エピジェネティックベースの定量PCRを用いた免疫細胞の同一性と純度の測定
February 19th, 2020
ここでは、定量PCR(qPCR)を用いて検出されたエピジェネティックシグネチャを通じて免疫細胞の同一性と純度を決定する堅牢な方法について説明します。特定の遺伝子座でのDNA脱メチル化は、特定の細胞タイプの一意の識別子として機能し、CD8+、調節、またはTh17 T細胞の識別を可能にします。
このプロトコルは、免疫細胞の同一性と純度を決定するための標準化された方法を提供し、大規模なサンプル要件、ユーザー間の変動性の高さ、および主観的なデータ分析などのフローサイトメトリーの制限に対処する。このアッセイには、免疫細胞の同一性と純度を客観的に評価できる自動化されたデータ分析テンプレートが含まれています。これは、複数のアッセイ制御と共に、免疫細胞の同一性および純度を評価するためのターンキー、簡単に標準化された方法を提供する。
この技術を実証することは、私たちの研究室の科学者であるジェリー・グスマンです。目的の造血細胞試料からゲノムDNAを単離した後、260、280および230ナノメートルで光学密度を得ることによって分光光度計上のサンプルの純度を測定するために、ゲノムDNAの1マイクロリットルを使用する。次に、ゲノムDNAサンプルの400〜1200ナノグラムを、ゲノムDNA分離キットからの溶出バッファーを有する142マイクロリットルの最終体積に希釈する。
67マイクロリットルの溶出バッファーに口径測定器の75マイクロリットルを加えます。そして、溶出バッファーを有する全体積142マイクロリットルに対して、参照ゲノムDNAの1200ナノグラムを希釈した。その後、サーマルミキサーで56°Cで5分間、毎分900回転のチューブをインキュベートします。
バイ亜硫酸塩変換の場合は、270マイクロリットルの亜硫酸アンモニウムと90マイクロリットルのTHFAを全てのチューブに加えます。そして、徹底的な混合を確実にするためにチューブを渦。サンプルを簡単にスピンダウンして液体を収集し、1分あたり80°Cで45分間サーマルミキサーにチューブを置きます。
その後、サンプルをもう一度簡単に回転させ、室温まで3〜5分間冷却します。バイサルファイト変換後のDNA精製のために、30秒間のDNA単離常磁性ビーズをボルテックス。ボトルに記載されているボリュームに応じて、洗浄バッファーにエタノールとイソプロパノールを追加します。
再び渦は、ビーズが完全に再懸濁され、870マイクロリットルのリシス結合バッファーと各チューブへのDNA結合常磁性ビーズの105マイクロリットルで再び起こった。サンプルを短時間回転させる前に混合するチューブを渦。各チューブに570マイクロリットルの2-プロパノールを加え、渦を混ぜて混ぜます。
チューブを室温で7分間、毎分50 RPMでインキュベートしてから、チューブを再び短時間回転させ、5分間磁気ラックに置きます。インキュベーションの終わりにビーズを邪魔することなく、スーパーネートを除去します。サンプルをバッファー 1 で洗浄し、チューブを渦液にします。
短い遠心分離の後、チューブをラックに3分間戻し、ビーズを邪魔することなくスーパーネートを取り外します。洗浄バッファー 2 でサンプルを 2 回洗浄し、チューブを摂氏 65 度で 15 分間乾燥させます。次に、各チューブに60マイクロリットルの進化バッファーを追加します。
室温で7分間のインキュベーションと毎分1400回の回転の後、チューブを短時間回転させ、チューブを磁石に2分間戻します。インキュベーションの終わりに、バイサルファイトの55マイクロリットルをビーズを邪魔することなく新しいチューブに変換したDNA。サンプルに対して定量 PCR を実行するには、定量 PCR ソフトウェアで各標準のタスク標準を割り当て、表に従って最終的なコピー番号を指定します。
標準的なDNAの連続希釈を調製し、ターゲット細胞タイプのための1つの定量PCRマスターミックスカクテルを準備する。そして、表によると、GAPDH用の定量PCRマスターミックスカクテル1種。テンプレートDNAの3マイクロリットルを96の丸みを帯びた底板の適切な井戸にロードし、続いて7マイクロリットルのマスターミックスをロードします。
すべてのウェルがロードされたら、定量PCRフィルムでプレートをシールし、定量PCR機器にロードする前にプレートを短時間回転させます。次に、表に示された反応を実行します。実行完了時に、定量 PCR データを txt または xlsx ファイルとしてエクスポートします。
示されているように亜硫酸塩変換DNAを常磁性ビートで精製した後、DNAの25マイクロリットルを溶出する。バイサルファイト変換DNAを新しいチューブに移し、サンプルの2マイクロリットルを個々のPCRストリップチューブに加えます。2マイクロリットルの水をテンプレートコントロールチューブに加え、テーブルに従ってすべてのサンプルに対してプリアンプ化マスターミックスを準備します。
各チューブとキャップ、渦にマスターミックスの23マイクロリットルを追加し、チューブを簡単にスピンダウンします。次に、熱蓋を使用してサーモサイクラー上でプリアンプ化プロトコルを実行します。ランが完了した後、チューブを短時間回転させ、増幅されたDNAのマイクロリットルに新しいチューブに移します。
その後、78マイクロリットルの水でサンプルを1〜40濃度に希釈し、サンプルの定量PCRを実行します。ここで、フローサイトメトリーおよびメチル化アッセイを用いて3つの異なるドナーから末梢血、単核細胞、およびT細胞の両方を分析したCD8+T細胞アッセイからの代表的なデータが示されている。両方の細胞タイプのすべてのドナーにわたる2つの方法の間の傾向は同様であった。
Tregアッセイからのこれらの代表データもまた、方法間で同様の結果を示す。しかし、すべての場合において、このメチル化アッセイは、刺激された条件と刺激されない条件の両方で高い値を生み出した。各アッセイの感度と特異性は、ブランクの限界、検出の限界、および定量値の限界によって実証されました。
このアッセイは自動化されたデータ分析テンプレートを提供するので、客観的な分析を改善し、標準化能力を高める。これは、一貫した細胞治療製品を作成するために標準化された方法が重要な細胞治療の製造に最適です。
概要
この記事では、定量的PCR（qPCR）で検出されるエピジェネティックな特徴を用いて、免疫細胞の同定と純度を決定するための標準化された方法を提示します。この方法はフローサイトメトリーの限界に対処し、客観的な評価のための自動化されたデータ分析テンプレートを提供します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 免疫学
- 細胞生物学
- エピジェネティクス
背景
- フローサイトメトリーのような従来の方法には、高い変動性や大量のサンプル要件などの限界があります。
- エピジェネティックな特徴は、特定の免疫細胞タイプのユニークな識別子として機能します。
- 細胞分析の標準化は、研究と治療における一貫した結果を得るために重要です。
- この方法は、免疫細胞の特徴付けの信頼性を向上させます。
研究の目的
- 免疫細胞の同定と純度の評価のための堅牢な方法を開発すること。
- ユーザーの変動性を最小限に抑えるフローサイトメトリーの代替手段を提供すること。
- 細胞療法製造におけるアッセイの標準化を強化すること。
使用された方法
- 造血細胞サンプルからのゲノムDNAの分離。
- DNAメチル化分析のためのビスルファイト処理。
