サイトファストと上流クラスタリング法FlowSOMとサイトスプロアを用いた高次元サイトメトリーデータの可視化と定量
December 12th, 2019
Cytofastは、クラスタリングからの出力を分析するために使用される視覚化ツールです。Cytofastを使用して、FlowSOMとCytosploreの 2 つのクラスタリング方法を比較できます。Cytofastは、質量サイトメトリーデータの定量的および定性的な概要を迅速に生成し、異なるクラスタリングアルゴリズム間の主な違いを強調することができます。
質量サイトメトリーによって生成されるデータは複雑であり、効率的かつ簡単な方法で視覚化する必要があります。Cytofastは、免疫細胞集団内の免疫学的パターンを強調し、臨床処置または実験群に関連する細胞サブセットを決定する方法である。フローソムやサイトスプロアのような任意の結晶化法の後に細胞性を適用することができます。
臨床治療や実験グループにリンクされている細胞サブセットを発見することができます。この方法を使用すると、データの免疫学的概要を定量的に一目で確認できるようになります。まず、サイトスプロアまたはフロー SOM を使用してクラスターを作成します。
Cytosplore を使用している場合は、[ファイル] をクリックして FCS ファイルをアップロードし、FCS ファイルを開きます。次に、プロンプトが表示されたら、ハイパーボリック ArcSinh 変換の補因子を選択し、[チャネルとして一意のサンプル タグを追加] をクリックします。「HSNE を実行」を選択して HSNE レベル 3 を実行し、マップが生成されるのを待ちます。
最初の HSNE レベルで、CD161 の正のセルを選択し、右クリックして選択にズームして、CD161 に正のセルを確認します。2 番目のレベルでは、CD161 陽性イベントのみで 3 番目のレベルに到達する手順を繰り返します。最後の TSNE マップが生成されたら、マップを右クリックして保存クラスターを選択して、Cytosplore によって定義されたクラスターを保存します。
Cytosplore によってプロンプトされた出力ファイルのディレクトリを選択し、後で FSC ファイルを R.にロードするために使用されるため、この場所に注意してください。指定された関数 readcytosploreFCS を使用して、ファイルを R に読み込みます。データを消去するには、不要なパラメータに関連する列の位置をチェックし、マトリックスから削除することで、時間や背景などの一部のパラメータを削除します。
次に、マーカーの順序を変更して、最初にリネージュ マーカーを表示し、次に機能マーカーを表示します。臨床情報を含むスプレッドシートメタファイルをアップロードして、メタデータファイルをCytosploreから生成されたデータにリンクします。FlowSOM によるクラスタリングを実行するには、以前に読み取りで R の CD161 陽性イベントにゲートされた生データをロードします。
関数を設定します。適切な列を選択し、ArcSinh5 方式でデータを変換することにより、関連する生物学的マーカーを選択します。関数でコファクト=5を選択して、5 の補因子を適用します。
FlowSOM 関数を使用してデータをクラスター化し、Cytosplore によって以前に生成された出力と同じ 10 個のサブセットのデータをクラスター化することを選択して、FlwoSOM と Cytosplore を比較します。次に、識別されたサブセットとサンプル ID に各セルを割り当てます。FlowSOM から取得したデータフレームに基づいて CF リストを作成します。
次に、マーカーを、サイトスプロア解析の出力と同様に表示されるように並べ替えます。ヒート マップを作成する前に、関数 cellCount を使用してサンプルごとのカウント テーブルを生成します。一部のクラスターは他のクラスターよりもセル数が少ないので、サンプル間の分散を見やすくする関数内で scale=true を指定して、クラスターごとにデータをスケーリングします。
ヒート マップを使用してデータを視覚化し、セル数を生成してボックス プロットを視覚化しますが、データをスケーリングして各クラスターの頻度を取得します。最後に、CD45、CD11cおよびCD54マーカーの発現強度を、そのマーカー名を示して、MSIプロット関数に含めて可視化する。Cytofast は、解析で識別され、マーカーの式に基づいて、すべてのクラスターのヒート マップを含むいくつかの可能な出力を実行します。
上部の樹状図は、識別されたクラスター間の階層的な類似性を表します。上部パネルには、各サンプルの対応するサブセットの相対量を示す別のヒートマップが表示されます。一方、右側の樹状図は、天然キラー細胞の表現型が注射の3日後にPD-L1処理によって形成されることを示すサブセット周波数に基づくサンプル間の類似性を示している。
結合されたヒートマップは、FlowSOMの後にサイトファストとサイトスプラレの後に続いて細胞断食のために得ることができる。Cytofast は、データを定量的に表示し、結果をボックス プロットで表示するためにも使用できます。Cytofast パッケージに含まれるもう 1 つの機能は、グループごとに各マーカーの中央値信号強度プロットを示す MSI プロット関数です。
この機能は、PD-L1処理群のナチュラルキラー細胞におけるCD54またはCD11cの発現の増加などのグローバル変化を検出することを可能にする。この技術は、データを視覚化して定量化する迅速な方法であり、治療後の新しい細胞応答を発見するために使用することができます。このメソッドの後、R のグローバル テスト パッケージを使用して、応答変数との関連付けについて共変量のグループをテストできます。
これは、各サブセットと臨床結果の間の相関関係を示します。
概要
Cytofastは、FlowSOMやCytosploreなどのクラスタリング方法を比較することで質量細胞計測データを分析するように設計された可視化ツールです。データの迅速な定量的および定性的な概要を提供し、クラスタリングアルゴリズム間の違いを強調します。
主要な研究要素
科学の分野
- 質量細胞計測
- データ可視化
- クラスタリング分析
背景
- 質量細胞計測は効率的な可視化を必要とする複雑なデータを生成します。
- Cytofastは免疫細胞集団内の免疫学的パターンを特定します。
- FlowSOMやCytosploreのようなクラスタリング方法の後に適用できます。
- 臨床治療に関連する細胞サブセットの理解は研究にとって重要です。
研究の目的
- 質量細胞計測データを視覚化し定量化するツールを提供すること。
- 異なるクラスタリング方法を効果的に比較すること。
- 臨床結果に関連する細胞サブセットの発見を促進すること。
使用された方法
- クラスタはCytosploreまたはFlowSOMを使用して作成されます。
- データはRで変換およびクリーニングされ、分析のために使用されます。
- クラスタリングが実行され、結果はヒートマップとボックスプロットを通じて視覚化されます。
- MSIプロット機能を使用して、マーカー発現のグローバルな変化を検出します。
主な結果
- Cytofastはクラスタリング結果を示すためにヒートマップとデンドログラムを生成します。
- 治療が自然キラー細胞表現型に与える影響を強調します。
- 定量的結果はボックスプロットとMSIプロットを通じて提示されます。
- このツールは細胞応答の迅速な視覚化と定量化を可能にします。
結論
- Cytofastは質量細胞計測データを分析するための効果的なツールです。
- 治療に関連する免疫細胞サブセットの理解を深めます。
