Name: 空気-液体界面で培養したヒト肺細胞を曝露した空気中粒子の急性吸入毒性の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 学ぶ、空気-液体界面で培養したヒト肺細胞を用いた空気中粒子の急性吸入毒性評価法。ラジアルエロゾル分布システムで均一な粒子曝露を実現し、動物実験を削減する予測的in vitroスクリーニング手法です。

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この研究は、ドイツ連邦教育研究省(ドイツ連邦大臣フュル・ビルドゥン・ウント・フォルチュン、BMBF、ドイツ(グラント031A581、サブプロジェクトA-D))、ドイツ研究財団(ドイツフォルシュンシュゲセルシャフト、DFG) によって支援されました。研究研修グループ GRK 2338)。

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</ol>

著者らは、AT、KG、AB、SH、HM、TG、HTおよびDSは開示するものは何もない。同社カルテックステクノロジーGmbH(旧カルテックス研究所GmbH)は、この記事で使用される楽器(例えば、CULTEX RFS、CULTEX DG)を生産しています。NMは、この研究の間にカルテックス研究所GmbHの従業員でした.OKは、カルテックステクノロジーGmbH(旧カルテックス研究所社)の従業員です。デバイスの特許PCT /EP2009/007054は、カルテックステクノロジーGmbH教授ウルリッヒ・モール(旧カルテックス研究所GmbH)の創設者によって保持されています。

近年、吸入可能粒子の急性吸入ハザードに関する情報を得て、3R原則25に従って動物実験を低減・置換するために、多くの非動物吸入毒性試験モデルが開発されている。
細胞培養モデルの面では、細胞の曝露は、水没条件下またはALIで行うことができる。水没した条件下で細胞を曝露すると、物理化学的性質に影響を及ぼす可能性があり、したがって、被験物質12の毒性特性を示す。しかし、インビトロALI吸入モデルは、水没した暴露よりも生物学的および生理学的類似性が高いヒト暴露状況を模倣し、したがって、空中粒子の急性吸入毒性の分析に適している。他の既存の露光モジュールに関するCULTEX RFSの重要性は、ALI条件下での細胞の露出だけでなく、粒子の非常に均質な分布と堆積でもあります。線形エアロゾル誘導を用いた逐次露光モデルとは対照的に、この露光法のモジュラー設計は、細胞17上の粒子の非常に均質な堆積に至る放射状供給ラインを可能にする。
<p class="j...

