Name: 元ヴィヴォ・ランゲンドルフ・パーフュード・ハーツの眼電図と電気生理学研究 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 学ぶ ラングンドルフ灌流法による豚心臓の電気生理学と光マッピング技術。膜電位と細胞内カルシウムを同時評価し、心臓動態の研究や薬理学的応用に活用できます。

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著者たちは、マシュー・ケイ博士の有益な実験指導と、マネル・ラマダンとムハイミン・チャウドゥリーの技術支援を感謝の気持ちで認めている。この研究は、国立衛生研究所(R01HL139472からNGP、R01 HL139712からNI)、小児研究所、小児国立心臓研究所、シェイク・ザイード小児外科イノベーション研究所によって支援されました。

著者たちは何も開示する必要はない。

心血管研究モデルは細胞から生体内製剤まで多岐にわたるが、臨床的関連性と実験用有用性の間には固有のトレードオフがある。このスペクトルでは、孤立したランゲンドルフ浸透した心臓は、心臓生理学48を研究するのに有用な妥協点のままである。心臓全体モデルは、単一の細胞または組織単層よりも高いレベルの機能的および構造的統合を表すが、生体内モデルに関連する複雑さを回避する。二重光学マッピング実験における主な利点は、単離された心臓の心膜表面が観察され得ることを有し、膜貫通電位およびカルシウム処理の蛍光イメージングを心臓生理学34のモニタリングに使用することができる。
げっ歯類モデルは、より大きな動物とは対照的に孤立した心臓製剤に最も一般的に使用され、関連するすべての要素のアップサイジングの関連コスト(例えば、溶液量、灌流回路、染料の量および機械的アンカプラー)に関連するコストに起因する。大きな動物10、36、49における不整脈に対するより大きな不安定性および傾向と共に。豚の心臓を使用する利点の1つは、構造、サイズ、収縮率において人間の心臓によく似ているため、冠状動脈血流や心拍出量などの血行力学的パラメータをより正確にモデル化できることです。同様に、人間とブタは、同様のカルシウム処理、心電図間隔37、およびそれが12、50、51を表す基礎チャネルを含む作用電位形態を有する。 52.このプロトコルは、心筋機能を包括的に特徴付けるために再現可能な大型動物モデルを作成するためのステップを詳細に説明する。確立された電気生理学的プロトコルと組み合わせて使用される膜貫通電圧(RH237)と細胞内カルシウム(Rhod2)の同時イメージングは、変化した心臓を担当するメカニズムを特定する機会を提供します関数。記載された方法論は、前臨床安全性試験、毒性スクリーニングおよび遺伝的または他の疾患病理の調査に使用することができる。さらに、記載された方法論は、特定の研究焦点53、54、55に応じて、他の心臓モデル(例えば、イヌ、ヒト)との使用に合わせて改変および適合することができる。
より小さなげっ歯類モデルから、孤立した心臓全体の準備のためのより大きな豚モデルに移行する際に留意する重要な変更がいくつかあります。準備およびセットアップの間に、加血圧を維持し、浮腫(必要に応じて消泡剤)を減らすために、食素にアルブミンを加えることをお勧めします56,57,58,59.さらに、アルブミンを含む排腐剤はまた、媒体60、61に脂肪酸補充を必要とする代謝研究に役立つことができる。げっ歯類の心臓とは異なり、より大きな豚の心臓は、その表面対体積比が小さく、より良い温度を維持する冠状動脈血管を流れる暖かい媒体の量の増加のために暖かい媒体に沈める必要はありません。先に述べたように、温度プローブを右心室の内側と右心室の心膜表面に配置し、研究全体を通して3箇所すべてで1~2°Cのわずかな温度変動のみを観察しました。重要なことに、このようなより速い流量はまた、気泡と潜在的な塞栓症の可能性を高めることができます。この問題を回避するために、大きなボアチューブを備えたバブルトラップを使用して、大動脈カニューレにまっすぐ導くことをお勧めします。同様に、大小アタをより大きな(そして重い)心臓にカニューレするために2人の個体が連携して働くことは最も有用であることがわかりました。頑丈な止血で大腸を開いたままにする人と、臍テープを使用して大オラをカヌラに固定する人。記述された方法論では、心臓麻痺と除細動を伴う灌流は、げっ歯類の心臓製剤に反する心臓回復に不可欠であることがわかりました。私たちの経験では、少数の興奮した心臓だけが、心電化なしで正常な静脈駆動活動を再開しました。
