Name: ニワトリエイメリア寄生虫の核形成と生体内伝播 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 学ぶニワトリエイメリア寄生虫の核形成と生体内伝播。ヌクレオフェクションを用いた遺伝子導入法により、遺伝子改変寄生虫の作製とワクチン開発への応用可能性を示します。

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この研究は、中国国家主要研究開発計画(2017YFD0501200)と中国自然科学財団(31572507、31772728、31873007)によって支援されました。

すべての動物実験のための鶏は、中国農業大学の施設動物ケアと使用委員会のガイドラインに従って収容され、維持され、動物を含む生物医学研究のための国際指導原則に従った。実験は実験動物の北京管理委員会によって承認された。
1.エイメリア属のスポロゾイン物の抽出と精製(例えば、E.テネラ)
<ol><li>スポロシストの放出<ol>
<li>遠心分離機 1 x 107二色酸カリウム溶液中の卵胞を胞体 (2.5%, m/v) で 2,300 x gで 5 分間.PBS (リン酸緩衝液) で 3 回洗浄します。</li>
		<li>1 mLのPBSでペレットを再懸濁し、15mLチューブに移します。等量のガラスビーズ(1 mm x 1 mm の範囲)を加え、渦ミキサーを使用してオーシルスサスペンションを振動させ、スポロシストを放出します。</li>
		<li>毎分顕微鏡でスポロシストの放出を監視する。オーシストの90%以上が壊れているときに渦を止めてください。 注:ほとんどのオーシルス(E.テネラ、E.ネカトリクス、E.アセヴルブリナなど)は、渦ミキサーを使用して1分後に壊れました。</li>
		<li>スポロシスト懸濁液を新しい1.5 mLチューブに移し、遠心分離機を1,600 x gで5分間転送します。</li>
		<li>50%の密度勾配溶液の1 mLで沈殿物を再懸濁し、1.5 mLの管に結合し、10,000 x gで1分間遠心分離します。 注: 密度勾配コンポジションについては、表 1を参照してください。密度勾配は、ポリビニルピロリドン(PVP)を使用してコーティングされた直径15〜30nm(水で23%/w)のコロイダルシリカ粒子からなるシリカベースのコロイド状媒体である。</li>
	</ol>
</li>
	<li>スポロゾイントの放出<ol>
<li>この沈殿物をエキシペックスバッファー(表1)で再懸濁し、42°Cの水浴中に40〜60分間インキュベートし、スポロゾライトを放出する。スポロゾイトの90%以上が放出されると、インキュベートを停止します。その後、600 x gで10分間遠心分離します。 注:エキシ分の間にチューブを5分ごとに振ってください。</li>
		<li>55%の密度勾配溶液の1 mLと1分間の10,000 x gで遠心分離機で沈殿を再懸濁します。</li>
		<li>1 mLのPBSで沈殿を再懸濁し、溶氷計を用いてスポロゾサイトを数える。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. E.ゼネクトリックスのメロゾサイトの採取と精製
注:実験では7-14 dのアーバーエーカー(AA)ブロイラーを使用してください。尾菌を含まない鶏(n=3)にE.ネカトリクスの2 x 105オーシストを接種した。感染後109時間、鳥は頸部脱臼によって犠牲にされた。腸は第2世代メロゾートの採取のために除去された。異なるエイメリア種については、第2世代メロゾアイトの収集には異なる時間があった:E.ネカトリクスは109時間、E.テネラは112時間の接種後に。E.necatrixのトランスフェクションでは、第2のメロゾインは精製が容易なので、メロゾイントは最適な選択です。
<ol><li>E.ゼネクトリックスの第二世代メロゾアイトのコレクション
	<ol>
<li>鶏の腸を縦方向に切り、卵黄の茎(小腸の真ん中)からイレオセカルオリフィスまで、PBSまたはHBSS(ハンクのバランス塩溶液)でペトリ皿に3回軽く洗います。</li>
		<li>腸を0.5cm x 0.5cmに切り、消化バッファーを備えた円錐形のフラスコに入れます(表1)。フラスコを37°Cの磁気ミキサーに置き、攪拌バーを30〜60分間置いてメロゾアイトを放出します。30分のインキュベーション後、5分毎に顕微鏡検査でメロゾサイトの放出を監視します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ろ過と遠心分離によってメロゾイントを浄化します。<ol>
<li>ガーゼ14の4層を用いて消化されたメロゾイントを含む懸濁液を濾過し、600 x gで10分間遠心分離します。</li>
		<li>遠心分離後、腸の破片を含む上清を捨てる。精製されたメロゾインで沈殿を1.5 mLのチューブに移します。</li>
		<li>1 mLのPBSで沈殿を再懸濁し、溶氷計を用いてメロゾサイトを数える。</li>
	</ol>
</li>
</ol>メロゾインまたはスポロゾーアチの核分裂
<ol><li>寄生虫の核形成前の製剤<ol>
<li>1つのチューブに約107メロゾインまたはスポロゾインを調製します。メロゾイドをトランスフェクションする場合は、3-4チューブを準備します。</li>
		<li>10 μg 以上の量のプラスミド DNA または精製 PCR 断片を調製します。 注:本研究で使用されるプラスミドには、トキソプラズマゴンディ(TgDHFR-TS)15に由来する強化黄色蛍光タンパク質(EYFP)およびジヒドロ葉酸還元酵素チミジレートシンターゼの2つの遺伝子が含まれています。</li>
