Name: ストレス治療下での細菌増殖の多スケール分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: 学ぶ ストレス下の大腸菌増殖解析法。タイムラプス顕微鏡とフローサイトメトリーで単細胞・集団レベルの生存率、形態、DNA含量を評価し、新規抗菌薬スクリーニングに応用可能です。

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著者らは、hupA-mCherry株、Cytometryの技術支援のためのA.デデュー、およびMicrobeJの助けをA.デュクレットに提供してくれたF.コルネットに感謝します。資金調達:C.レスターリンは、インサームとCNRS機関だけでなく、ATIP-Avenirプログラム、シュルンベルガー教育研究財団(FSER 2019)、プラスメッド研究プログラム(ANR-18-CE35-0008)のためのANR資金だけでなく、J.ケイロンへの資金調達のためのFINOVIを認めます。フローサイトメーター機器の資金調達のためのラリーグコントルル癌。著者の寄稿:C.L.とJ.C.は手順を設計し、論文を書きました。J.C.は実験を行い、データを分析した。

1. 細胞培養、応力誘導、サンプリング手順
注:無菌培養ガラス製品、ピペットチップ、および0.22μmで濾過された成長培地を使用して、背景粒子を避けてください。ここで、細胞培養物は、低自己蛍光豊富な定義培地で増殖する(材料表を参照)7、8。
<ol><li>ルリアブロス(LB)アガロースプレート上の凍結グリセロールストックから目的の細菌株をストリークし(必要に応じて選択的抗生物質を使用)、一晩37°Cでインキュベートする(17時間)。 注:ここで提示した実験例は、大腸菌MG1655 hupA-mCherryを使用しています。この株は、HU核クレオイド関連タンパク質の蛍光タグ付きサブユニットαを生成し、したがって、生細胞9における染色体の光顕微鏡可視化を可能にする。</li>
	<li>単一コロニーで5mLの培地を接種し、1分間に140回転(rpm)で一晩(17時間)振とうで37°Cで成長する。フラスコ(≥50 mL)または大口径(≥2 cm)試験管は、攪拌培養物の満足のいく通気を確保するために使用する必要があります。</li>
	<li>翌朝、600nm(OD600nm)で光学密度を測定し、培養物を新鮮な培地を含む試験管に希釈し、0.01のOD600nmにする。培養物の総体積は、実験中に分析する時間の数に応じて調整する必要があります。</li>
	<li>培養物の200μLサンプルをマイクロプレート(透明な透明な底部が透明なウェルで約0.2mL)にロードし、37°Cでのインキュベーション中にOD600nmモニタリング用の自動プレートリーダー(材料表を参照)に入れます。</li>
	<li>接種した試験管を37°Cで振とう(140rpm)をOD600nm=0.2にインキュベートし、リッチ培地で完全な指数位相に対応する。 注:適切な指数成長を達成する前に、少なくとも4〜5世代の細胞を成長させることが重要です。ステップ1.3で使用される初期接種は、より貧しい培地(すなわち、指数位相がOD 0.2以下に達する場合)、またはより多くの世代が望まれる場合(例えば、特定の生理学的研究や拡張ストレス治療のために)に適応する必要があります。</li>
	<li>OD600nm = 0.2では、t0の時点に対応する以下の培養サンプル(応力誘導前に指数関数的に増殖する細胞):(1)A150μLサンプルをマイクロ流体装置に直ちにロードしてタイムラプス顕微鏡イメージングを行います(セクション2を参照)。(2)希釈およびめっきアッセイのための200 μLサンプル(セクション3を参照)。(3)フローサイトメトリー分析のために氷上に置かれる250μLサンプル(セクション4);。(4) 顕微鏡スナップショットイメージング用にアガロース搭載スライドに直ちに堆積する10μLサンプル(セクション5を参照)。</li>
	<li>試験管内に残っている細胞培養物を、調査したい特定のストレス処理(140rpm)で37°Cでインキュベートする特定のストレス処理にさらします。 メモ:OD600nmモニタリング用の自動プレートリーダーで成長する培養物もストレス処理を行う必要があります。</li>