光学イメージングエンドポイントを改善するために、吊り下げ心臓製剤は、水没した心臓で起こり得るグレアの効果を制限した。さらに、吊り下げ心臓はまた、垂直イメージングのために心臓を水平に置くときに起こり得る心臓の後部側面の冠状動脈血管の圧迫または妥協を避ける。また、バブルトラップ後に蛍光色素をロードすると(大動脈カニューレに近い)組織染色や光信号が大幅に改善されることがわかりました。最後に、心臓電気生理学エンドポイントを改善するために、より大きな同軸刺激電極の使用は、成功した心房ペーシングを容易にした。様々なEPパラメータの捕捉および捕捉の損失を同定するために心電図を使用するが、心内カテーテルまたはバイポーラ記録電極も使用することができる。
我々の研究は、孤立した無傷のブタ心臓モデルにおける二重光学マッピングおよび心臓電気生理学的評価のための方法論の開発に焦点を当てた。若年性ヒトの心臓との類似性のために、豚の心臓は小児心臓学または先天性心不全に焦点を当てた研究のための人気のあるモデルのままである。重要なことに、記述されたアプローチは、より大きな大人の心臓および/または異なる種の関心を持つ使用に適応することができる。実際、他の研究室は、イヌまたはヒトの心臓(ドナーまたは病気のいずれか)の使用が、その特定の研究焦点53、54、55に対してより適用可能であることがわかるかもしれない。この研究のもう一つの潜在的な制限は、イメージング中の動きのアーティファクトを減らすために機械的なアンカプラーを使用することです。ブレビスタチンは、心電図パラメータ、活性化および耐火期間41、62、63に対する最小限の影響による心臓イメージングアプリケーションにおける選択のアンカプラーとなっています。BDMは、より高価な選択であり、より大量の浸透量と機械的アンカプラーを必要とする大規模な動物研究では特に重要であるが、作用電位を変化させる可能性のあるカリウムおよびカルシウム電流に大きな影響を与することが知られている。形態学 64,65,66,67.BDMを使用する場合、APD短縮は衝撃誘発アリストミア68に対する心臓の脆弱性を増加させることに注意してください。逆に、ブレビスタチンを使用する主な制限は、その光感受性および光毒性であるが、これらの効果を減少させた代替製剤は69、70、71である。最後に、説明した方法論は、デュアル光マッピング実験のための単一のカメラシステムを利用していますが、心室細動および/または心膜表面全体の電気波の追跡に焦点を当てた研究研究が重要であることに注意することが重要です。他の15、19、72、73、74、75で説明されているように、このアプローチを変更して、3 次元パノラマ イメージングを含める必要があります。.

心血管疾患は、世界中の病気や死亡の主要な原因です。そのため、主な研究の焦点は、正常な心臓生理学とヒトの罹患率と死亡率に寄与する根本的なメカニズムを研究するために使用できる方法論を最適化することです。基本的な心血管研究は、伝統的にげっ歯類やウサギを含む小動物モデルに依存してきました1,2,3, 遺伝子組み換え種4,5の利用可能性のために ,低コスト、より小さな実験フットプリント、および高いスループット。しかし、豚モデルの使用は、より臨床的に関連するデータ6を提供する可能性を有する。実際、これまでの研究では、同様のイオン電流7、作用電位形状8、薬理検査9に対する応答を含む、ヒトとブタの間の心臓電気生理学(EP)の類似点が文書化されている。さらに、ブタの心臓は、げっ歯類またはウサギ10よりも人間に匹敵する収縮性および弛緩動力学を有する。イヌモデルと比較して、豚冠状解剖学は、より密接に人間の心臓11、12に似ており、心臓の発達、小児心臓学および/または先天性心不全に焦点を当てた研究のための選択のモデルである13. 豚とヒトの心臓8には違いがあるが、これらの類似点により、豚の心臓は心血管研究のための貴重なモデル14である。
心臓の逆行灌流は、オスカー・ランゲンドルフ16によって最初に確立されて以来、心臓ダイナミクスex vivo15を研究するための標準的なプロトコルとなっている。したがって、ランゲンドルフ灌流は、自律的影響がない場合に孤立した無傷の心臓を支えるために使用することができる。このモデルは健康な心臓および非健康な心臓間の心臓の電気生理学および収縮性を直接比較するための有用な用具である。心臓ダイナミクスは時間的にも空間的にも複雑であるため、1つの領域でわずかな変化が、心全体のシンシチウム17として働く能力に劇的に影響を与える可能性があります。従って、パラメータ感受性染料の高時空間イメージングは、心臓18、19の表面にわたって心臓機能を監視するのに有用なツールである。実際、電圧およびカルシウム感受性蛍光プローブの同時二重イメージングは、組織レベル20、21における電気活動、カルシウム処理および励起収縮結合の評価を可能にする。22、23、24、25、26、27、28。ランゲンドルフ灌流および/または光学マッピング技術は、以前に老化または遺伝的突然変異による心臓性能の低下を文書化し、薬理学的薬剤または環境暴露の安全性を評価するために使用されてきました29,30,31,32,33.