		<li>制限酵素の25Uを調製する。プラスミドが線形化されれば、制限酵素はトランスフェクション効率を向上させることができる。プラスミドが円形の場合、制限酵素を省略する。</li>
		<li>85 μLの核式バッファーを調製する:20 μLの核生成バッファーIと1mLの核小起バッファーIIを混合し、溶液の一部を使用する。総バッファの容積は100 μLである。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ヌクレボネクション<ol>
<li>スポロゾアイトまたはメロゾアイト懸濁液を600 x gで10分間遠心分離する。その後、上清を破棄します。</li>
		<li>次の順序で、85 μLの核トランスフェクションバッファー、10 μgのプラスミド(PCRフラグメント)、および25 Uの制限酵素(通常は5 μL)を、スポロゾーアテまたはメロゾアイトを含む1.5 mLチューブに添加します。</li>
		<li>サスペンションを核トランスフェクションカップに移します。カップを核移動溝に入れます。</li>
		<li>電源ボタンを使用して核結膜装置をオンにし、トランスフェクション手順U-033を選択します。核外離装置がフリープログラム選択モードで起動する場合は、Xボタンを押してこのモードを終了します。</li>
		<li>プログラムが終了したら、核素子装置のXボタンを押すと、ヌクレオフィックが成功したことを示すOKが画面に表示されます。</li>
		<li>DulbeccoのModified Eagleのミディアム(DMEM)8を核オフィックカップに0.5-1 mL加えて、反応を止め、穏やかに混合した後にサスペンションを1.5mLチューブに移します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. クロアカル接種または静脈内注射
<ol><li>ヌクレオ感染した寄生虫を7日齢の鶏に接種する。E.ネクサトリクスまたはE.テメラのスポロゾサイトのメロゾサイトをクロアカル経路を介して接種するが、静脈注射を介してE.アセウルフラーニウスポロゾイン石を接種する。各鶏に約2 x 107百万スポロゾアイトを接種し、各鳥にメロゾアイト107をインコル酸塩する。</li>
</ol>5. 伝播と FACS の並べ替え
<ol><li>トランスフェクションされたスポロゾーイトで接種後5〜9日の便胞を採取する。トランスフェクションされたメロゾインを接種した後、3日目に卵胞を採取する。</li>
	<li>蛍光活性化細胞選別(FACS)と150mg/kgピリメタミン8を使用して、トランスジェニック母集団比率を連続的に増加させます。 注:ピリメタミンを使用して、フィードに直接添加します。より便利な使用のために、水溶性ピリメタアミンを調製してください。0.2 mL pf H2SO4および 9.8 mL の N-メチル ピロリドン (NMP) に 1 g のピリメタミンを溶解し、このストック溶液の 1.5 mL を鳥の飲料水 1 L に加えます。</li>
</ol>6. 任意カラムの精製
注:より純粋なスポロゾアイトまたはメロゾアイトが必要な場合は、ジエチルアミノエチル-52セルロース(DE-52セルロース)カラムを通してそれらを精製するオプションの方法があります。
<ol><li>DE-52セルロースカラムを少なくとも1日前に準備する。<ol>
<li>グリシン溶出緩衝液を調製する(表1)。グリシン溶出緩衝液のpHを7.6から8.0に調整し、41°Cに予め温めた。</li>
		<li>DE-52 セルロースの 2.5 g をカラムに追加します。水を加え、一晩浸します。上清を捨てます。</li>
		<li>水を加え、1時間浸し、上清を捨てる。</li>
		<li>0.1 M NaOH を追加し、少なくとも 2 時間浸します。この手順を繰り返します。</li>
		<li>上清を水に交換してください。セルロースが完全に底部(約30分)に落ち着いたら、このステップを繰り返します。</li>
		<li>上清を捨て、0.1 M HCl を加え、少なくとも 2 時間浸漬します。この手順を繰り返します。</li>
		<li>上清を捨て、グリシン溶出緩衝液でセルロースを2回浸す。</li>
		<li>測定し、0.1 M HCl または 0.1 M NaOH を追加して、7.6 から 8.0 までの pH を調整します。 注:この部分では、液体はDE-52セルロースのそれよりも少なくとも5倍の体積を有する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>流量を40~50r/分の間で調整します。</li>
	<li>セルロースの沈澱が完了したら、スポロゾアイトまたはメロゾアイト懸濁液をクロマトグラフカラムに添加する。流量を30~40r/分に調整します。 注:クロマトグラフカラムを追加する前に、グリシン溶出バッファーでスポロゾアイトまたはメロゾアイト沈殿を再懸濁します。</li>
	<li>グリシン溶出緩衝液を50 mLの管に集める。溶出プロセス中のスポロゾサイトまたはメロゾサイトの顕微鏡検査の結果に従って収集を停止します。</li>
	<li>グリシン溶出緩衝液を600xgで10分間遠心分離し、スポロゾアイトまたはメロゾアイト沈殿を新しい1.5mLチューブに移す。</li>
	<li>煙球細胞計を使用してスポロゾサイトまたはメロゾサイトを数えます。</li>
</ol>

