells in the Mouse Brain.J. Vis. 経験。 (2022年)このビデオでは、マウスの脳に注入された遺伝子組み換えヒト神経前駆細胞のin...

マウス脳におけるヒト神経前駆細胞のin vivo生物発光イメージング

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学ぶマウス神経幹細胞におけるノッチシグナル伝達の動態解析。高感度バイオルミネセンスイメージングシステムを用いて、遺伝子発現のリアルタイムモニタリングを実現し、細胞増殖と分化のメカニズム解明に貢献します。

マウス神経新生時のノッチシグナル伝達ダイナミクスのリアルタイム生物発光イメージング

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