Name: エピジェネティックベースの定量PCRを用いた免疫細胞の同一性と純度の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 学ぶエピジェネティックベースの定量PCRを用いた免疫細胞の同一性と純度の測定法。フローサイトメトリーの限界を克服し、自動化データ解析テンプレートで客観的評価を実現する標準化手法です。

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このプロジェクトは、サーモフィッシャー科学内壁助成金によって資金提供されました。

すべてのヒトサンプルは、人間の研究倫理に関するガイドラインに従って商業的な情報源から得られた。
1. ゲノムDNA分離
注:ゲノムDNA単離は、末梢血単核細胞(PBMCs)、精製T細胞、その他の造血細胞型などの造血細胞から市販のキット(材料表を参照)を使用して行われます。本実験では、3種類のヒトドナー由来の末梢血単核細胞(PBMcCs)およびT細胞を用いた。
<ol><li>1-2 x 106造血細胞を円錐形の管に入れ、遠心分離機を400 x gで10分間置きます。</li>
	<li>上清を完全に吸引する。</li>
	<li>350 μLのリシス/結合バッファーをサンプルに加え、55°Cで10分間インキュベートします。</li>
	<li>プロテナーゼK(20 mg/mL)を30秒の細胞懸濁液と渦の350μLに50μL添加します。</li>
	<li>50 μLのDNA結合常磁性ビーズと400μLのイソプロパノールを100%イソプロパノールを加え、室温(RT)で3分間インキュベートします。</li>
	<li>2分間の磁気ラックにチューブを置き、ビーズを邪魔しないように注意して上清を取り外します。DNAはこのステップで磁気ビーズに結合されます。</li>
	<li>950 μLの洗浄バッファ1を加えます。30 sの渦とステップ1.6を繰り返します。</li>
	<li>手順 1.7 を繰り返します。</li>
	<li>950 μLの洗浄バッファ2を加えます。30 sの渦とステップ1.6を繰り返します。</li>
	<li>100 μLの溶出バッファーとボルテックスを2分間マグネットスタンドに1分間置き、gDNAを含む上清を新しいチューブに移します。</li>
	<li>造血細胞から分離されたgDNAの1μLを使用して、260nm、280nm、および230nmでODを得ることによってフルオリメーターを用いて分光光測定法によってgDNAの純度を測定します。260 nm と 280 nm の光密度 (OD 比) の比が 1.7 ~ 2.0 で、OD 比が 260 ~ 230 nm の場合は 1.5 ~ 2.4 の間であることを確認します。</li>
</ol>2. サンプル調製
<ol><li>サーモミキサーを56°Cに予熱します。</li>
	<li>すべてのサンプル、キャリブレーター、および基準材料に対して、ラベル 2 mL チューブ。</li>
	<li>サンプルとキャリブレーターを、RTで溶出バッファー(ステップ1で使用するキットで入手可能)で希釈します。<ol>
<li>すべての実験サンプルについて、gDNAを142μLの総体積に希釈します。例えば、100 ng/μLで4μLのgDNAを138μLの溶出バッファーに希釈します。 注:400-1,200 ng gDNAをアッセイに使用できます。</li>
		<li>75 μLのキャリブレーターを総容量142μLに希釈します。</li>
		<li>TE (pH = 8.0) をブランクとして使用して、参照 gDNA 濃度を分光光度計で確認します。</li>
		<li>基準gDNAの1,000-1,200ngを総体積142μLに希釈します。例えば、100 ng/μLで10μLの参照gDNAを132μLの溶出バッファーに希釈します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>チューブを56°Cで900rpmで5分間、サーモミキサーでインキュベートします。サンプルを収集するためにチューブを簡単にスピンダウンします。</li>
</ol>3. 亜硫酸水素変換
注: 亜硫酸塩変換中のインキュベーション時間が推奨時間に従っていることを確認してください。オーバーインキュベーションまたはアンダーインキュベーションは、アッセイの結果に影響を与えます。
<ol><li>サーモミキサーを80°Cにセットします。</li>
	<li>270 μLの亜硫酸アンモニウムと90μLのテトラヒドロフルフリルアルコール(THFA)を全てのチューブに加えます。渦は完全に混合し、一時的に下部に液体を集めるためにサンプルをスピンダウンします。</li>
	<li>チューブを80°Cで900rpmで45分間サーモミキサーでインキュベートします。ヒートブロックを使用する場合は、インキュベーション中に4.5分ごとに1〜2sのチューブをボルテックスします。</li>
	<li>サンプルを簡単にスピンダウンし、ステップ4または5に進む前に3〜5分間RTまで冷却します。最終ボリュームは、500 μL程度にする必要があります。</li>
</ol>4. CD8 と Treg アッセイ
<ol><li>亜硫酸水素変換後のDNA精製 注:このステップは、亜硫酸水素塩変換DNAに関する市販のDNA精製キット(材料表を参照)を使用して行われます。試薬を使用する前にRTに温めしてください。<ol>
<li>精製を開始する前に、30sの渦をボルテックスしてDNA単離常磁性ビーズの均質混合物を作成し、ボトルに記載されている量に従って洗浄バッファーにエタノールとイソプロパノールを加え、ヒートブロックを65°Cに設定します。</li>
		<li>RTでは、ステップ3.4から各チューブに870μLのリシス/結合バッファーと105μLのDNA結合常磁性ビーズを加えます。完全に、かつ簡単にチューブをスピンダウンする渦。</li>
		<li>完全に混合する2プロパノールと渦の570 μLを加えます。</li>
		<li>熱ミキサーまたは標準的な回転ミキサーで50 rpmでRTで7分間のチューブをインキュベートします。</li>
		<li>チューブを簡単に回転させます。チューブを磁気ラックに置き、5分間インキュベートします。</li>
		<li>サンプルを磁気ラックに置いた状態で、ビーズを邪魔することなく上清を取り外します。 注:DNAはビーズに結合されています。</li>
		<li>磁気ラックからチューブを取り外し、900 μLの洗浄バッファー 1 を追加します。チューブをボルテックスしてビーズを完全に再サスペンずしてから、チューブを短時間回転させます。</li>
		<li>チューブを磁気ラックに戻し、3分間インキュベートします。</li>
		<li>サンプルを磁気ラックに置いた状態で、ビーズを邪魔することなく上清を取り外します。</li>