<ol><li>Suo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+and+economic+benefits+of+Supercox%2C+a+live+anticoccidial+vaccine+in+a+commercial+trial+in+broiler+chickens+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Parasitology%22%5BJournal%5D)">The efficacy and economic benefits of Supercox, a live anticoccidial vaccine in a commercial trial in broiler chickens in China.</a> Veterinary Parasitology. 142 (1-2), 63-70 (2006).</li>
<li>Kim, K., Soldati, D., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+replacement+in+Toxoplasma+gondii+with+chloramphenicol+acetyltransferase+as+selectable+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene replacement in Toxoplasma gondii with chloramphenicol acetyltransferase as selectable marker.</a> Science. 262 (5135), 911-914 (1993).</li>
<li>Sibley, L. D., Messina, M., Niesman, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+DNA+transformation+in+the+obligate+intracellular+parasite+Toxoplasma+gondii+by+complementation+of+tryptophan+auxotrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stable DNA transformation in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii by complementation of tryptophan auxotrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5508-5512 (1994).</li>
<li>Donald, R. G., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+molecular+transformation+of+Toxoplasma+gondii%3A+a+selectable+dihydrofolate+reductase-thymidylate+synthase+marker+based+on+drug-resistance+mutations+in+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stable molecular transformation of Toxoplasma gondii: a selectable dihydrofolate reductase-thymidylate synthase marker based on drug-resistance mutations in malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (24), 11703-11707 (1993).</li>
<li>Soldati, D., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transfection+and+expression+in+the+obligate+intracellular+parasite+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transient transfection and expression in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii.</a> Science. 260 (5106), 349-352 (1993).</li>
<li>Goonewardene, R., Daily, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+the+malaria+parasite+and+expression+of+firefly+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transfection of the malaria parasite and expression of firefly luciferase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5234-5236 (1993).</li>
<li>Kelleher, M., Tomley, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+of+beta-galactosidase+in+differentiating+sporozoites+of+Eimeria+tenella%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Transient expression of beta-galactosidase in differentiating sporozoites of Eimeria tenella.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 97 (1-2), 21-31 (1998).</li>
<li>Clark, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolbox+facilitating+stable+transfection+of+Eimeria+species%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">A toolbox facilitating stable transfection of Eimeria species.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 162 (1), 77-86 (2008).</li>
<li>Yan, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transfection+of+Eimeria+tenella%3A+Constitutive+expression+of+the+YFP-YFP+molecule+throughout+the+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Stable transfection of Eimeria tenella: Constitutive expression of the YFP-YFP molecule throughout the life cycle.</a> International Journal for Parasitology. 39 (1), 109-117 (2009).</li>
<li>Qin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+Eimeria+mitis+with+Yellow+Fluorescent+Protein+as+Reporter+and+the+Endogenous+Development+of+the+Transgenic+Parasite%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Transfection of Eimeria mitis with Yellow Fluorescent Protein as Reporter and the Endogenous Development of the Transgenic Parasite.</a> PloS One. 9 (12), e114188(2014).</li>