	<li>ストレス処理後の関連する時点(t1、t2、t3など)で、(1)希釈およびめっきアッセイのための200μLサンプル(セクション2を参照)のストレス培養から以下の細胞サンプルを採取します。(2)フローサイトメトリー分析のために氷上に置く250μLサンプル(セクション3);。(4) 顕微鏡スナップショットイメージング用にアガロース搭載スライドに直ちに堆積する10μLサンプル(セクション4を参照)。 注:各ストレス誘発治療は、線量および時間依存の効率を有する。したがって、最適な結果を得るために使用する治療の用量と持続時間を決定するために予備試験を実行する必要があるかもしれません。これは、一定範囲の用量および暴露時間で処理された細胞培養物の自動プレートリーダー(めっきアッセイに関連する可能性がある)を用いてODモニタリングを行うことによって行うことができる。ここで提示した実験では、 細胞培養物を細胞分裂抑制抗生物質セファレキシン(Ceph.)を5μg/mLの最終濃度で60分間処理し、次いで、遠心分離(475g,5分)を用いて細胞を15mLチューブにペレット化して洗い流し、上清を除去し、細胞ペレットを適当な量で除去した。洗浄した細胞を振とう(140rpm)で37°Cでインキュベートし、回収を可能にした。試料を「セファレキシン-60分処理試料」に対応したセファレキシン添加後60分)、t120(洗浄後60分)、t180(洗浄後120分)で採取した。 </li>
</ol>2. めっきアッセイ
注:めっきアッセイにより、培養試料中にCFUを生成できる細胞の濃度を測定することができます。この手順は、1つの細胞が2つの生存細胞に分裂する速度を明らかにし、細胞分裂の逮捕を検出することを可能にする(例えば、細胞リシスの細菌発生時間の増加)。
<ol><li>培養試料200μLの10~7までの10倍のシリアル希釈を新鮮な培地で調製します。37°Cで一晩インキュベーションした後に3〜300コロニー間を得るために非選択的LBアガロースプレート上の適切な希釈のプレート100μL。 注:新鮮な媒体のシリアル希釈は、細菌分裂を制限するために迅速に行う必要があります。あるいは、希釈プロセス中に細胞分裂を防ぐために、炭素源のない生理線溶液の使用を検討する場合があります。</li>
	<li>翌日、各培養試料中の生存細胞(CFU/mL)の濃度を決定するためにコロニーの数をカウントする。未処理および処理された細胞培養のための時間の関数としてCFU/mLをプロットします。</li>
</ol>3. フローサイトメトリー
注: 次のセクションでは、フローサイトメトリー解析のための細胞サンプルの調製について説明します。この分析技術は、多数の細胞の細胞サイズとDNA含有量の分布を明らかにします。可能であれば、フローサイトメトリーサンプルを直ちに処理することをお勧めします。あるいは、試料を氷上に保持し(最大6時間)、1日の終わりに同時に分析することができ、一度めっきおよび顕微鏡画像化が行われた。
<ol><li>培養試料の250μLを希釈し、4°Cで新鮮な培地中で~15,000細胞/μL(OD600nm~0.06に対応)の濃度で250μLを得た。 注:氷上でのインキュベーションは、細胞の成長と形態学的修飾を制限します。あるいは、ユーザは、フローサイトメトリー10に通常推奨される75%エタノール中の細胞の固定を行うことを検討しがちである。</li>
	<li>DNA染色の場合は、細菌試料をDNA蛍光色素の10μg/mL溶液(比率1:1)と混合し、15分間暗闇の中でインキュベートしてからサンプルを分析します。</li>
	<li>サンプルを~120,000セル/分流量でフローサイトメーターに渡します。順方向散乱(FSC)および側散乱(SSC)光とDNA蛍光色素蛍光シグナル(FL-1)を適切な設定で取得します。</li>
	<li>FSC および FL-1 細胞密度ヒストグラムをプロットして、細胞集団における細胞サイズとDNA含有量の分布を表します。</li>
</ol>4. スナップショット顕微鏡イメージング
注:次の部分では、母集団スナップショット分析のための顕微鏡スライドと画像取得の準備について説明します。この手順は、細胞の形態(細胞の長さ、幅、形状)および核核DNAの細胞内組織に関する情報を提供する。
<ol><li>熱熱式顕微鏡室を37°Cで予熱し、観察を開始する前に温度を安定させます。このチャンバーは、タイムラプス実験中の顕微鏡光学およびサンプル段階の温度変調を可能にする。</li>
	<li>レスターリンとデュバリー7で説明されているように、アガロースマウントスライドを準備します。<ol>
<li>青いフレームの底面からプラスチックフィルムを取り外します(「材料表」を参照)、くり抜かれたプラスチックフィルムを反対側に残します。顕微鏡ガラススライドに青いフレームを貼ります。</li>