臨床現場では、侵襲的な心臓電気生理学研究は、心臓リズム障害の調査、病理の特定、および可能な治療オプションの特定によく用いられる。同様に、正静脈節の機能を評価し、房室伝導を測定し、心筋組織の屈折を同定するために使用できるEPプロトコルについて述べています。記載されたEP研究は、光学マッピング、または眼水検査34と組み合わせて行うことができ、孤立した心臓における心臓生理学を完全に特徴付けることができる。記載されたプロトコルでは、高時空間分解能蛍光イメージングを、二重発光セットアップにおいて電圧(RH237)およびカルシウム(Rhod-2AM)色素の組み合わせで行った。さらに、心臓電気生理学のパラメータは、誤体リズムの下で、およびプログラムされた電気刺激に応答して監視された。

<table><tbody><tr><td>(-)-ブレビスタチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0560-5MG</td><td>メカニカル アンカプラー</td></tr><tr><td>2,3-ブタンジオン モノキシム (BDM)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753-100G</td><td>メカニカル アンカプラー</td></tr><tr><td>アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ</td><td>州 A9418</td><td></td></tr><tr><td>アナログ信号インターフェース</td><td>emka Technologies</td><td>itf16USB</td><td></td></tr><tr><td>消泡</td><td>剤 Sigma-Aldrich</td><td>A5758-250ML</td><td></td></tr><tr><td>消泡剤Y-30エマルジョン</td><td>Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ</td><td>州A5758</td><td></td></tr><tr><td>大動脈カニューレ、5/16 "</td><td>コール・パーマー</td><td>45509-60</td><td></td></tr><tr><td>バブルトラップ</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>CLS430641U-100EA</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</sub</td><td>>フィッシャー・サイエンティフィック、フェア・ローン、ニュージャージー州</td><td>C77-500</td><td></td></tr><tr><td>カメラ、sCMOS</td><td>アンドール・テクノロジー</td><td>Zyla 4.2 PLUS</td><td></td></tr><tr><td>同軸刺激電極 (アトリア)</td><td>ハーバード・イスラーム</td><td>73-0219</td><td></td></tr><tr><td>除細動器</td><td>Zoll</td><td>Mシリーズ</td><td></td></tr><tr><td>ダイクロイックミラー</td><td>Chroma Technology</td><td>T660lpxrxt-UF2</td><td></td></tr><tr><td>差動増幅器</td><td>Warner Instruments</td><td>DP-304A</td><td></td></tr><tr><td>Emission filter, Calcium</td><td>Chroma Technology</td><td>ET585/40m</td><td></td></tr><tr><td>Emission Filter, voltage</td><td>Chroma Technology</td><td>ET710lp</td><td></td></tr><tr><td>EP stimulator (Bloom)</td><td>フィッシャーメディカル</td><td>DTU-215B</td><td></td></tr><tr><td>励起フィルター</td><td>クロマ</td><td>テクノロジーCT510 / 60bp</td><td></td></tr><tr><td>励起ライト</td><td>Thorlabs</td><td>SOLIS-525C</td><td></td></tr><tr><td></td><td>フィルターMcMaster-Carr</td><td>8147K52</td><td></td></tr><tr><td>フィルターカートリッジ、ポリプロピレン</td><td>Pentair</td><td>PD-5-934</td><td></td></tr><tr><td>フィルターハウジング</td><td>McMaster-Carr</td><td>9979T21</td><td></td></tr><tr><td>流量トランスデューサ</td><td>Transonic</td><td>ME6PXN</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>158968</td><td></td></tr><tr><td>Heating coil</td><td>Radnoti</td><td>158821</td><td></td></tr><tr><td>Hemofilter</td><td>Hemocor</td><td>HPH 