<li>Duan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transfection+of+Eimeria+necatrix+through+nucleofection+of+second+generation+merozoites%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Stable transfection of Eimeria necatrix through nucleofection of second generation merozoites.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. , 1-5 (2019).</li>
<li>Li, Z. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Eimeria+mitis+expressing+chicken+interleukin+2+stimulated+higher+cellular+immune+response+in+chickens+compared+with+the+wild-type+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Transgenic Eimeria mitis expressing chicken interleukin 2 stimulated higher cellular immune response in chickens compared with the wild-type parasites.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 533(2015).</li>
<li>Clark, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eimeria+species+parasites+as+novel+vaccine+delivery+vectors%3A+anti-Campylobacter+jejuni+protective+immunity+induced+by+Eimeria+tenella-delivered+CjaA%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Eimeria species parasites as novel vaccine delivery vectors: anti-Campylobacter jejuni protective immunity induced by Eimeria tenella-delivered CjaA.</a> Vaccine. 30 (16), 2683-2688 (2012).</li>
<li>Eckert, J., Braun, R., Shirley, M. W., Coudert, P. Eimeria species and strains of chickens. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEckert%2C+J+%22Biotechnology%3A+Guidelines+on+techniques+in+coccidiosis+research%22">Biotechnology: Guidelines on techniques in coccidiosis research</a>. Part. I: Eimeria and Isospora, Office for official publications of the European communities. Luxembourg. 1-24 (1995).</li>
<li>Kurth, M., Entzeroth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reporter+gene+expression+in+cell+culture+stages+and+oocysts+of+Eimeria+nieschulzi+%28Coccidia%2C+Apicomplexa%29%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology+Research%22%5BJournal%5D)">Reporter gene expression in cell culture stages and oocysts of Eimeria nieschulzi (Coccidia, Apicomplexa).</a> Parasitology Research. 104 (2), 303-310 (2009).</li>
<li>Tao, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Eimeria+magna+Perard%2C+1925+Displays+Similar+Parasitological+Properties+to+the+Wild-type+Strain+and+Induces+an+Exogenous+Protein-Specific+Immune+Response+in+Rabbits+%28Oryctolagus+cuniculus+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transgenic Eimeria magna Perard, 1925 Displays Similar Parasitological Properties to the Wild-type Strain and Induces an Exogenous Protein-Specific Immune Response in Rabbits (Oryctolagus cuniculus L.).</a> Frontiers in Immunology. 8, 2(2017).</li>
<li>Shi, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+Transfection+of+Eimeria+intestinalis+and+Investigation+of+Its+Life+Cycle%2C+Reproduction+and+Immunogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Stable Transfection of Eimeria intestinalis and Investigation of Its Life Cycle, Reproduction and Immunogenicity.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 807(2016).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+telomerase-interacting+OTU+protein+of+Eimeria+tenella+and+its+telomerase-regulating+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+et+Biophysica+Sinica%22%5BJournal%5D)">A novel telomerase-interacting OTU protein of Eimeria tenella and its telomerase-regulating activity.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 49 (8), 744-745 (2017).</li>
<li>Li, J. N., Zou, J., Yin, G. W., Liu, X. Y., Suo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid+DNA+could+be+delivered+into+Eimeria+maxima+unsporulated+oocyst+with+gene+gun+system%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Polytechnica+Hungarica%22%5BJournal%5D)">Plasmid DNA could be delivered into Eimeria maxima unsporulated oocyst with gene gun system.</a> Acta Polytechnica Hungarica. 60 (4), 431-440 (2012).</li>
</ol>