		<li>ピペット〜150μLの溶融1%アガロース培地溶液を、青枠コンパートメント内に注いだ。余分な液体を取り除くためにきれいなカバースリップで急速にカバーし、アガロースパッドが室温で固まるまで数分間待ちます。</li>
		<li>セルサンプルの準備ができたら、カバースリップとプラスチックフィルムを青いフレームから取り外します。アガロースパッドに10μLの細胞サンプルを注ぎ、ガラススライドをそっと傾けて液滴を広げます。すべての液体が吸着したら、青いフレームにきれいなカバースリップを貼ってサンプルを密封します。顕微鏡検査スライドは顕微鏡検査の準備ができました。</li>
	</ol>
</li>
	<li>スライドを顕微鏡ステージに置き、透過光(位相差目標)と光源励起を適切な波長(mCherry用560nm)で使用して画像取得を行います。</li>
	<li>画像解析中のセルの自動検出を容易にするために、分離セルを含む視野を選択します。少なくとも 300 のセルが画像化され、細胞集団の堅牢な統計分析が可能であることを確認します。</li>
</ol>5. マイクロ流体タイムラプス顕微鏡イメージング
注:次の部分では、マイクロ流体プレートの調製(「材料表」を参照)、セルローディング、マイクロ流体プログラム、およびタイムラプス画像取得について説明します。このイメージング手順は、個々の細胞の挙動をリアルタイムで明らかにする。
<ol><li>マイクロ流体プレートから保存液を取り出し、マイクロ流体ソフトウェアのユーザーガイドに記載されているように、37°Cに予熱した新鮮な培地に交換します。</li>
	<li>マイクロ流体プレートをマニホールドシステムに密閉し、プライミングボタンをクリックします。</li>
	<li>顕微鏡取得を開始する前に、マニホールドシステムを用いたマイクロ流体プレートを顕微鏡ステージに置き、37°Cで約2時間予熱します。 注:この予熱ステップは、タイムラプス実験中に顕微鏡の焦点を変更し、画像取得を損なうマイクロ流体チャンバーの膨張を避けるために重要です。</li>
	<li>マイクロ流体プレートをシールします。ウェル8の培地を150°Lの培養試料に交換し、ウェル1~5の培地を所望の培地に交換し、応力誘発試薬の有無にかかわらず交換します。</li>
	<li>マイクロ流体プレートを密封し、顕微鏡の段階に置きます。</li>
	<li>マイクロ流体ソフトウェア(材料表を参照)では、セルローディング手順を実行します。透過光で顕微鏡の下を見て、細胞のローディングが満足であることを確認してください。チャンバー内のセル密度が不十分な場合は、セルの読み込み手順をもう一度実行します。</li>
	<li>透過光モードで慎重にフォーカスを実行し、分離された細菌を示すいくつかの視野を選択します。時間の経過と続く単離されたセルの成長を監視できるようにするには、過密でないフィールドを選択することが重要です(100 μm 2 あたり約 10~20セルを推奨)。これにより、画像解析中の細胞検出も容易になります。</li>
	<li>マイクロ流体ソフトウェアで、[プロトコルの作成]ボタンをクリックします。細胞が適応できるように、1-2世代時間相当の増殖培地の注入をプログラムする(オプション)。次いで、2psiで10分間にストレス誘発培地の注入をプログラムし、続いてストレス処理の望む期間について1psiで注射する。ストレス後の細胞の回復を分析する場合は、必要な期間の新鮮な成長培地の注入をプログラムします。 注:ここで提示した実験では、セファレキシンを2psiで10分間注射し、続いて1psiで50分間注射した。次いで、新鮮な成長培地を2psiで10分間注入し、続いて1psiで3時間注射した。</li>
	<li>透過光の位相コントラストと必要に応じてmCherry信号用の560 nm励起光源を使用して、10分ごとに1フレームのタイムラプスモードで顕微鏡イメージングを実行します。 注:マイクロ流体注入プロトコルの開始と同時に、顕微鏡画像取得を開始することが重要です。</li>
</ol>6. 画像解析
注: このセクションでは、スナップショットおよびタイムラプス顕微鏡画像を処理および分析する主な手順について簡単に説明します。顕微鏡画像の開くと可視化はオープンソースImageJ/Fiji(https://fiji.sc/)11で行われます。定量的画像解析は、オープンソースのImageJ/Fijiソフトウェアを使用して、無料のMicrobeJプラグイン12(https://microbej.com)と一緒に行われます。このプロトコルはMicrobeJ 5.13Iバージョンを使用します。