400</td><td></td></tr><tr><td>止血鉗子</td><td>World Precision Instruments</td><td>501326</td><td></td></tr><tr><td>Image Splitter</td><td>Cairn Research</td><td>OptoSplit II</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td><td>423-316</td><td></td></tr><tr><td>Large-bore tubing, I.D. 3/8"</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-169-7H</td><td></td></tr><tr><td>レンズ 50 mm、0.95 f-stop</td><td>Navitar</td><td>DO-5095</td><td></td></tr><tr><td>メタモル</td>フィ<td>ケーラーデバイス</td><td></td><td>イメージアライメント</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>M-7506</td><td></td></tr><tr><td>Mucasol detergent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z637181-2L</td><td></td></tr><tr><td>Na Pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich,ミズーリ州セントルイス</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>S-3014</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td><td>S-233</td><td></td></tr><tr><td>Needle Electrodes 29 G, 2 mm</td><td>AD Instruments Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MLA1204 ノイズエリミネーター</td><td>クエスト・サイエンティフィック</td><td>ハンバグ</td><td></td></tr><tr><td>灌流ポンプ</td><td>PolyStan</td><td>A/S 1481</td><td></td></tr><tr><td>圧力変換器</td><td>World Precision Instruments</td><td>BLPR2</td><td></td></tr><tr><td>Reservoir, 2 L</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-34541-07</td><td></td></tr><tr><td>RH237</td><td>AAT Bioquest Inc.</td><td>21480</td><td></td></tr><tr><td>Rhod2-AM</td><td>AATバイオクエスト株式会社</td><td>21062</td><td></td></tr><tr><td>刺激電極(心室)</td><td>ハーバード・イスラーム</td><td>73-0160</td><td></td></tr><tr><td>外科用縫合</td>糸 <td>マッケソン 医療外科</td><td>890186</td><td></td></tr><tr><td>トランスデューサー アンプ</td><td>ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ</td><td>TBM4M</td><td></td></tr><tr><td>チューブ・フロー・コンソール</td><td>トランスニック</td><td>TS410</td><td></td></tr><tr><td>アンビリカル・テープ</td><td>ジョルベット</td><td>・J0025UA</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス/サーキュレーター</td><td>VWR</td><td>89400-970</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>包帯ばさみ</td><td>ハーバード装置</td><td>72-8448</td><td>リスター包帯はさみ、角度付き、鈍/鈍い、刃の長さ42.0 mm、17.0 cm</td></tr><tr><td>電気焼灼</td><td>Dalwha Corp. Ltd.