1990年代には、アピコンプレックス寄生虫に対するトランスフェクションシステムが開発され、それが、それが、アイメリアン寄生虫の研究のために使用されました。最近、E.テネラ8、9およびE.ニエシュルジ15で安定したトランスフェクションが行われた。第二世代メロゾアイト11をトランスフェクションすることにより、E.necatrixの安定したトランスフェクションを達成した。翼静脈を介したE.アセアルヴリンナのトランスフェクトされたスポロゾイトの接種は、E.アセウルブリナのスポロゾイトが凝集経路を介して接種できないことを解決した(Zhang et al.、未発表データ)。ここでは、研究者がアイメリアン寄生虫を求核化するのを助ける詳細なトランスフェクション手順について説明した。
これまでの研究で...

エイメリア属は尾骨症を引き起こし、家畜や家禽産業で大きな経済的損失を引き起こします。抗コクシディアル薬、およびある程度、減価された抗コクシディアルワクチンは、尾骨症の制御のために広く使用されているが、それらの薬剤耐性、薬物残基、および毒性を取り戻すワクチン株の潜在的な拡散に関する欠点は依然として1である。分子生物学の発展に伴い、遺伝子機能の研究、新しいワクチンの開発、エイメリアの新薬標的のスクリーニングに重要なツールとなっています。
過去数十年で、トランスフェクションは、マラリア原虫やトキソプラズマ・ゴンディ2、3、4、5、6などのアピコンプレックス寄生虫に対して正常に適用されてきました。E.テネラでのトランスフェクションのレポーターとしてβ-galを用いた研究は、エイメリア7でそのような仕事を操縦した。E. テネラ8,9, E. ミツ10,及びE.アセルヴリナ(張ら,未発表データ)のトランスフェクションは、ニワトリで成功した。最近、核不同を介してE.ゼネクトリクスのメロゾアテスを用いてトランスフェクションを達成した。
研究は、異種抗原を発現するエイメリアが、カンピロバクター・ケジュニ抗原A(CjaA)またはチキンインターロイキン2(chIL-2)12、13を発現するもののような組換えワクチンとして開発される可能性を有することを示した。したがって、このプロトコルは、ニワトリにおけるエイメリア属菌の核外突起研究を記述する。この手順は、スポロゾアイトまたはメロゾアイトの精製、プラスミドDNAによる核オフェクション、クロアカル接種/静脈注射および生体内伝播を記述し、研究者がトランスジェニック・エイメリア寄生虫の研究を開始するのを助ける。

<table><tbody><tr><td>ATP-二ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>セルロースDE-52</td><td>Solarbio</td><td>C8350</td><td></td></tr><tr><td>定流量ポンプ</td><td>上海京科工業株式会社</td><td>HL-2B</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>MACGENE</td><td></td><td></td></tr> CM15019<tr><td>ガラスビーズ</td><td>Σ</td><td>Z250473-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Σ</td><td>V900116</td><td></td>号</tr><tr><td>グリシン</td><td>ビオトッピング</td><td>G6200</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>MACGENE</td><td>CC016</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td></td><td>Σ V900041</td><td></td>号</tr><tr><td>低速遠心分離機</td><td>北京時代北里遠心分離機有限公司</td><td>DT5-2</td><td></td></tr><tr><td>マグネティックミキサー</td><td>SCILOGEX</td><td>MS-H280-Pro</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>449164</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo セルソーター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>米国 201309995</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレオフェクションデバイス</td><td>LONZA/amaxa</td><td>90900012 (Nucleofector II)</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td>P1010</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (DG グラジエントストック溶液)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-09</td><td></td></tr><tr><td>タウロデオキシコール酸ナトリウム水和物</td><td>Sigma</td><td>T0875</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 17 微量遠心分離機</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75002430</td><td></td></tr><tr><td>DMEM の組成: 4.5 g/L グルコースとピルビン酸ナトリウム、L-グルタミン、25 mM HEPES。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>Solarbio</td><td>T8150</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>北京北TZ-バイオテクノロジー Develop.co。</td><td>HQ-60-II</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバスサーモスタット</td><td>Grant Instruments (Cambridge), Ltd.</td><td>GD120,GM0815010</td><td></td></tr></tbody></table>