<ol><li>フィジーソフトウェアとMicrobeJプラグインを開きます。</li>
	<li>スナップショット分析では、1つの顕微鏡スライド(1つのサンプル)に対応するすべての画像をMicrobeJローディングバーにドロップして、画像を連結し、得られた画像スタックファイルを保存します。タイムラプスデータの場合は、MicrobeJのロードバーに画像スタックをドロップするだけです。</li>
	<li>位相差画像のセグメンテーションに基づいて細胞の輪郭の自動検出を実行し、必要に応じる場合は、染色されたDNA蛍光シグナルのセグメンテーションに基づいて核体の自動検出を実行します。細胞検出の精度を視覚的に確認し、必要に応じてMicrobeJ編集ツールを使用して補正します。取得した結果ファイルを保存します。 注:大腸菌細胞の検出に使用される設定は、材料表に示されています(MicrobeJのコメント/説明欄を参照)。他の細菌種(特に非棒形細菌の場合)の場合、ユーザーは検出前に設定を改良する必要があります(MicrobeJチュートリアルを参照)。タイムラプス画像の場合、MicrobeJ編集ツールを使用して細胞の半自動検出を実行すると、個々の細胞の運命に焦点を当てることを望む場合があります(MicrobeJチュートリアルを参照)。</li>
	<li>[結果J]アイコンをクリックして解析を完了し、[結果J]ウィンドウを取得します。その時点から、さまざまな種類の出力グラフを生成できます。セルの形状/長さの正規化されたヒストグラムをプロットし、セルあたりの平均核核記号数をプロットします。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは競合する利害関係はないと宣言した。

手順中に細胞の成長状態に注意を払う必要があります。.完全な指数位相に達する前に、数世代にわたって細胞を成長させます。この方法を成功させるためには、すべての細胞サンプルを同時に収集することが重要であり、同時に1つの治療された培養と1つの未処理の培養のみを分析するのが最善です。顕微鏡イメージングのための細胞サンプルは、手順全体を通して実験温度で維持されなければならない。その後、実験開始前に顕微鏡室とマイクロ流体室を予熱することが不可欠です。フローサイトメトリーの細胞サンプルを容易に分析できない場合、それらは最大6時間氷上に保つことができる。あるいは、ユーザは、エタノール75%における細胞の固定化を使用することを検討し、これは通常、フローサイトメトリー10に推奨される。プロトコルが媒体からストレスインダクタを洗浄する必要がある場合、遠心分離機およびピペット細胞は、潜在的な異常な細胞を損傷しないように非常に慎重に。
フローサイトメトリーとスナップショット分析の両方で、細胞サイズとDNAコンテンツパラメータにアクセスでき、スナップショットは細胞形態の追加観察を提供します。DAPI 10(4',6-ジアミディノ-2-フェニルリンドール)または他の安定したDNA染料によるDNA染色は、目的の生物の核核を観察するために蛍光融合が利用できない場合に行うことができる。フローサイトメトリー解析ができない場合は、顕微鏡で多数の細胞を画像化・解析することが重要です。
顕微鏡イメージングは、目的の特定の経路に関与するタンパク質に蛍光融合を運ぶ株を用いて行うこともできる。これは、複製、転写、細胞壁合成、細胞分裂などの様々な細胞プロセスに対するストレスの影響を明らかにするのに役立ちます。この方法は、細菌種の範囲に適用することができ、唯一の要件は、マイクロ流体装置が細胞の形態と互換性を持たなければならないことである。標準的なマイクロ流体プレートは、細胞幅が0.7μm~4.5μmの棒状細菌に便利です。しかし、コッチ、オボコッチ、または特有の形状を持つ他の細菌株をテストする必要があります。あるいは、装置の利用不能または互換性のない細菌株のためにマイクロ流体実験を行うことができない場合、タイムラプスイメージングは、最大持続時間2hのアガロースマウントスライド上で行うことができる。
このマルチスケール分析の全体的な利点は、細菌の増殖能力(すなわち、質量合成、細胞生存率、細胞形態、膜完全性、DNA含有量)および方法のいくつかの側面に対するストレス誘導の影響のグローバルビジョンを提供することである。これらは、ストレス条件下で成長する細菌集団の時間とともに進化します。また、単一細胞レベルおよび集団レベルでの正常な成長の回復を分析することも可能である。このアプローチは、広範囲の細菌種に適用され、抗生物質やその他の抗菌化合物への暴露、多種における他の生物との相互作用の影響の分析など、事実上あらゆる種類のストレス治療に適用可能である。集団、または遺伝子突然変異の効果。