</td><td>BA2ALD001</td><td>モデル: 200 基本的な</td></tr><tr><td>止血</td><td>剤 Roboz</td><td>RS-7476</td><td>セントビンセント管閉塞鉗子</td></tr><tr><td>止血鉗子</td><td>ハーバード装置</td><td>72-8960</td><td>ハルトマン止血鉗子、湾曲、鋸歯状 2.2 mm 先端幅、9.5 cm</td></tr><tr><td>止血</td><td>ハーバード装置</td><td>72-8985</td><td>ハルステッド-蚊止血鉗子 湾曲、鋸歯状、2 mm 先端 14 cm</td></tr><tr><td>メイヨーハサミ</td><td>WPI</td><td>501749</td><td>14.5 cm、ストレート</td></tr><tr><td>メッツェンバウムはさみ</td><td>WPI</td><td>501747</td><td>11.5 cm、ストレート</td></tr><tr><td>蚊鉗子</td><td>ハーバード装置</td><td>72-8980</td><td>ハルステッド-蚊止血鉗子 ストレート、スムース、2 mm 先端幅 12 cm</td></tr><tr><td>ニードルホルダー</td><td>ハーバード装置</td><td>72-8828</td><td>ウェブスター ニードルホルダー、ストレート、スムース、全長 13.0 cm</td></tr><tr><td>小児用クロスクランプ</td><td>Roboz</td><td>RS-7660</td><td>Cooley-Derra クランプ 6.25インチ 5 mm キャリブレーション</td></tr><tr><td>直角鉗子</td><td>WPI</td><td>501240</td><td>ベビーミクッター止血鉗子、14 cm、直角</td></tr><tr><td>メス</td><td>テッド ペラ</td><td>549-4</td><td>メス ハンドル No. 4、13.7 cm ステンレス鋼、10 No. 22 ブレード</td></tr><tr><td>はさみ</td><td>ハーバード 装置</td><td>72-8380</td><td>手術用ハサミ、ストレート、鈍/鈍、42 mm ブレード、12 cm</td></tr><tr><td>ストレート鋸歯状鉗子</td><td>WPI</td><td>500363</td><td>ドレッシング鉗子 15.5 cm</td></tr><tr><td>タオルクランプ</td><td>WPI</td><td>501700</td><td>バックハウス タオルクランプ 13 cm, 湾曲, ロックハンドル, SS</td></tr><tr><td>Weitlaner リトラクター</td><td>WPI</td><td>501314</td><td>Weitlaner リトラクター, 自己保持, 10.2 cm, 2x 3 シャープ プロング</td></tr><tr><td>Disposables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-0 prolene縫合</td>糸 <td>様々なベンダー</td><td>様々なベンダー</td><td></td></tr><tr><td>血管ループ</td><td>アスペン外科</td><td>011001PBX</td><td>Sterion&reg;血管ループ、0.8 mm x 406 mm</td></tr><tr><td>Cardioplegia (Plegisol)</td><td>Pfizer</td><td>00409-7969-05</td><td>Plegisol;セントトーマスクリスタロイド心臓麻痺溶液 20 mL/kg</td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>様々なベンダー</td><td></td><td>300 U/kg</td></tr><tr><td>シリンジと針</td><td>様々なベンダー</td><td>様々なベンダー</td><td>60 mL & 18 G</td></tr><tr><td>それぞれ アンビリカルテープ</td><td>Ethicon</td><td>U12T</td><td></td></tr></tbody></table>

元ヴィヴォ・ランゲンドルフ・パーフュード・ハーツの眼電図と電気生理学研究

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

小動物モデルは、遺伝子組み換え種の入手可能性と大型動物に比べて低コストのために、心血管研究で最も一般的に使用されています。しかし、より大きな哺乳動物は、正常な心臓生理学、病態生理学、および治療薬の前臨床試験に関連する翻訳研究の質問に適しています。心臓研究でより大きな動物モデルを採用することに伴う技術的な障壁を克服するために、我々は、単離されたランゲンドルフ透過子豚心臓における生理学的パラメータを測定するアプローチを記述する。このアプローチは、2つの強力な実験ツールを組み合わせて心臓の状態を評価します:電気生理学(EP)研究とパラメータ感受性色素(RH237、Rhod2-AM)を使用した膜貫通電圧と細胞内カルシウムの同時光学マッピング。記載された方法論は、心臓伝導系、作用電位形態の変化、カルシウム処理、励起収縮カップリングおよび心臓オルタナンの発生率を調査する翻訳研究に適しています。不整脈。

図1Aは、チューブ回路、ポンプ、フィルタ、酸素測定器、貯蔵所および発熱体を含む単離された心臓灌流システムの図を示す。心電図(鉛II構成)とペーシング電極の配置を図1Bに示し、イメージング設定を図1Cに示す。光学部品と光路の概略を図1Dに示します。
実験的研究は、2.5−10.5 kg体重と18−137gの体重から及ぶサイズの若いヨークシャー豚(14−42日、n =18)から隔離された無傷の全心臓に対して行われた(図2A)。単離された心臓をランゲンドルフ系(37°)に移した後、心拍数は除細動の〜10分以内に70±4.5 bpm(平均±SEM)に安定化し、研究期間中一定であった(図2B)。平均流量184±17mL/min(平均±SEM)を測定し、機械的アンカプラーを含む加温媒体を用いて浸透させた後、70±7.5mL/分まで減速した(図2C)。