ニワトリエイメリア寄生虫の核形成と生体内伝播

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

トランスフェクションは、DNAや二本鎖RNAなどの遺伝物質を細胞に送達して目的の遺伝子を改変する技術プロセスです。現在、トランスジェニック技術は、家禽および家畜における尾骨症の原因物質であるエイメリアの研究に不可欠なツールになりつつあります。このプロトコルは、アイメリアン寄生虫における安定したトランスフェクションの詳細な説明を提供します:スポロゾーサイトまたは第二世代メロゾサイトの精製と核形成、およびトランスフェクト寄生虫の生体内伝播。このプロトコルを使用して、我々はエイメリアのいくつかの種でトランスフェクションを達成した。一緒に、 核素子は、アイメリアン寄生虫の遺伝子操作を容易にするのに有用なツールです。

このプロトコルは、エメリアン寄生虫をトランスフェクトするために使用されています。本研究では、E.ゼネクトロスの第2世代メロントおよびメロゾイントを図2Aおよび図2Bに示したが、図2Cおよび図2Dは、密度勾配溶液を使用した後のE.テネラのスポロシストおよびスポロゾインを示した。E.ネカトリクス(図3A)およびE.テネラ(図3B)...

ここでは、スポロゾアイトや第二世代メロゾサイトを核電化して、ニワトリエイメリア寄生虫の安定したトランスフェクションを実現する方法を提供しました。異種抗原遺伝子を発現する遺伝子組み換えアイメリアン寄生虫はワクチン送達剤として用いることができる。

Transfection is a technical process through which genetic material, such as DNA and double-stranded RNA, are delivered into cells to modify the gene of ...

エイメリア種のトランスフェクションプロトコルの確立は、遺伝子機能の研究を進め、新しいワクチンを開発し、エイメリアの新しい薬物標的をスクリーニングするのに役立ちます。この技術を用いて、我々は、エイメリアのいくつかの種のトランスフェクションを達成し、核の切除は、有腸寄生虫の遺伝子操作の適用を容易にする有用なツールである。Eimeriaの核分裂は、インビトロで培養できない他の寄生虫のトランスフェクションの参照を提供し、その遺伝子操作の研究を加速させる。このテクニックを初めて試す場合は、実験中のスクランブルを避けるために、トランスフェクションの開始前に試薬とその器具を十分に準備する必要があります。この方法の実現は、エイメリアのトランスフェクションに焦点を当てた人々がこの実験の複雑な詳細を見るのに役立ちます。スポロシストの放出から始めて、遠心分離機は2、300回gの2分間のジクロメートカリウム溶液中の7つの胞子に10回10回。PBSで3回洗います。ペレットをPBSの1ミリリットルで再懸濁し、混合物を15ミリリットルのチューブに移します。直径1ミリメートルのガラスビーズを同量に加え、渦ミキサーを使用してオーシストサスペンションを振動させ、胞子嚢胞を放出します。毎分、顕微鏡でスポロシストの放出を監視する。90%以上の卵嚢胞が壊れている場合は、渦を止める。新しい1.5ミリリットルチューブにスポロシストサスペンションを移し、遠心分離機を1,600倍gで5分間移動します。沈殿物を50%の濃度勾配溶液の1ミリリットルで再懸濁し、遠心分離機を10,000グラムで1分間再懸濁する。スポロゾイトを放出するには、排泄バッファーで沈殿物を再懸濁し、42°Cの水浴中で40〜60分間インキュベートして、スポロゾイトを放出する。除電中に5分に1回チューブを振ります。90%以上のスポロゾイトが放出されたら、インキュベートを中止する。600回gで遠心分離機を10分間。55%密度勾配溶液の1ミリリットルで沈殿を再懸濁し、10,000倍gでチューブを1分間遠心分離します。1ミリリットルのPBSで沈殿を再懸濁し、ヘモサイトメーターを用いてスポロゾアイトを数える。エイメリア・ネカトリクスの第二世代のメロゾアイトを採取するには、黄身の茎からイレオセカールオリフィスに長手持ちの鶏腸を切り、ペトリ皿でPBSまたはHBSSで3回そっと洗う。腸を粉々に切り、消化バッファー付きの円錐形フラスコに入れます。フラスコを37°Cの磁気ミキサーに置き、30〜60分間攪拌バーを置き、メロゾアイトを放出します。30分のインキュベーションの後、5分ごとに顕微鏡検査によってメロゾイトの放出を監視する。メロゾイトを精製するには、消化したメロゾイトを含む懸濁液を4層のガーゼに注ぎ、50ミリリットルのチューブにフィルターをかけ、チューブを6