		<li>洗浄(4.1.7-4.1.9)を洗浄バッファ1で1回、次に洗浄バッファ2で2回繰り返します。</li>
		<li>上清を取り外した後、チューブを少し回転させて3分間磁気ラックに戻します。</li>
		<li>残留洗浄バッファー2をすべて取り外し、磁気ラックからチューブを取り外します。</li>
		<li>チューブのふたを65°Cで15分間開けてビーズを乾かします。</li>
		<li>各チューブに60μLの溶出バッファーを加え、RTで1,400rpmで7分間インキュベートします。あるいは、泡アダプターを使用して適度な速度で渦。</li>
		<li>チューブを簡単にスピンダウンし、磁気ラックの上に2分間置きます。</li>
		<li>ビーズを邪魔することなく、55 μLの溶出液を新しいチューブに移します。溶出物には、亜硫酸水素酸に変換されたDNAが含まれています。DNA濃度の測定は不要です。</li>
	</ol></li>
	<li>qPCR をセットアップして実行する<ol>
<li>qPCR マシンと、そのソフトウェアを動作させるコンピューターの電源を入れます。</li>
		<li>ソフトウェアのユーザー インターフェイスで、新しい実験を作成し、実験の実行に使用するブロックを選択します。</li>
		<li>実験の種類として[標準曲線]を選択します。</li>
		<li>該当する場合は、使用する検出化学を選択します。このアッセイは、TaqMan試薬を使用します。それ以外の場合は、パッシブリファレンスとしてROXを選択します。</li>
		<li>該当する場合は、計測器実行のプロパティを[標準]として選択します。</li>
		<li>ターゲット(例えば、FAMをレポーターとするGAPDHまたはCD8)と非蛍光クエンチャーを割り当てることによって、実験計画を定義します。</li>
		<li>標準、サンプル、およびコントロールのサンプル名を割り当てます。</li>
		<li>次に、qPCRプレートに従って各ウェル位置を割り当てます。各ウェルには、CD8 や GAPDH などのターゲットとサンプル名が必要です。各サンプルは三重で実行され、器械のための版のレイアウトに反映されなければならない。</li>
		<li>各標準を標準タスクに割り当て、表 1に従って最終コピー番号を指定します。</li>
		<li>サンプル、キャリブレータを割り当て、タスク[不明]を参照します。</li>
		<li>テンプレート コントロールのウェルをNTCまたはNとして指定します。</li>
		<li>標準として使用するラムダDNA(10ng/μL)の連続希釈を準備します(表1を参照)。</li>
		<li>qPCR マスターミックスカクテルを、ターゲットセルタイプ用とGAPDH用に用意します(表2を参照)。すべてのサンプル、標準、および NTC コントロールを三重に実行します。 注意: GAPDH は、セルの総数を定量化するために使用され、ターゲット増幅と並行して実行されます。CD8 B遺伝子の非メチル化調節要素のコピーは、CD8アッセイ、FoxP3でTreg、およびTh17のIL-17で測定される。</li>
		<li>qPCR には 96 ウェルプレートを使用します。最初に3 μLのテンプレートDNAを井戸にロードします。次に、マスターミックスの7μLをロードします。</li>
		<li>プレートを qPCR フィルムで密封し、プレートを短時間スピンダウンしてから qPCR 装置に入れします。</li>
		<li>表 3に示すように qPCR を実行します。</li>
		<li>実行の完了後、qPCR データを .txt または .xlsx ファイルとしてエクスポートします。</li>
		<li>CD8アッセイの分析テンプレートとTregアッセイ(材料の表を参照)を使用してデータを分析し、Ct平均、Ct標準偏差、コピー数を計算します。</li>
	</ol></li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>初期プラスミドコピー数/3 μL</td>
			<td>ボリューム</td>
			<td>希釈DNA [1]</td>
			<td>最終コピー数/3 μL</td>
			<td>ラベル</td>
		</tr>
<tr>
<td>31250</td>
			<td>1000 μL</td>
			<td>-</td>
			<td>31250</td>
			<td>STD#1</td>
		</tr>
<tr>
<td>31250</td>
			<td>200 μL</td>
			<td>800 μL</td>
			<td>6250</td>
			<td>STD#2</td>
		</tr>
<tr>
<td>6250</td>
			<td>200 μL</td>
			<td>800 μL</td>
			<td>1250</td>
			<td>STD#3</td>
		</tr>
<tr>
<td>1250</td>
			<td>200 μL</td>
			<td>800 μL</td>
			<td>250</td>
			<td>STD#4</td>
		</tr>
<tr>
<td>250</td>
			<td>200 μL</td>
			<td>800 μL</td>
			<td>50</td>
			<td>STD#5</td>
		</tr>
<tr>
<td>1250</td>
			<td>30 μL</td>
			<td>1200 μL</td>
			<td>30</td>
			<td>STD#6 [2]</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">[1] TEの10 ng/μLラムダDNA(10 mMトリス、1 mM EDTA、pH 8.0)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">[2] STD#3 を使用して STD#6 を準備する</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:標準的な希釈液の調製。31250-30コピーにまたがる4対4希釈基準は、希釈剤としてTE/λDNAを用いてテーブルに従って調製した。同じ標準希釈液を CD8 と GAPDH の両方に使用しました。標準は-20°Cで保管した。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>試薬</td>
			<td>量</td>
		</tr>
<tr>
<td>ラムダDNA(TEで50ng/μL、pH8.0)</td>