有毒な空中粒子の吸入は公衆衛生上の懸念であり、世界中で多数の健康上のリスクをもたらし、毎年何百万人もの死者が年間1,2.気候変動、現在進行中の産業発展、エネルギー、農業、消費者製品の需要の高まりは、過去数年間で肺疾患の増加に貢献しています3,4,5,6.急性吸入毒性に関する吸入可能物質の知識と評価は、危険評価とリスク管理の基礎を提供するが、この情報は、これらの物質7、8の広い範囲にはまだ欠けている。2006年以来、EUの化学法学REACH(化学物質の登録、評価、認可および制限)は、市場に投入される前に、既に既存および新たに導入された製品が吸入経路を含む毒物学的特性を受けることを要求する。したがって、REACHは、代替および動物フリーの方法、"3R"原理の実施(動物実験の交換、改良、および低減)および適切なin vitroモデル9の使用に焦点を当てています。近年、空気中の粒子5,7,10,11の急性吸入毒性を評価するために、多くの異なる、十分な非動物吸入毒性試験モデル(例えば、インビトロ細胞培養、肺オンチップモデル、精密切断肺スライス(PCLS))が開発されている。in vitro細胞培養モデルの観点から、培養された細胞は、水没条件下またはALI(図1)で暴露することができる。しかし、水没した暴露試験の妥当性は、空気中の化合物、特に粒子の毒性の評価に関して限定される。水没暴露技術は、ヒト生体内の状況に対応していない。細胞を覆う細胞培養培地は、物理化学的性質に影響を及ぼし、従って、被験物質12、13の毒性特性に影響を及ぼす可能性がある。ALIインビトロ吸入モデルは、細胞培養培地を被験粒子と干渉することなく、細胞を被験物質に直接曝露することができ、従って、水没暴露12、14よりも高い生理学的および生物学的類似性を有するヒト暴露を模倣する。
REACHなどの規制プロセスに関しては、しかし、動物モデルのみが急性吸入毒物学の分野で利用可能であり、現外法は十分に検証されておらず、公式に受け入れられなくなったため、これまでに14。この目的のために、テストモデルは、試験の有効性に関する動物実験代替のための欧州連合参照研究所(EURL-ECVAM)の原則に従って検証されなければならない。
以前の検証前調査と最近完了した検証調査は、CULTEX RFS露光システムの適用領域とその転写性、安定性、再現性13を実証した。この露光システムは、細胞16上の連続的な流れにおける放射状エアロゾル分布概念および試験エアロゾルの伝導により、ALIでのガス、粒子または複雑な雰囲気(例えば、タバコの煙)への細胞の均質な暴露を可能にするインビトロ細胞ベースの露光システムである。このラジアルフローシステムの基本モジュールは、インレットアダプタ、ラジアルエアロゾル分布を備えたエアロゾルガイドモジュール、サンプリングおよびソケットモジュール、ハンドホイール付きロックモジュール(図2)で構成されています。生成された粒子は、インレットアダプタおよびエアロゾル誘導モジュールを介して細胞に到達し、サンプリングモジュールの3つの放射状に配置された露光室に位置する細胞培養インサートに堆積される。エアロゾルガイドモジュールとサンプリングモジュールは、外部の水浴17に接続することによって加熱することができます。
両方の研究の枠組みの中で、A549細胞はすべての暴露実験に使用された。細胞株A549は、ヒト不死化上皮細胞株であり、非常によく特徴付けられるものであり、多数の毒物学的研究においてII型肺胞上皮細胞のインビトロモデルとして使用されている。細胞は、ラメラ体、界面活性剤の産生および炎症関連因子の数18によって特徴付けられる。彼らはまた、その粘液産生19に起因する気管支上皮細胞の特性を示す。さらに、彼らはALIで培養することができます。この細胞株は細胞間接触を構築する上で欠乏しているが、これらの細胞の培養ははるかに便利であり、コストが安く、それに由来する結果は一次細胞20に比べてドナー非依存である。
A549細胞を6ウェル細胞培養インサート(PET膜、4.67cm2、孔径0.4mm)で、インサートあたり3.0 x105細胞の密度で播種し、水没した状態で24時間培養した。その後、3つの独立した実験室で細胞を曝露し、ALIで20の試験物質の清浄な空気および3つの異なる暴露用量(25、50、および100 μg/cm2)を行った。露光量は、15、30、または60分後に細胞上に25 μg/cm 2、50μg/cm2、100 μg/cm2の一定の粒子速度をもたらす沈着時間に相関する。しかし、堆積粒子は、堆積後は洗い流されず、24時間細胞上に残った。したがって、粒子の堆積時間は15、30、60分であったが、細胞の暴露は合計で24時間続いた。試験物質の沈着速度は、前の方法17に従った予備実験で決定した。
毒性の指標としての細胞生存率は、細胞生存率アッセイを用いて粒子沈着後24時間評価した。特に、クリーンエアコントロールの品質、露出プロトコルの最適化と改良、実験室内再現性、予測モデル(PM)の確立に特に焦点を当てました。細胞生存率が50%以下に低下した物質(PM 50%)または75%(午後75%)3つの曝露用量のいずれかで、急性吸入の危険を及ぼすと考えられた。その後、既存のin vivoデータ(OECDテストガイドライン(TG)403またはTG 43621、22に従った少なくとも1つの信頼性の高い研究に基づいて、83%の特異性と88%23の感度を有する85%の全体的な一致性に導いた。
細胞生存率の測定に加えて、サイトカイン放出、LDHアッセイによる細胞ライセートまたは膜完全性の検査などの他のエンドポイントは評価できるが、検証試験には必要ではなかった。したがって、露光システム(例えば、CULTEX RFS)は、試験された空気中粒子の急性吸入毒性の定性評価のための予測スクリーニングシステムとして証明され、動物試験に対する有望な代替方法を表した。この暴露システムを使用して空気中の粒子に対する暴露実験には、以下のプロトコルが推奨されます。