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ファインチップを使用すると、我々はニワトリの体節や神経管のサブドメインにプラスミドDNAを注入するマイクロピペット。プラスミドの濃度は、単一のトランスフェクションされた細胞を生成するために調整されます。私たちは、その後、細胞はクローン集団に発展することができます。...

鶏胚における単一細胞のトランスフェクション

後のインキュベーション段階（ハンバーガーとハミルトンステージ（HH）22歳以上）でニワトリ胚への遺伝子導入方法が記載されています。このメソッドは次の欠点を克服する...

して、古いニワトリ胚への遺伝子導入<em&gt; EX OVO</em&gt;エレクトロポレーション

出典： Yates, J. G. E., 他 アロントイス液からの高タイター組換えニューカッスル病ウイルスの調製 J. Vis. Exp.

有精卵の尿膜液からのウイルスの精製

このビデオでは、蛍光レポータータンパク質をコードするプラスミドDNAをニワトリEimeria寄生虫のスポロゾイト型に送達するエレクトロポレーションベースのトランスフェクション手順であるヌクレオフェクションについて説明します。...

寄生虫形態のヌクレオフェクション:蛍光タンパク質コードプラスミドをスポロゾイト核に送達するためのエレクトロポレーションベースのトランスフェクション法

ニューカッスル病ウイルス（NDV）は広く、とりわけ、ワクチン接種および治療のための新たなベクターを開発するために、ここ数年で研究されてきた。これらの研究は、そのような私たちがここで説明しているようなcDNAから組換えウイルスを救出するための技術、することが可能となっている。...

cDNAからの組換えニューカッスル病ウイルスのレスキュー

ニワトリ胚網膜細胞培養物は、感光体の生物学の研究のための貴重なツールを構成しています。私たちは文化の前に網膜のプラスミドエレクトロポOVOの元に基づいて、効率的な遺伝子導入技術を開発しました。この技術はかなりこのシステムの実現可能な遺伝子操作を行う、現在利用可能なプロトコルを介してトランスフェクション効率を向上させます。...

初代細胞培養研究のためのひよこ網膜における効率的な遺伝子導入：元オボエレクトロポレーションアプローチ

肥沃な鶏卵は、大量のヒトインフルエンザA型ウイルスを生産するために広く使用されており、ウイルスの高収量を証明するための便利で費用対効果の高いシステムを提供します。...

鶏卵卵におけるインフルエンザウイルスの伝播

鶏のエイメリア感染の診断は依然として厳しいものです。寄生虫の形態学および宿主の病理学主導のアプローチは一般的に決定的ではありませんが、PCRに基づく分子アプローチはコストと専門知識において厳しいことが証明されています。このプロトコルの目的は、ループ媒介等温増幅 (LAMP)...

の種特異的検出のためのLAMP法（LAMP）アッセイ<em&gt;アイメリア</em&gt;鶏に感染する

この論文の全体的な目標は、ニワトリ胚への外因性物質の卵管細胞内注入 において...

オヴォで ニワトリ胚における血管内注射

ヒト胚性幹（ES）細胞の増殖

学ぶニワトリエイメリア寄生虫の核形成と生体内伝播。ヌクレオフェクションを用いた遺伝子導入法により、遺伝子改変寄生虫の作製とワクチン開発への応用可能性を示します。

ニワトリエイメリア寄生虫の核形成と生体内伝播

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