			<td>1 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>タクマンアッセイ</td>
			<td>0.5 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>水、ヌクレアーゼフリー</td>
			<td>0.5 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>マスターミックス</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>合計</td>
			<td>7 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>表2:qPCRカクテルの調製表に従ったテンプレートDNAを除き、CD8とGAPDH用の2つの別々のチューブにqPCRマスターミックスを準備します。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ステップ</td>
			<td>時間</td>
			<td>温度</td>
			<td>サイクル</td>
		</tr>
<tr>
<td>プレインキュベーション</td>
			<td>35分</td>
			<td>95°C</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">増幅</td>
			<td>15秒</td>
			<td>95°C</td>
			<td rowspan="2">50倍</td>
		</tr>
<tr>
<td>1分</td>
			<td>61°C</td>
		</tr>
<tr>
<td>クールダウン</td>
			<td>5秒</td>
			<td>42°C</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
</tbody></table>表3:CD8およびTregアッセイのqPCR実行パラメータqPCR は、表に指定されたパラメーターに従って実行されました。
5. Th17アッセイ
<ol><li>亜硫酸水素変換後のDNA精製<ol>
<li>セクション 4.1 に記載されている精製手順を実行します。</li>
		<li>サンプルを溶出するには、各チューブに25μLの溶出バッファーを加え、RTで1,400rpmで7分間インキュベートします。あるいは、泡アダプターを使用して適度な速度で渦。</li>
		<li>チューブを簡単にスピンダウンし、2分間磁気ラックに置きます。</li>
		<li>ビーズを邪魔することなく、20 μLの溶出液を新しいチューブに移します。溶出物には、亜硫酸水素酸に変換されたDNAが含まれています。</li>
	</ol>
</li>
	<li>DNAのプリアンプ 注: DNAのプリアンプは、qPCR19による正確な定量化のために、低い存在量の標的に推奨されます。Th17メチル化アッセイは、この理由のためにプリアンプを必要とするように設計されました。<ol>
<li>2 μLの亜硫酸水素変換DNAをPCRストリップチューブに移します。2 μLの水でNTCチューブを作成します。</li>
		<li>すべてのサンプルに対してプリアンプマスターミックスを作成します(表4を参照)。</li>
		<li>各チューブにマスターミックスを23μL加えます。チューブ、渦をキャップし、チューブを短時間スピンダウンします。</li>
		<li>熱い蓋を使用してサーモサイクラーでプリアンププロトコルを実行します。(表 5)。実行が完了したら、チューブを短時間スピンダウンします。</li>
		<li>増幅されたDNAの2μLを新しいチューブに移し、78μLの水を加え、サンプルを1:40に希釈します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>qPCR の設定と実行<ol>
<li>セクション 4.2 に従って qPCR をセットアップし、実行します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Th17 アッセイの分析テンプレート(材料の表を参照)を使用してデータを分析し、Ct 平均、Ct 標準偏差、コピー数を計算します。</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>試薬</td>
			<td>量</td>
		</tr>
<tr>
<td>水、ヌクレアーゼフリー</td>
			<td>9.5 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ホットスタート PCR マスターミックス</td>
			<td>12.5 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Th17 PCR プライマー</td>
			<td>1 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>合計</td>
			<td>23 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>表4:Th17アッセイのDNAを予増幅する。予増幅反応マスターミックスをテーブルに従って調製した。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ステップ</td>
			<td>時間</td>
			<td>温度</td>
			<td>サイクル</td>
		</tr>
<tr>
<td>プレインキュベーション</td>
			<td>35分</td>
			<td>95°C</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
<tr>
<td>変性</td>
			<td>1分</td>
			<td>95°C</td>
			<td rowspan="3">12倍</td>
		</tr>
<tr>
<td>焼鈍</td>
			<td>45秒</td>
			<td>55°C</td>
		</tr>
<tr>
<td>伸長</td>
			<td>30秒</td>
			<td>72°C</td>
		</tr>
<tr>
<td>最終伸長</td>
			<td>10分</td>
			<td>72°C</td>
			<td rowspan="2">1X</td>
		</tr>
<tr>
<td>保持</td>
			<td>不定</td>
			<td>4°C</td>
		</tr>
</tbody></table>表5:Th17 DNAを前駆増幅する。Th17 DNAは、実際のqPCRの前に12サイクル予増幅した。