鉛II心電図は、静脈リズム(図3A)の間、または外部ペーシングに応答して、電気生理学的パラメータを定量するために研究の期間中に記録した。EPアセスメントでは、動的ペーシング(S1−S1)を右心房に適用してWBCLとSNRT(S1−S1開始後の回復時間、図3C)を特定し、ここでWBCLは心室伝導に対して心房を開始した最短のPCLとして示された。S1−S2ペーシングプロトコルは、心室脱分極を開始した最短の結合間隔を特定するために左心室のバイポーラ刺激電極を用いて実装され、それによってVERPを特定した(図3D)。または、図 3Eに示すように、S1-S2 アストリシンペーシング プロトコルがピンポイント AVNERP(S1-S2)に適用されます。豚心臓電気生理学パラメータの代表的な例は、以前に公開された37と密接に一致する。
オプティカルマッピング実験は、中腹リズム、自発的心室細動(図4)、または左心室(LV)の動的ペーシング中(S1-S1)の間に行われ、電気的およびカルシウムの戻り曲線を生成した。図 5.色素を装填した子豚の心臓の代表的な画像は、表心表面上の2つの領域から収集された対応する光学作用電位(Vm)とカルシウム(Ca)過渡(右心室[RV]=青、LV=赤)で図4に示されています。.未処理の信号は、静脈のリズムの間および心室細動の間に表示される。前述したように、動的心心ペーシング(S1−S1)は、本質的な心拍数のわずかな差を正規化するために光学マッピング実験中にも使用された(図5A-E)。生信号が表示されます(RV = 青、LV = 赤)、作用電位を表すために使用された- カルシウム過渡結合時間(図5C)、活性化および持続時間(図5D)、電気およびカルシウムの返還(図5E)。厚い心筋製剤の場合、カーネルサイズ〜3mm×3mmの空間フィルタリングは、心筋作用電位またはカルシウム過渡分析19、47に適している。したがって、高い空間解像度の画像(説明されている設定1240 x 1024の合計、またはチャンネルあたり620 x 512、6.5μmピクセルサイズ)は、多くの場合、取得後または後の間に空間的にビン分割されます(図5C)。画像処理を行うと、カスタムアルゴリズム23、33、43、45(図3D)を使用して、アクティベーションマップと再偏光マップを生成できます。心臓上の各画素は、作用電位またはカルシウム過渡性アップストロークの最大誘導体として定義された。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig01.jpg"> 図 1: 実験的なセットアップ(A)孤立した心臓灌流系の図;矢印は流れの方向を示します。(B)カニューレされた心臓は電極配置で示される。RA=右心房、RV=右心室、LV=左心室、心電図=鉛II心電図。(C)心臓組織に近接するイメージングプラットフォーム。(D)各相補プローブ(電圧、カルシウム)の発光は、適切な発光フィルタとダイクロイックミラーを有する画像分割装置を用いて波長によって分離される。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig02.jpg"> 図2:心の重み、速度および流量測定。(A)研究で使用された各子豚の体重比に対する体重比(n=18)。(B)心拍数は除細動後約10分、研究終了時に再び測定した(約1時間)。(C) 冠状動脈の流れは、酸素需要の減少により機械的なアンカプラー(+BDM)で灌流した後に急激に低下する。スケールバーは平均± SEM を表<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig02large.jpg" target="_blank">します。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig03.jpg"> 図3:中陰リズム中または外部ペーシングに応答して収集された鉛II心電図記録の代表的な例。(A) 正常な静脈のリズム。(B)サイクル長400ms(S1−S1)での心膜ペーシングの例は、撮像実験に用いた。(C) トップ: WBCL を識別するための心房ペース;成功した捕捉は、心室伝導に対する心房が観察されるS1=250msで観察される。心房ペーシングは、SNRT(外部ペーシングを発生させた後、誤審ノード放電までの時間)を決定するために使用することができることに注意してください。下: S1 サイクルの長さが 205 ミリ秒に減少すると、心室への伝導が失敗します。(D) 上: VERP を識別する心心ペーシング (S1-S2) ;正常なキャプチャはS1 = 450 ms、S2 = 300ミリ秒で観察される:S2サイクル長が250msに減少すると、心室組織は捕捉に失敗する。(E) アストリカルペーシング(S1-S2)を参照してAVNERPを識別します。上: 正常なキャプチャは S1 = 450 ms、S2 = 200 ミリ秒で観察されます。青い矢印はペーシングスパイクを示し、赤い矢印はキャプチャ('C')またはキャプチャなし('NC')を示します。S1-S1 = ダイナミック ペーシング、S1-S2 = 余分な刺激ペーシング。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig04.jpg"> 図4:中腹リズムおよび心室細動時の光学データ左: 色素をロードした豚の心臓の代表的な画像 (Vm = 電圧, RH237;Ca =カルシウム、ロード2)、前景。静脈リズム中に豚の心臓から膜貫通電圧と細胞内カルシウム蛍光信号を空間的に濾過した(中央)。心室細動時の電圧とカルシウム信号(右)。赤と青の正方形として表される信号領域サイズ (15 x 15 ピクセル = 2.4 x2.4mm 2、30 x 30 = 4.8 x 4.8 mm2カーネル サイズ)。単位 = ΔF/F.