- エピジェネティックな特徴を測定するための定量的PCR。
- 結果の客観的な評価のための自動化されたデータ分析。
主な結果
- メチル化アッセイは、異なる細胞タイプにわたってフローサイトメトリーと比較して高い値を示しました。
- CD8+ T細胞と制御性T細胞のアッセイでも同様の傾向が観察されました。
- アッセイは高い感度と特異性を示しました。
- 自動化された分析は、結果の客観性と標準化を向上させました。
結論
- この方法は、免疫細胞分析の信頼できる代替手段を提供します。
- 標準化により、研究における結果の再現性が向上します。
- このアプローチは、細胞療法製造の応用に有益です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Accurate immune cell identity and purity assessment is critical for cell therapy development, impacting both product consistency and regulatory compliance. This epigenetic-based qPCR method addresses the limitations of flow cytometry by enabling objective, high-throughput, and standardized quantification of immune cell subtypes. Its robust, automated analysis supports reliable in-process and product release testing, enhancing predictive confidence at key manufacturing inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables objective quantification of immune cell subtypes for functional target validation.
- Reduces mechanistic ambiguity by leveraging cell-type specific epigenetic markers.
- Supports predictive confidence in immune cell-based therapeutic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated immune cell populations for downstream assays.
- Improves assay reproducibility and standardization through automated data analysis.
- Enables high-throughput, quantitative assessment of cell identity and purity.
- Supports reliable evaluation of cell therapy product attributes.
Translational & Preclinical Research
- Aligns immune cell characterization with translational biomarker requirements.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by standardizing cell identity assessment.
- De-risks advancement decisions by providing robust, quantitative purity data.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the cell therapy pipeline from early discovery through manufacturing quality control, supporting both lead identification and product release.
- Discovery Biology: Provides quantitative, cell-type specific data for hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Delivers standardized, reproducible outputs suitable for high-throughput workflows.
- Analytics: Generates quantitative purity and identity metrics for cross-condition comparison.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and preclinical model validation.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, standardized platform for immune cell analysis across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces biological risk in cell therapy development.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput in immune cell characterization.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by providing robust, objective data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of cell therapy candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in genomic DNA isolation, bisulfite conversion, and qPCR analysis.
- Needs access to spectrophotometry, thermal mixers, magnetic racks, and qPCR instrumentation.
- Demands cross-team standardization of assay setup and data analysis templates.
- Adaptation may be needed for different immune cell subtypes or sample sources.
- Assay sensitivity and specificity are defined by established limits of blank, detection, and quantitation.