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</ol>

スマン・K・プラダン、ジェリー・グスマン、カール・ダルギッツ、マーク・ランドン、ウマ・ラクシュミパシーはサーモフィッシャーサイエンティフィックに採用されています。スヴェン・オレク、ビョルン・サマンス、ウルリッヒ・ホフミューラーは、それぞれエピオンティス社の創設者兼従業員です。この原稿の制作には、執筆支援は利用されなかった。

新しい免疫療法の出現により、免疫細胞の同一性および純度を検出する標準化された方法が必要である。堅牢で検証済みでスケーラブルなインプロセスおよびリリーステストの評価方法は、依然として確立されており、細胞ベースの治療法の商業化に大きな課題となっています。フローサイトメトリーは現在、免疫細胞のフェノタイピングの最も一般的な方法ですが、サンプルの品質と量の要件が高いため、通常の使用が困難です。また、良好な製造実務(GMP)環境でフローサイトメトリーを実施することは、使用される各マーカーに対する基準基準のオペレータ依存戦略および基準要件によって制限される13、14。自動gatingは、アッセイの堅牢性を向上させるために示されていますが、それはまだ確立された品質管理戦略ではありません。遺伝子発現プロファイリングは、細胞療法の製品のアイデンティティと純度を特徴付けるためにも使用できますが、データは半定量的で労働集約的です。さらに、RNAおよびマイクロRNAはDNAよりも比較的安定しており、堅牢で再現性の高い結果の欠如に寄与する可能性があります。したがって、特定の遺伝子座のエピジェネティックDNAメチル化状態を利用することで、目的の細胞タイプを同定および定量する、安定した、実行が容易で、堅牢でスケーラブルな方法が提供される。
表現型細胞に対するメチル化パターンの検出は、3つの重要なステップに依存する:まず、アッセイは、記載された方法に従って単離されるgDNAの使用を必要とする。高品質のDNAが必要であり、使用しない場合、亜硫酸水素酸変換は23、24に影響を受ける可能性があります。低品質のDNAが得られる場合は、アッセイ信頼性を確保するためにさらなる精製が推奨される。第二に、非メチル化シトシンからウラシルへの亜硫酸水素変換が成功することが必要である。亜硫酸水素変換における最も重要なステップは、DNA変性23、25である。亜硫酸水素ナトリウムとは対照的に、亜硫酸アンモニウムを用いた高温変性は、変換効率と一貫性を高め、これらのアッセイ25、26に推奨されるプロセスである。ユーザーは、反応が80°Cで起こること、およびサンプル混合が頻繁に行われることを確認する必要があります。これらの理由から、デジタルサーモミキサーを使用することをお勧めします(資料の表を参照)。第3に、qPCR調製の間は適切なピペッティング技術に従わなければならない。qPCR反応の際に3つの技術的な複製が必要であり、定量的リアルタイムPCR実験(MIQE)ガイドライン27の公表のための最小情報に従う。より技術的な複製を含めることは許容できますが、必須ではありません。不適切なピペット法や技術的な複製を含まない場合、信頼性の低いqPCR結果が得られます。
重要なステップに従い、望ましい結果がまだ得られない場合、アッセイ内の複数のコントロールを活用して問題を特定できます。適切な亜硫酸水素変換は、このアッセイの最も重要なステップです。不適切な亜硫酸水素変換は、解析テンプレートによって計算されたキャリブレーション係数や参照値の失敗によって強調表示されます。亜硫酸水素酸変換が誤って行われた場合(例えば、反応がRTで行われた場合)、qPCR中に増幅は行われません。また、qPCR反応調製の間にエラーが発生した場合(例えば、qPCRマスターミックスが添加されていない場合など)、増幅は見られない。これら 2 つの問題は、標準サンプルを調査することによって分離できます。標準サンプルにおける増幅は、参照、キャリブレータ、および実験サンプルではなく、亜硫酸水素変換が正しく行われなかったことを示すであろう。いずれのサンプルにも増幅が行われない場合、qPCR が正しく実行されなくなったことが示されます。
このアッセイは、他の表現型化方法、特にフローサイトメトリーに関連する厳しいサンプル要件と分析変動に対処しますが、注意が必要な制限があります。このアッセイは、標的セルの一意の識別子として使用される単一の軌跡を対象としており、フローサイトメトリーで一般的に行われる多重解析を禁止しています。これにより、Th17 のような複雑な細胞型の識別が困難になります。しかしながら、単一の遺伝子座でのメチル化パターンの使用は、複数の細胞の正確なパターン化マーカーであることが示されており、15、16の複数の臨床試験で使用されている。これは、特に、FOXP3メチル化シグネチャを評価することが、一過性のFOXP3発現細胞28から真のTregsを検出するための正確かつ明確な方法であるTregsに当てはまる。多重解析の損失は、問い合わせた遺伝子座の精度によって補償されます。アッセイの将来の反復は1つのqPCR反応の多数の遺伝子座の検出を可能にする複数のqPCR染料およびクエンチャーを含むことができる。
このアッセイは、細胞表現型および同一性を決定する際のフローサイトメトリーの代替方法として使用することができる。なお、このアッセイは、フローサイトメトリーが行う正確な値を生み出さないことに留意すべきである(図1-3)。これは、フローサイトメトリーに関連するデータ解析の変動が原因です。ギート戦略に応じて、フローサイトメトリーの結果は大きく異なる場合があります。これは、IL-17のような細胞内標的を見るために複雑な染色プロトコルを使用する場合に特に当てはまり、変動係数(CV)は15%14と高くすることができる。複数のユーザーの間で、提示されたアッセイは一貫して<15%のCVを持ち、アッセイの堅牢性をサポートし、標準化機能を向上させました。細胞刺激が必要な場合は、エピジェネティックとフローサイトメトリーベースのフェノタイピングの最大の違いが見られます(図3)。フローサイトメトリーを介したTh17細胞の検出は、T細胞刺激および細胞内サイトカイン染色29、30、31に共通のプロトコルを用いて達成された。エピジェネティック測定とフローサイトメトリーの間のTh17フェノタイピングに見られる違いは、IL-17産生の運動学に起因する可能性があります。メチル化シグネチャは安定しているが、タンパク質産生には時間がかかり、蛍光抗体20、32によって検出される十分な量で存在しなければならない。タンパク質輸送阻害剤と細胞刺激カクテルによる6時間のインキュベーションは、エピジェネティックベースのフェノタイピング法を介して検出されたTh17細胞のレベルを見るために拡張する必要があるかもしれません。値が一致しない正確な理由を特定し、最も正確なフェノタイピング方法を決定するために、より多くの研究が必要です。
本報告では、細胞の異種混合で免疫細胞の種類を同定し、定量する方法を、単純かつ堅牢な方法で詳述する。アッセイは、細胞ベースの治療薬のインプロセスおよびリリース試験に使用する可能性を目的として設計および最適化されています。記載されたアッセイは、細胞療法用途で使用される高度な資格を持つ原材料の要件を満たしています。安定性、サンプル要件、前刺激、細胞内染色のための細胞透過、データ分析の主観性などのフローサイトメトリーおよび他の分子方法の欠点に対処することにより、記載されたアッセイが一致している細胞ベースの治療法の商業化を目標に。