このプロトコルの全体的な目的は、集団および単一細胞レベルでストレス処理にさらされる細菌細胞の挙動を分析することです。細菌の増殖および生存率は、従来、細菌細胞質量合成のプロキシである光学密度モニタリング(OD600nm)を用いて集団レベルで対処され、または培養中の生存細胞の濃度を決定するめっきアッセイ(1ミリリットル当たりのコロニー形成単位、CFU/mL)を決定する。正常な(非ストレス)成長条件下では、細菌の倍増時間は細胞質量増加1、2に直接依存するため、OD600nmおよびCFU/mL測定は厳密に相関している。しかし、この相関関係は、細胞質量合成3、細胞分裂4、または細胞リシスを引き起こす条件下でしばしば破壊される。簡単な例は、細胞分裂を阻害するストレス処理によって提供され、その結果、糸状細菌細胞5、6の形成をもたらす。糸状細胞は、細胞塊合成は影響を受けないため正常に伸びるが、生存細胞に分裂することはできない。培養光学密度は、結果的に通常の速度で経量増加しますが、めっきアッセイ(CFU/mL)によって決定される生存細胞の濃度は増加しません。この場合、他の多くの場合と同様に、光学密度およびめっき測定は有益であるが、観察された応力誘発効果の包括的な理解を提供することができない。これらのアンサンブルアッセイは、ストレス誘発成長欠損の詳細な特性評価を可能にするために、単一細胞解析技術と組み合わせる必要があります。
ここでは、(1)従来のめっきアッセイと基本的な光学密度モニタリングを組み合わせた4つの相補的な実験アプローチを組み合わせた手順について説明します。(2)フローサイトメトリーは、多数の細胞上の細胞サイズおよびDNA含有量パラメータを評価する。(3)細胞形態を解析するための顕微鏡スナップショットイメージング;(4)細胞運命の時間的ダイナミクスを調べるためのマイクロ流体室におけるタイムラプス単細胞イメージングこのマルチスケールフレームワークは、個々の細胞の挙動に照らして、細胞の成長と生存率に対するグローバルな影響を解釈することを可能にします。この手順は、特定の条件下での増殖(すなわち、増殖培地、pH、温度、塩濃度)、または抗生物質または他への暴露を含む、実質的に任意のストレスに対する多様な細菌種の応答を解読するために適用することができる抗菌性化合物。

<table><tbody><tr><td>アガロー</td>ス <td>BioRad</td><td>1613100</td><td>認定分子生物学 アガロース</td></tr><tr><td>Attune NxT アコースティックフォーカシングサイトメーター</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>A24858</td><td>サイトメーター</td></tr><tr><td>CellASIC ONIX マイクロ流体システム</td><td>メルクミリポア</td><td>CAX2-S0000</td><td>マイクロ流体システム</td></tr><tr><td>CellASIC ONIX2 FG</td><td>メルクミリポア</td><td>ONIX2 1.0.1</td><td>マイクロ流体ソフトウェア</td></tr><tr><td>CellASIC ONIX2 マニホールド ベーシック</td><td>メルク ミリポア</td><td>CAX2-MBC20</td><td>マニホールドシステム</td></tr><tr><td>CytoOne 96ウェルプレート 蓋付き</td><td>Starlab</td><td>CC7672-7596</td><td>マイクロプレート、0.2 mL の作業量と透明な平底、</td></tr><tr><td><>em>hupA-mCherry< 融合</td><td></td><td></td><td>のための染色体挿入を運ぶ自動プレートリーダー<em大腸菌/em>株用大腸菌MG1655 Fiji ImageJ https://fiji.sc/ ImageソフトウェアでhupA-mCherryのP1形質導入により作成</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>。