- この方法は治療後の新しい細胞応答の発見をサポートします。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Mass cytometry generates high-dimensional immune profiling data that require rapid visualization and quantification to support target validation and mechanistic de-risking in immunotherapy development. Cytofast enables biopharma R&D teams to compare clustering outputs from FlowSOM and Cytosplore, facilitating hypothesis testing of immune cell subset responses to PD-L1 blockade. This accelerates go/no-go decisions by providing quantitative, reproducible readouts of NK cell activation and phenotypic shifts in the tumor microenvironment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking immune cell subsets to clinical treatments or experimental groups.
- Operational Value: Supports functional target validation through quantitative comparison of cluster abundance and marker expression across conditions.
- Predictive Confidence: Enhances confidence in target mechanisms by visualizing PD-L1-induced changes in NK cell activation markers like CD54 and CD11c.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems from clustering outputs for downstream compound screening and biomarker evaluation.
- Reproducibility: Standardizes data transformation and cleaning steps (e.g., ArcSinh transformation, parameter removal) to ensure consistent inputs across experiments.
- Scalability: Enables platform reuse across multiple samples and conditions via automated R-based workflows for heat maps, box plots, and MSI plots.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models immune modulation in the tumor microenvironment, specifically NK cell responses to immunotherapy, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by quantifying immune subset frequencies and functional states prior to in vivo studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by identifying reproducible immunological patterns linked to therapeutic response.
Pipeline & Workflow Integration
Cytofast integrates into the discovery continuum from early immune profiling through lead identification to preclinical validation, enabling data-driven progression of immunotherapy candidates.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by identifying cell subsets associated with experimental groups or clinical outcomes.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible quantitative outputs (e.g., scaled cluster frequencies) for reliable compound or modulator evaluation.
- Analytics: Provides MSI plots and heat maps that quantify marker expression intensity and subset dispersion, enabling cross-condition comparisons.
- Translational Research: Connects immune phenotyping to preclinical continuity by linking NK cell activation states to immunotherapy mechanisms.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable analytical module applicable across multiple immunotherapy projects and immune monitoring campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in immune responses to checkpoint blockade.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through scripted R workflows and consistent preprocessing steps.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of immunotherapy targets through quantitative immune profiling.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying immunological signatures of response that inform advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mass cytometry data analysis, R programming, and clustering interpretation (FlowSOM, Cytosplore, HSNE/t-SNE).
- Depends on instrumentation for CyTOF data acquisition and computational infrastructure for R-based processing and visualization.
- Necessitates cross-team standardization of gating strategies, marker panels, and metadata annotation for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when applying workflows to different immune cell types, disease models, or therapeutic modalities beyond NK cells and PD-L1 blockade.
- Limited by the quality of upstream clustering and the need for manual optimization of parameters (e.g., cofactor, cluster number) in Cytosplore and FlowSOM steps.