<table><tbody><tr><td>Cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture culture culture medium and supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Biochrom, Berlin, Germany</td><td>FG 0415</td><td>増殖培地として使用</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco-Invitrogen, Darmstadt,</td><td>Germany 22320</td><td>を曝露培地として使用</td></tr><tr><td>FBS superior</td><td>Biochrom, Berlin, Germany</td><td>S 0615</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin (10mg/mL)</td><td>Biochrom, Berlin, Germany</td><td>A 2710</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Th. Geyer, Renningen, Germany</td><td>L 0180</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biochrom, Berlin, Germany</td><td>L 1825</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%)</td><td>Biochrom, Berlin, Germany</td><td>L 2143</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CASYカップ</td><td>Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany</td><td>REF 05651794</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養プレート</td><td>Corning, Wiesbaden, Germany</td><td>3516</td><td>6&shy;-well plates</td></tr><tr><td>Corning Transwell cell culture inserts</td><td>Corning, Wiesbaden, Germany</td><td>3450</td><td>24mm inserts; 6-&shy;ウェルプレート;0.4 &micro;m</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CASYton</td><td>Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany</td><td>REF 05651808001</td><td></td></tr><tr><td>Compressed Air (DIN EN 12021)</td><td>Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschlei&szlig;ハイム、ドイツ</td><td>2290152</td><td></td></tr><tr><td>WST-1</td><td>アブカム、ケンブリッジ、イギリス</td><td>ab155902</td><td></td></tr><tr><td>Instruments + equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CASY Cell Counter</td><td>Sch&auml;rfe System GmbH、ロイトリンゲン、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>循環サーモスタット</td><td>LAUDA、Lauda-K&ouml;ニグスホーフェン、ドイツ</td><td>Ecoline RE 100</td><td></td></tr><tr><td>CULTEX HyP - 油圧プレス</td><td>Cultex&reg;Technology GmbH、ハノーバー、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CULTEX インサートスリーブ</td><td>Cultex&reg;Technology GmbH, Hannover, Gemany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CULTEX RFS - ラジアルフローシステムタイプ2(粒子露光用モジュール)</td><td>Cultex&reg;Technology GmbH, Hannover, Gemany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CULTEX RFS - ラジアルフローシステムタイプ2(清浄空気曝露用モジュール)</td><td>Cultex&reg;Technology GmbH、ハノーバー、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CULTEX 供給</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>フローコントローラー 0-30 ml/min (IQ-Flow)</td><td>ブロンコスト ドイツ北 GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フローコントローラー 0-1,5 リットル/分 (EL-Flow)</td><td>ブロンコスト ドイツ北 GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フィルター (大)</td><td>Munktell &Filtrak GmbH、ザクセン、ドイツ</td><td>LP-050</td><td>Munktell滅菌フィルター;粒子保持効率 > 99,999%</td></tr><tr><td>フィルター (小)</td> <td>Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany</td><td>9933-05-DQ</td><td>Balston 使い捨てフィルター</td></tr><tr><td>中型ポンプ</td><td>Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany</td><td>Ismatec IPC 高精度マルチチャンネルディスペンサー</td><td>デジタル蠕動ポンプ</td></tr><tr><td>マイクロプレートリーダー Infinite M200 Pro</td><td>Tecan Deutschland GmbH, クライルスハイム, ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>真空ポンプ</td><td>KNF、フライブルク、ドイツ</td><td>N86 KT.18</td><td></td></tr><tr><td>V&ouml;gtlin マスフローコントローラー 0,2-10 l/min</td><td>TrigasFI GmbH</td><td>V&ouml;gtlin red-y コンパクトレギュレーター、Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>LAUDA、Lauda-K&ouml;ニグスホーフェン、ドイツ</td><td>エコラインスターエディションRE 104</td><td></td></tr></tbody></table>

空気-液体界面で培養したヒト肺細胞を曝露した空気中粒子の急性吸入毒性の評価

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

ここでは、アリで培養されたヒト肺細胞をガス、粒子、または複雑な雰囲気(例えば、タバコの煙)に均質に暴露することを可能にする特別に設計されたモジュラーインビトロ露光システムを提示し、現実的な生理学的な結果を提供する人間の肺胞領域の尖面表面の空気への暴露。線形エアロゾルガイダンスを用いた逐次露光モデルとは対照的に、ラジアルフローシステムのモジュラー設計は、試験雰囲気を細胞に連続的に生成し、輸送するためのすべての要件を満たし、均質な分布および堆積粒子と大気の連続的な除去。この露光方法は、主に空気中の粒子への細胞の暴露のために設計されていますが、エアロゾル生成方法と露光モジュールの材料に応じて、液体エアロゾルおよび高毒性および積極的なガスの暴露に適応することができます.
最近完了した検証研究の枠組みの中で、この暴露システムは、空気中の粒子の急性肺細胞毒性の定性的評価のための移動可能で再現性および予測スクリーニング方法として証明された、通常、この毒物学的評価を提供する動物実験を減らすか、置き換える可能性がある。