細胞免疫療法におけるT細胞の使用は、特にキメラ抗原受容体(CAR)T細胞技術の出現に伴い、過去10年間で有意に増加している。T細胞ベースの治療法は大きな臨床的成功を収めていますが、異質であり、細胞特性とアイデンティティはドナー間で大きく異なる可能性があります2.T細胞集団の不均一性は、治療効果に大きな影響を与え、臨床試験からの結論を複雑にすることができます。このため、T細胞免疫療法の最適な処方を決定するために、製品製造および製剤中にT細胞の不均一性を理解することが重要です。
広い意味では、T細胞は、免疫調節性サイトカインを分泌するCD4+ヘルパーT細胞と、主要組織適合性複合体(MHC)I分子上で同調抗原を提示する細胞を直接溶け込むCD8+細胞傷害性T細胞の2つのグループに分けることができます。CD4+ ヘルパー T 細胞は、サイトカインのユニークなセットを生成する特定のサブセットの無数に分化できます。いくつかは、最終的な細胞製品におけるCD4+とCD8+T細胞の定義された比率がin vivoの有効性および持続性を最大化することを示唆しているが、細胞製造を複雑にする可能性がある3。制御性T細胞(Tregs)は、CD4+ T細胞のサブセットであり、免疫抑制であり、免疫細胞の活性化を減少させる。調節性T細胞は、腫瘍耐性を媒介する際に関与しており、かつ、CAR T細胞製造中に存在する場合、CAR T細胞4、5、6の抗腫瘍免疫応答を阻害することができる。Tヘルパー17(Th17)T細胞などの他のCD4+サブセットは、腫瘍クリアランスを促進し、T細胞療法の有効性を高めるために利用することができる。したがって、Th17 CD4+T細胞の増加は、インターロイキン17の産生増加(IL-17)が抗腫瘍免疫応答5、7、8、9を促進する固形腫瘍設定において特別な関心事である。腫瘍応答におけるTh17細胞の重要性を理解することは、これらの細胞をvitro7で生成するための戦略に関するより多くの調査を促したしたがって、これらのT細胞サブセットを検出する方法は、T細胞療法を最適化するために重要であり、堅牢で、容易で、スケーラブルで、再現可能でなければなりません。
フローサイトメトリーは、免疫細胞の同一性を決定する最も一般的な方法です。しかし、フローサイトメトリーは、彼らが収穫された同じ日に分析されなければならない生きている、無傷の細胞を必要とします。細胞内サイトカイン染色(ICS)の場合、T細胞内にサイトカインを保持するためにはタンパク質分泌阻害が必要です。しかしながら、異なる阻害剤化合物は、特定のサイトカインの分泌に差異効果を有し、関心のあるサイトカインの検出のための特殊なカクテルを作成することをユーザーに強制する10,11。さらに、フローサイトメトリーの忠実度は、標的に特異的かつ強力に結合する抗体クローンに依存する。異なる抗体クローンの使用は、様々な結果を引き起こし、不正確な結論を引き起こす可能性があり、その方法は12を標準化することが困難である。また、フローサイトメトリーを介して収集されたデータの分析、およびデータから導かれた結論は、ゲートの設定方法に基づいてユーザ間で大きく異なる場合があります13,14。これらの理由から、フローサイトメトリーは細胞療法開発の間に精密な品質管理のために理想的ではない。
特定遺伝子遺伝子座におけるゲノムメチル化の評価は、細胞同一性を決定する代替方法である。DNAメチル化を使用して特定の細胞タイプを同定する根拠は、複数の記事に記載されており、所定の細胞集団15、16、17に存在する特定のメチル化パターンに依存している。標的細胞では、特定の部位は非メチル化ヌクレオチドを含み、非標的細胞ではこれらの部位はメチル化される。このパターンは、亜硫酸水素変換を通じて検出することができ、非メチル化シトシンヌクレオチド(C)をウラシル(U)に排他的に変換するプロセスである。プライマーおよびプローブは、変換された部位に対して設計することができ、その後、qPCR16を介して増幅および検出される。
本明細書に記載されるアッセイは、ハウスキーピング遺伝子と比較して特定の非メチル化遺伝子座の数を定量することにより、異種集団内の免疫細胞サブタイプの頻度を測定する。CD8 B遺伝子の非メチル化調節要素のコピーは、このアッセイにおいてCD8アッセイ、トレッグ中のFoxP3、およびTh17のIL-17で測定される。これらの遺伝子座は、目的の特定の細胞集団(例えば、CD8+T細胞)を単離し、その細胞型15のみの非メチル化された遺伝子座を同定するためにバイサルファイトシーケンシングを行うことによって同定された。プライマーとプローブは、独自に非メチル化された遺伝子座に対して開発され、サンプルはqPCRを介して分析されます。既知のコピー数の標準曲線は、高いコピー数標準プラスミドの希釈から作成され、Ct 値をトランスクリプトコピー番号に変換できます。
アッセイ性能を評価するためには、基準gDNAおよびキャリブレータープラスミドを含む対照試料が必要である。参照ゲノム材料は、既知の免疫細胞周波数を有する複数のドナーからのプール血液サンプルであり、品質管理(QC)アッセイ性能チェックに使用されます。キャリブレーターサンプルは、CD8、FoxP3、およびGAPDH遺伝子配列を等モル比で含む合成プラスミドである。異なるゲノム領域内の亜硫酸水素酸変換は効率が異なるため、亜硫酸水素変換効率の尺度として使用されます。キャリブレーター内のGAPDHに対する目標の比は1であるが、亜硫酸水素変換効率の違いのために、その比は変化し得る。このキャリブレーション係数は、CD8およびTregアッセイに適用されます。FoxP3は、Tregアッセイで使用される遺伝子であり、X染色体上に位置する。このアッセイはFoxP3の非メチル化コピーのみを測定し、FoxP3の1コピーのみがTregsで非メチル化されているため、このアッセイはセックスに依存なく、男性および女性の両方のサンプル18で使用することができる。Th17アッセイでは、キャリブレーターサンプルやGAPDHをハウスキーピング遺伝子として利用していない。代わりに、非Th17細胞に存在するメチル化された遺伝子座を標的とする別のプライマーセットが含まれ、細胞の総数はIL-17のメチル化および非メチル化コピーの合計によって反映される。qPCR から取得したデータは、データの品質管理チェックを実行し、開始母集団内のターゲット セルの割合を計算する事前設定分析テンプレートに入力されます。これにより、データ分析が自動化され、偏りのない結果が得られ、ユーザーの主観性が取り除かれ、標準化機能が向上します。
このアッセイはgDNAを用い、培養または固定細胞、または凍結細胞ペレットを用いた白血病法によって単離することができる。低サンプル要件、サンプル出発物質の柔軟性、高精度、および標準化された分析は、フローサイトメトリーに関連する制限に対処し、細胞治療プロセス開発中の品質管理目的に最適です。