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig04large.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、この図の大きなバージョンが表示されます。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig05.jpg"> 図5:ランゲンドルフパーフューズドブタハートからの光学データ未加工の空間的に濾過された(A)膜貫通電圧および(B)頂点での電気ペーシング中の左右心室からの細胞内カルシウム蛍光信号。フィルタリングされていない空間的に平均化された信号は、対象領域からの光作用電位とカルシウム過渡を表します(信号単位はΔF/Fです)。(C) 正規化されたトランジェントのオーバーレイは、作用電位カルシウム過渡結合時間(75 Hzでフィルタリングされたローパス)を示す。(D)心膜表面を横切る信号を処理し、活性化時間(t作用)および80%再分極時間を含む時間パラメータのアイソクロナルマップを生成する。(E)統計的解析(右)を用いて複数の周波数(左)で生成された電気・カルシウム過渡返還曲線は、より遅いペーシングサイクル長での再分極時間の長さを示す。スケールバー = 平均 ± SEM.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>化学</td>
			<td>式</td>
			<td>分子量</td>
			<td>g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>塩化ナトリウム</td>
			<td>塩化 ナトリウム</td>
			<td>58.44</td>
			<td>5.26</td>
		</tr>
<tr>
<td>グルコン酸ナトリウム</td>
			<td>C6H11NaO7
</td>
			<td>218.14</td>
			<td>5.02</td>
		</tr>
<tr>
<td>三水和物ナトリウム</td>
			<td>C2H3NaO2•3H2O</td>
			<td>136.08</td>
			<td>3.68</td>
		</tr>
<tr>
<td>塩化カリウム</td>
			<td>Kcl</td>
			<td>74.55</td>
			<td>0.63</td>
		</tr>
<tr>
<td>塩化マグネシウム(無水)</td>
			<td>MgCl2
</td>
			<td>95.21</td>
			<td>0.1405</td>
		</tr>
<tr>
<td>8.4% 重炭酸ナトリウム</td>
			<td>ナフコ3
</td>
			<td>84.01</td>
			<td>13</td>
		</tr>
<tr>
<td>マンニトール</td>
			<td>C6H14O6
</td>
			<td>182.17</td>
			<td>16.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>硫酸マグネシウム</td>
			<td>MgSO4
</td>
			<td>120.37</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>博士</td>
			<td>7.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>オスモルリティ(モスモール/L)</td>
			<td>294</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>表1:変更デルニドの心プレギアレシピ。

本研究の目的は、翻訳動物モデルを用いて心臓動態を調べる方法を確立することにあった。記述された実験的アプローチは、孤立した無傷の豚の心臓モデルにおける電気的活動を評価するための電気生理学的研究と共に二重放出眼電図を組み込む。

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

心血管の機能不全は、世界中の主要な死因です。我々がここに提示する孤立した心臓モデルは、ヒト心臓ダイナミクスへの実験的な窓として役立つ。このアプローチは、古典的な電気生理学の研究と膜貫通電圧と細胞間カルシウムの同時光学マッピングを組み合わせて心臓の状態を評価する。この方法論は、疾患のモデル化、薬理学、および毒物学の研究に適用することができます。例えば、私たちの焦点の分野の1つは、心臓電気生理学に対するガラスサイザーの影響を特徴付けるものです。この方法論は、より小さな動物モデルを利用するプロトコルよりも技術的に難しいですが、全体的に、プロトコルはすべての部分が整ったら比較的簡単です。イメージングおよび灌流システムのすべてのコンポーネントをテキストで記述することは困難であるため、このプロセスの視覚的なデモンストレーションは、準備の成功を実現するのに役立ちます。上昇大オルタをそのままに心臓を隔離した後、切除された器官を氷冷心プレギアに突っ込み、止結して大間の壁をつかむ。心臓の上に約95センチメートルを吊るされた氷冷心プレギア培地の1リットルに接続されたチューブに取り付けられたリブ付きカニューレに容器を滑り込ませます。容器が溢れるまで液体が大腸を満たし、気泡が脈管構造に入るのを防ぎ、臍帯テープを使用して大腸をカニューレに固定します。止まり小屋を結んでカニューレから吊り下げる心臓の重さを負い、組織をさらに固定し、冷たい媒体が重力によって70ミリメートルの水銀の一定の圧力で心臓を逆行できるようにします。カニューレに空気を入れずに37°Cランゲンドルフシステムに音を伝えます。