CULTEX RFSはALIで細胞の直接および均質な露出を可能にする特別に設計されたモジュラーのインビトロ露出システムである。以前の検証前の研究では、この暴露システムの一般的な適用性とその転写性、安定性および再現性が実証された。ドイツ連邦教育研究省が資金を提供した最近の研究プロジェクトでは、暴露システムが検証され、試験された化合物の急性吸入危険の予測モデル(PM)として確立されました。検証前の調査でクリーンエアコントロールの品質が重要なパラメータであることが判明したため、検証の開始時に、いくつかのプロトコルおよびメソッドの最適化(例えば、細胞培養インサートの変更、HEPES濃度を100mMに増加させることによる暴露媒体のpHの安定化)が実施され、非常に安定で再現性の高い結果と、すべてのクリーンな生存率データの大幅な改善が行われました(次に、A549細胞を、3つの独立した実験室で事前に選択された20個の試験物質の3つの異なる暴露用量(25、50および100μg/cm2)に曝露し、細胞毒性(毒性...

我々は、空気-液体界面(ALI)で培養されたヒト肺細胞を暴露することにより、急性肺細胞傷害性に関する空気中の粒子のスクリーニングおよびモニタリングのための堅牢で移動可能で予測可能なインビトロ曝露システムを提示する。

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...