<table><tbody><tr><td>2.0 ml Eppendorf Safe-Lock Tubes</td><td>Eppendorf</td><td>22363344</td><td></td></tr><tr><td>CD8 assay</td><td></td><td></td>用分析テンプレート<td><a href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/CTSPureQuantCD8plusTCellAssayAnalysisTemplate.xlsx">ここをクリック</a></td></tr><tr><td>Th17 assay</td><td></td><td></td><td>用分析テンプレート<a href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/CTSPureQuantTh17AssayAnalysisTemplate.xlsx">ここをクリック</a></td></tr><tr><td>Treg</td><td></td><td></td>アッセイ用分析テンプレート<td><a href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/CTSPureQuantTregAssayAnalysisTemplate.xlsx">ここをクリック</a</td></tr><tr><td>>Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer, blue/red/violet6/yellow</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A29004</td><td></td></tr><tr><td>CTS PureQuant CD8+ T-Cell Assay</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A43674</td><td></td></tr><tr><td>CTS PureQuant Th17 Assay</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A43676</td><td></td></tr><tr><td>CTS PureQuant Treg Assay</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A43675</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads SILANE Genomic DNA Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>37012D</td><td>バイサルファイト変換後のゲノムDNAの単離と精製に使用されます。サンプルを希釈するための溶出バッファーが含まれています。</td></tr><tr><td>DynaMag-2 マグネット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12321D</td><td>DNAの単離および精製中に磁気ラックとして使用</td></tr><tr><td>eBioscience エッセンシャルヒトT細胞表現型キット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A42923</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience エッセンシャルヒトTh1 / Th17表現型キット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A42927</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience エッセンシャルヒトTreg表現型キット</td><td>サーモフィッシャーScientific</td><td>A42925</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf SmartBlock 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>5362000035</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td></td></tr><tr><td>HulaMixer サンプルミキサー</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15920D</td><td>推奨サンプルミキサー</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND 1000</td><td></td></tr><tr><td>ノンスティック、RNaseフリー Microfugeチューブ、1.5 mL</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 12S Flex</td><td>Applied Biosystems</td><td>4470661</td><td></td></tr><tr><td>TE、pH 8.0、RNase-free</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9849</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H2KT17113</td><td></td></tr></tbody></table>

エピジェネティックベースの定量pcrを用いた免疫細胞の同一性と純度の測定

Determination of Immune Cell Identity and Purity Using Epigenetic-Based Quantitative PCR