そして、正常な大線のリズムが残っている血液および心筋の脈管を洗い流すことを可能にする。ショック可能な不整脈の場合、心臓の頂点と基部に外部パドルを置いて臓器を除細させ、5ジュールで単一の衝撃を与え、50ジュール、カーディオバージョン、またはショック不可能なリズムまで5ジュール単位で増加する。次に、少なくとも1リットルの修飾クレブス・ヘンセレイト培地で心臓を再循環することなく洗い流し、残留血液および心胸筋を除去する。培地が心臓を通って透明に走るとき、循環ループを閉じてパーフューズを再循環させる。研究の過程を通してECGへの標準的なリードを記録するには、頂点近くの心室心外膜に29ゲージの針電極を取り付け、右心房に別の電極を取り付けます。差動バイオアンプの正と負の入力をそれぞれ頂点と右心房に接続し、右心房に1つのバイポーラ刺激電極を取り付け、2番目のバイポーラ刺激電極をペーシング目的で左右左心室に取り付けます。初期電流を拡張期閾値の2倍、パルス幅を1ミリ秒に設定して、電気生理学刺激装置を使用して心臓をペースします。ペーシングの閾値を特定するには、一貫した刺激応答を確保するために、定義されたペーシングサイクル長さで1ミリ秒のパルス幅を持つ一連の1〜2ミリアンペア刺激インパルスを適用します。S1、S1、S1、S2ペーシングトレインを使用して、余分な刺激ペーシングを実行します。ペーシングがキャプチャーに失敗するまで、S2ペーシング・サイクルの長さを段階的に10ミリ秒短縮します。次に、ペースサイクルの長さを最後から 2 番目に長くして、サイクル長を 1 ミリ秒間隔で短くして、キャプチャを失う前に最も正確なペーシング サイクル長を決定します。心室有効難治期間を確立するために、S2早期拍動が心室脱分極を開始する最短S1、S2間隔を特定するために、左心室の側側に刺激電極を使用する。Wenckebach サイクル長を定義するには、右心房の刺激電極を使用して、通常の伝導経路を介して 1 対 1 の房室伝導が伝播する最短 S1、S1 間隔を見つけます。正位ノードの回復時間を定義するには、右心房の刺激電極を使用してS1、S1ペーシングトレインを適用し、ペーシングトレインの最後のインパルスと自発的な正局ノード媒介活動の回復との間の時間遅延を測定します。房室ノード有効耐火期間を確立するには、右心房の刺激電極を使用します。早期の心房刺激が続く最短のS1、S2カップリング間隔に続いて、QRS複合体を引き起こすヒスバンド電位が見つかります。膜貫通電圧と細胞内カルシウムの光学マッピングでは、まず、調製した新しい電圧色素を大動脈カニューレに近い5ミリリットルまでゆっくりと加え、次いで調製したカルシウム色素をゆっくりと添加します。次に、イメージングハードウェアを適切な視野に焦点を合わせ、カメラをワークステーションに接続します。選択したソフトウェアを使用して、5~2ミリ秒の露光時間で画像を取得します。また、目的の領域を分割してオーバーレイし、グレースケールの減算または疑似色の加算をハイライトのミスアライメントに表示できるソフトウェアの助けを借りて、画像のアライメントを実行します。周囲の照明を最小限に抑えた状態で、LEDライトをテストして、センサの深度によって決定される均一で最大の心外膜照明を確認します。次に、左心室に配置された刺激電極を使用して、心座のリズム、心室細動、または動的ペーシング中に心筋を画像化し、ペーシングサイクルの長さを350ミリ秒から始め、10〜50ミリ秒減少して払戻曲線を生成します。実験全体を通して品質の光信号の取得を確認するには、ビデオファイルを開き、対象領域を選択し、時間の経過とともに平均蛍光をプロットします。実験の最後に、システムから心臓を取り出し、パーフューザを排出します。次に、システムチューブとチャンバーを精製水で洗浄します。定期的なメンテナンスのために、必要に応じて定期的に洗剤溶液でシステムを洗いすります。これらの代表的な研究では、手順は、実体的なモデルで行われ、実証されているように、体重の2.5〜10.5キログラムと心臓体重の18〜137グラムのサイズの範囲であった。孤立した心臓をランゲンドルフ系に移した後、心拍数は除細動の約10分以内に毎分約70拍に安定し、研究期間中一定のままである。平均流量は、通常、1分あたり約184ミリリットルの測定される。機械的なアンカプラを含む温かい媒体を温めた後、毎分70ミリリットルに減速する。リード2 ECGは、脳波リズムの間、または電気生理学的パラメータを定量化するための外部ペーシングに応答して、研究の期間を通して記録することができる。光学マッピング実験は、心座のリズムと自発的な心室細動の間に行うこともできます。色素を装填した心臓の代表的な画像は、対応する光学的作用電位を有して得ることができる。そしてカルシウム過渡性は、心外膜表面上の関心のある2つの領域から収集することができる。さらに、動的心筋ペーシングは、光マッピング実験中に使用して、固有の心拍数のわずかな違いを正規化することができます。生信号は、作用電位カルシウム過渡結合時間、活性化時間および持続時間、および電気およびカルシウムの払戻しを描写するために使用することができる。泡が大腸に入ることを避け、動物から系への移動時間を最小限に抑え、より大きな心臓を支えることが重要である。電気生理学および光信号データは、取得後に解析することができる。さらに、心臓は、研究後に保存され、その後、神体、免疫染色、または遺伝子発現解析が可能です。この技術を使用して、若年性心臓の発達を特徴付け、環境暴露が心臓生理学に及ぼす影響を調べています。動きを最小限に抑えるために使用される機械的なアンカプラとアルブミン泡立ちに対処するために使用される反泡化学物質は両方とも有毒であるため、適切な個人用保護具を使用することは絶対に不可欠です。

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