このインビトロ暴露システムを用いて、ALIで培養されたヒト肺細胞を曝露することにより、急性肺細胞傷害に関する空気中粒子のスクリーニングは、動物実験を減らすのに役立つ。この露出システムの主な利点は、均質な分布と細胞上の粒子の位置につながる放射状エアロゾル分布の概念です。細胞を播種する前に、6つのウェルプレートの各ウェルに2.5ミリリットルの強化成長培地を加えます。細胞を含まない細胞培養液を慎重にウェルの中に入れ、細胞培養インサートごとに1ミリリットルの増殖培地を加える。30分間、摂氏37度、炭酸ガス5%でプレートをインキュベートします。細胞のトリプシン化後、10ミリリットルの等張溶液を充填したカップに細胞培養懸濁液の100マイクロリットルを希釈する。カップを揺らさずにゆっくりと傾けます。セルカウンターで、A549細胞の細胞特異的測定パラメータに基づいて、ミリリットル当たりの生存細胞数と細胞生存率を決定します。プレートの焼戻し後、細胞培養インサート内の培地を吸引し、各細胞培養インサートの1ミリリットル当たり5番目の細胞に3倍の密度でA549細胞の1ミリリットルをシードする。穏やかな揺れによって細胞懸濁液を分配し、24時間インキュベートする。プレスの前面の時間制御を介してプレス時間を設定します。圧縮空気バルブで圧縮空気供給を開きます。プレスの前面に圧力調整器を使用して、圧縮空気圧を約2つのバーに設定します。引き出しを引き出し、押しボタンを押して、デジタル圧力スイッチの押圧を読み取ります。少量の被検物質で物質容器を充填します。プランジャーを物質容器に入れ、少し前後に回して粉末を均等に分配します。物質容器をプランジャー付きで引き出しに入れ、プレスボタンを押します。ドロワーを開け、プランジャを取り外します。重要なステップは、安定した微粒子暴露を可能にするために、物質容器内の粉末ケーキに特異的に圧縮しなければならない試験物質のプレスです。エアロゾル誘導モジュールから入口アダプターとコンデンセートリフレクターを取り外します。エアロゾル誘導モジュールの3つのエアロゾル給電孔を、プラグ付きのプラグと、サンプリングモジュールの中程度の供給接続をダミーフラップで閉じます。エアロゾル誘導モジュールのチューブコネクタに真空ラインを接続します。ハンドホイールを使用してモジュールを閉じ、フローコントローラの値を測定します。閉店の数分後、値は毎分5ミリリットル以下に減少します。エアロゾルジェネレータソフトウェアを起動します。物質スクレーパーが最も低い位置にない場合は、ボタンホーミングモードを押します。プレス試験物質を持つ物質容器を、物質スクレーパーの上に逆さまに置きます。物質容器のガラスが前面に向かっていることを確認します。スロットにロックプレートを置き、黒いネジを締めます。[フィード] と [回転] の値を目的の設定に変更します。下向き矢印を使用して、物質スクレーパーが押された物質の近くまで、物質容器でスライドを押し下げます。マスフローコントローラをタップしてエアロゾル発電機への圧縮空気供給を開き、スタートボタンをクリックしてエアロゾルの生成を開始します。長時間の待ち時間を避けるため、フィードレートを1時間あたり15~20ミリメートルに設定します。溶出器のガラス管の後ろから下から位置する小さな懐中電灯で、微細な塵雲を観察することにより、正しい粒子生成を制御します。事前に加熱された露出媒体で媒体供給を開始し、モジュールが開いている間にダウンパイプが覆われるまでサンプリングモジュールを充填します。露光モジュールにブラインド細胞培養挿入物を挿入し、ダウンパイプが媒体で覆われ、挿入物の下側が媒体に接触するまで露光媒体をポンプダウンさせる。エアロゾル発生器を起動し、露出モジュールを閉じて、露出モジュールをエアロゾル発電機の露出モジュール出口に接続します。リードタイムの30分後、溶出器の露光モジュール出口をゴムプラグで密封し、ブラインドインサートを取り外します。ダウンパイプが媒体で覆われるまで、露出媒体を補充します。ピンセットの助けを借りて、6つのウェルプレートから細胞培養インサートを取り除きます。細胞培養液から慎重に成長培地を注ぎ、挿入物を倒してピペットを使用して吸気し、残留液を捨てます。露出およびきれいな空気モジュールの両方の露出室に挿入物を置く。モジュールを閉じ、エアロゾル発生器の露光モジュール出口とクリーンエアモジュールを同時にキャリアガス供給に接続して、露光実験を開始します。実験が完了したら、露出モジュールとクリーンエアモジュールを取り外し、露出モジュールの出口を密封します。停止ボタンをクリックして、圧縮空気供給とエアロゾル発電機を停止します。露出およびきれいな空気モジュールを開き、準備されたポストインキュベーション6ウェルプレートに細胞培養インサートを移すためにピンセットを使用する。6つのウェルプレートと未露出細胞培養インサートを、摂氏37度で24時間、空気液体界面で5%の二酸化炭素をインキュベートします。露光後24時間、新たに調製した6枚のウェルプレートに細胞培養インサートを挿入する。新鮮な調製されたWST1溶液を各細胞培養挿入物に1ミリリットル添加する。溶液を均一に細胞に分配するためにプレートを慎重に揺らします。セル培養インサートを6つのウェルプレートに37°C、炭酸ガス5%で1時間インキュベートします。その後、上清の100マイクロリットルを各6つのウェルプレートから96ウェルプレートに三重に移します。マイクロプレートリーダーを使用して、参照波長650ナノメートルの450ナノメートルで吸光度を測定します。CULTEX RFSは空気液体のインターフェイスで空気粒子への細胞の直接および同種の露出を可能にする特別に設計されたモジュラーのインビトロ露出システムである。きれいな空気への細胞の暴露は、時間の経過とともに細胞の生存率の低下を招かなくなります。この暴露システムは、試験化合物の急性吸入危険の予測モデルとして正常に検証され、確立された。A549細胞の異なる試験物質への暴露は、無、中、または強い毒性を示した。インキュベーション時間、粒子生成のリードタイム、粒子状堆積時間の時間枠を厳密に保つようにしてください。この露光法は、主に細胞の粒子暴露のために設計されているが、エアロゾルの生成方法を適応させることによって液体エアロゾルおよびガスの暴露に拡張することができる。このスクリーニング方法により、インビトロにおける急性吸入毒性に関する吸入可能粒子の定性的評価が可能となり、通常はこの毒物学的評価を提供する動物実験を低減する。有毒な試験物質を使用することは非常に危険であり、手袋、マスクを着用するなどの予防措置は、常にそのような化合物を取り扱う際に取られるべきであることを忘れないでください。

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マルチパラメータ蛍光活性化細胞選別によるヒトリンパ内皮細胞の単離

学ぶ、空気-液体界面で培養したヒト肺細胞を用いた空気中粒子の急性吸入毒性評価法。ラジアルエロゾル分布システムで均一な粒子曝露を実現し、動物実験を削減する予測的in vitroスクリーニング手法です。

空気-液体界面で培養したヒト肺細胞を曝露した空気中粒子の急性吸入毒性の評価

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