免疫細胞サブタイプ集団頻度は、T細胞療法の有効性に大きな影響を及ぼし得る。フローサイトメトリーのような現在の方法は、特定のサンプル要件を有し、サンプル入力が高く、スループットが低く、標準化が困難であり、そのすべてが開発中の細胞療法製品の特性評価に有害であり、かつ製造。
本明細書で説明されるアッセイは、単離されたゲノムDNA(gDNA)を用いた細胞の異種混合物中の免疫細胞タイプを正確に同定し、定量する。DNAメチル化パターンは、非メチル化シトシンがウラシルに変換されるプロセスである亜硫酸水素変換を通じて明らかにされる。非メチル化DNA領域は、変換された領域を標的とするプライマーを用いたqPCR増幅を通じて検出されます。アッセイごとに1つの固有の軌跡が測定され、特定の細胞タイプの正確な識別子として機能します。アッセイは堅牢で、高いスループットでCD8+、制御性、およびTh17 T細胞を識別します。これらの最適化されたアッセイは、細胞療法プロセスのインプロセスおよび製品放出試験に使用できる可能性があります。

3 つのメチル化アッセイはすべて gDNA の入力から始まり、CD8+ T 細胞、Treg、または Th17 細胞の一部が細胞集団全体に含まれます。亜硫酸水素変換後のqPCRから生成されたデータを、提供された分析テンプレートを用いて分析した。このテンプレートでは、標準サンプルから取得した標準曲線を使用して、テストサンプルのターゲットのコピー数と総セル数を推定しました。次に、分析テンプレートに統合された数式を使用して、パーセントのセルの種類を計算しました。図1は、CD8+アッセイからの代表的なデータを、フローサイトメトリーと記載のメチル化アッセイの両方を用いて3種類のドナーから末梢血単核細胞(PBMCs)とT細胞の両方を分析した結果から得られた。両方の細胞型のすべてのドナーにわたる2つの方法の間の傾向は同様であった。図2は、Tregアッセイからの代表的なデータを示す。3つの精製Tregドナーを、メチル化ベースのqPCRおよびフローサイトメトリーの両方を用いて分析し、その結果を示すグラフ上にプロットした。どちらの方法でも結果は比較的類似していた。しかし、すべての場合において、フローサイトメトリーは、より高い値を生み出した。図3は、フローサイトメトリーとメチル化を介して検出されたTh17細胞の比較を示す。このグラフでは、実験法に対して刺激された条件と刺激されない条件がある。細胞はPMAおよびイオノマイシンによる刺激を必要とし、タンパク質輸送阻害剤による治療を必要とし、各細胞内に存在するIL-17Aの量を増加させ、フローサイトメトリー20を介して検出することができる。メチル化状態は、刺激状態に関係なく検出できます。フローサイトメトリーは、メチル化と比較してTh17細胞の低レベルを生み出した。アッセイの感度および特異性は、ブランク(LOB)の制限、検出限界(LOD)、および定量の制限(LOQ)値によって表6に示された。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60465/60465fig1.jpg"> 図1:3つの異なるドナーに対するPBMCとT細胞の両方のCD8+パーセンテージの流れとメチル化の比較。3つの異なるドナーからのPBMCおよびT細胞を、フローサイトメトリーまたはメチル化のいずれかを用いて全集団中のCD8+T細胞の割合についてアッセイした。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60465/60465fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60465/60465fig2.jpg"> 図2:3種類のドナーに対する精製Tregの流量とメチル化の比較精製されたTreg細胞は、フローサイトメトリーまたはメチル化のいずれかを用いて全集団中のTreg細胞の割合についてアッセイした。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60465/60465fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60465/60465fig3.jpg"> 図3:刺激実験群および刺激されない実験群に対するTh17パーセントの流量およびメチル化比較刺激および刺激されないT細胞は、フローサイトメトリーとメチル化の両方を用いて分析した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60465/60465fig3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>アッセイ</td>
			<td>Lob</td>
			<td>Lod</td>
			<td>ローク</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8</td>
			<td>0</td>
			<td>19</td>
			<td>52</td>
		</tr>
<tr>
<td>ガッド</td>
			<td>0</td>
			<td>7</td>
			<td>21</td>
		</tr>
<tr>
<td>フォックスP3</td>
			<td>0</td>
			<td>3</td>
			<td>12</td>
		</tr>
<tr>
<td>Th17 TpG</td>
			<td>0</td>
			<td>35</td>
			<td>73</td>
		</tr>
<tr>
<td>Th17 CpG</td>
			<td>0</td>
			<td>38</td>
			<td>73</td>
		</tr>
</tbody></table>表6:メチル化ベースアッセイのコピー数のLoB、LoD、LoQ。アッセイの感度および特異性は、MIQEガイドライン21、22によって得られるLoB、LoD、およびLoQ値によって詳述される。一般に、これらのアッセイによって正確に検出できるコピーは40個にしかなく、

ここでは、定量PCR(qPCR)を用いて検出されたエピジェネティックシグネチャを通じて免疫細胞の同一性と純度を決定する堅牢な方法について説明します。特定の遺伝子座でのDNA脱メチル化は、特定の細胞タイプの一意の識別子として機能し、CD8+、調節、またはTh17 T細胞の識別を可能にします。

エピジェネティックベースの定量PCRを用いた免疫細胞の同一性と純度の測定

Immune cell subtype population frequencies can have a large effect on the efficacy of T cell therapies. Current methods, like flow cytometry, have ...

このプロトコルは、免疫細胞の同一性と純度を決定するための標準化された方法を提供し、大規模なサンプル要件、ユーザー間の変動性の高さ、および主観的なデータ分析などのフローサイトメトリーの制限に対処する。このアッセイには、免疫細胞の同一性と純度を客観的に評価できる自動化されたデータ分析テンプレートが含まれています。これは、複数のアッセイ制御と共に、免疫細胞の同一性および純度を評価するためのターンキー、簡単に標準化された方法を提供する。この技術を実証することは、私たちの研究室の科学者であるジェリー・グスマンです。目的の造血細胞試料からゲノムDNAを単離した後、260、280および230ナノメートルで光学密度を得ることによって分光光度計上のサンプルの純度を測定するために、ゲノムDNAの1マイクロリットルを使用する。次に、ゲノムDNAサンプルの400〜1200ナノグラムを、ゲノムDNA分離キットからの溶出バッファーを有する142マイクロリットルの最終体積に希釈する。67マイクロリットルの溶出バッファーに口径測定器の75マイクロリットルを加えます。そして、溶出バッファーを有する全体積142マイクロリットルに対して、参照ゲノムDNAの1200ナノグラムを希釈した。その後、サーマルミキサーで56°Cで5分間、毎分900回転のチューブをインキュベートします。バイ亜硫酸塩変換の場合は、270マイクロリットルの亜硫酸アンモニウムと90マイクロリットルのTHFAを全てのチューブに加えます。そして、徹底的な混合を確実にするためにチューブを渦。サンプルを簡単にスピンダウンして液体を収集し、1分あたり80°Cで45分間サーマルミキサーにチューブを置きます。その後、サンプルをもう一度簡単に回転させ、室温まで3〜5分間冷却します。バイサルファイト変換後のDNA精製のために、30秒間のDNA単離常磁性ビーズをボルテックス。ボトルに記載されているボリュームに応じて、洗浄バッファーにエタノールとイソプロパノールを追加します。再び渦は、ビーズが完全に再懸濁され、870マイクロリットルのリシス結合バッファーと各チューブへのDNA結合常磁性ビーズの105マイクロリットルで再び起こった。サンプルを短時間回転させる前に混合するチューブを渦。各チューブに570マイクロリットルの2-プロパノールを加え、渦を混ぜて混ぜます。チューブを室温で7分間、毎分50 RPMでインキュベートしてから、チューブを再び短時間回転させ、5分間磁気ラックに置きます。インキュベーションの終わりにビーズを邪魔することなく、スーパーネートを除去します。サンプルをバッファー 1 で洗浄し、チューブを渦液にします。短い遠心分離の後、チューブをラックに3分間戻し、ビーズを邪魔することなくスーパーネートを取り外します。洗浄バッファー 2 でサンプルを 2 回洗浄し、チューブを摂氏 65 度で 15 分間乾燥させます。次に、各チューブに60マイクロリットルの進化バッファーを追加します。室温で7分間のインキュベーションと毎分1400回の回転の後、チューブを短時間回転させ、チューブを磁石に2分間戻します。インキュベーションの終わりに、バイサルファイトの55マイクロリットルをビーズを邪魔することなく新しいチューブに変換したDNA。サンプルに対して定量 PCR を実行するには、定量 PCR ソフトウェアで各標準のタスク標準を割り当て、表に従って最終的なコピー番号を指定します。標準的なDNAの連続希釈を調製し、ターゲット細胞タイプのための1つの定量PCRマスターミックスカクテルを準備する。そして、表によると、GAPDH用の定量PCRマスターミックスカクテル1種。テンプレートDNAの3マイクロリットルを96の丸みを帯びた底板の適切な井戸にロードし、続いて7マイクロリットルのマスターミックスをロードします。すべてのウェルがロードされたら、定量PCRフィルムでプレートをシールし、定量PCR機器にロードする前にプレートを短時間回転させます。次に、表に示された反応を実行します。実行完了時に、定量 PCR データを txt または xlsx ファイルとしてエクスポートします。示されているように亜硫酸塩変換DNAを常磁性ビートで精製した後、DNAの25マイクロリットルを溶出する。バイサルファイト変換DNAを新しいチューブに移し、サンプルの2マイクロリットルを個々のPCRストリップチューブに加えます。2マイクロリットルの水をテンプレートコントロールチューブに加え、テーブルに従ってすべてのサンプルに対してプリアンプ化マスターミックスを準備します。各チューブとキャップ、渦にマスターミックスの23マイクロリットルを追加し、チューブを簡単にスピンダウンします。次に、熱蓋を使用してサーモサイクラー上でプリアンプ化プロトコルを実行します。ランが完了した後、チューブを短時間回転させ、増幅されたDNAのマイクロリットルに新しいチューブに移します。その後、78マイクロリットルの水でサンプルを1〜40濃度に希釈し、サンプルの定量PCRを実行します。ここで、フローサイトメトリーおよびメチル化アッセイを用いて3つの異なるドナーから末梢血、単核細胞、およびT細胞の両方を分析したCD8+T細胞アッセイからの代表的なデータが示されている。両方の細胞タイプのすべてのドナーにわたる2つの方法の間の傾向は同様であった。Tregアッセイからのこれらの代表データもまた、方法間で同様の結果を示す。しかし、すべての場合において、このメチル化アッセイは、刺激された条件と刺激されない条件の両方で高い値を生み出した。各アッセイの感度と特異性は、ブランクの限界、検出の限界、および定量値の限界によって実証されました。このアッセイは自動化されたデータ分析テンプレートを提供するので、客観的な分析を改善し、標準化能力を高める。これは、一貫した細胞治療製品を作成するために標準化された方法が重要な細胞治療の製造に最適です。

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