</td></tr><tr><td>Gene Frame</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0578</td><td>Blue frame (125 &mu;L, 1,7 x 2,8 cm)</td></tr><tr><td>Luria-Broth アガロース培地</td><td>MP Biomedicals</td><td>3002232</td><td>めっきアッセイ用増殖培地</td></tr><tr><td>MicrobeJ</td><td>Imagej/Fiji プラグイン</td><td>https://www.microbej.com/</td> <td>顕微鏡画像解析プラグイン.Ducret et alを引用してください。出版物で使用されている場合。検出設定:細菌の場合:エリア(&mu;m2):0,1-最大;長さ (&mu;m):0,5-最大;幅 (&mu;m):0,6-最大;範囲 (&mu;m):0,5-最大;角度(rad):0-0,3;0-MAX 他のすべてのパラメータ。ヌクレオイドの場合:許容範囲:500;しきい値: ローカル。他のすべてのパラメータの0-max</td></tr><tr><td>マイクロ流体プレート CellASIC ONIX</td><td>メルクミリポア</td><td>B04A-03-5PK</td><td>マイクロ流体システム</td></tr><tr><td>用プレート 顕微鏡 ニコン エクリプス Ti</td><td>ニコン</td><td></td><td>蛍光顕微鏡</td></tr><tr><td>MOPS EZ リッチ 定義媒体 (RDM)</td> <td>Teknova</td><td>M2105</td><td>成長リッチ培地、10x MOPS 混合物、0,132 M K2HPO4、10x AGCU、5x サプリメント EZ、20% グルコース。0,22 &mu; でフィルタリングm</td></tr><tr><td>SYTO9 緑色蛍光核酸染色</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>S34854</td><td>DNA 蛍光色素</td></tr><tr><td>TECAN Infinite M1000</td><td>TECAN</td><td>30034301</td><td>自動プレートリーダー</td></tr></tbody></table>

ストレス治療下での細菌増殖の多スケール分析

Multi-scale Analysis of Bacterial Growth Under Stress Treatments

ストレス条件下で増殖し生き残る細菌能力の分析は、広範な微生物学研究に不可欠です。抗生物質やその他の抗菌性化合物への暴露、照射、非生理学的pH、温度、塩濃度などのストレス誘発治療に対する細菌細胞の応答を特徴付けることは関連する。異なるストレス治療は、細胞分裂、DNA複製、タンパク質合成、膜完全性、または細胞周期調節を含む異なる細胞プロセスを妨げる可能性があります。これらの効果は、通常、細胞スケールで特定の表現型に関連付けられています。.したがって、ストレス誘発成長または生存率の欠点の程度と因果関係を理解するには、単一細胞と母集団レベルの両方で、いくつかのパラメータを慎重に分析する必要があります。ここで紹介する実験戦略は、従来の光学密度モニタリングとめっきアッセイと、フローサイトメトリーや生細胞におけるリアルタイム顕微鏡イメージングなどの単一細胞解析技術を組み合わせたものです。このマルチスケールフレームワークは、ストレス状態が細菌集団の運命に及ぼす影響について、時間的に解決された記述を可能にします。

記載された手順は、セファレキシンへの一過性暴露時の大腸菌K12細胞の挙動を分析するために用いられたもので、細胞分裂を特異的に阻害する抗生物質である(図1A)13。染色体DNAに関連する蛍光標識HUタンパク質を産生するhupA-mCherry大腸菌株を、この処理を通じて染色体のダイナミクスを調べるために使用された8、9。指数関数的に成長するhupA-mCherry大腸菌細胞を前に分析した(t0)とセファレキシン(t60)でインキュベーションした後60分。次いで、抗生物質を洗い流し、1時間後(t120)及び2時間(t180)後の細胞集団の回復を分析した(図1B)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60576/60576fig1.jpg"> 図1:ストレス治療に対する細菌応答の分析手順(A)メソッドの概略図。(B)リッチ培地における正常成長時およびセファレキシン(Ceph.)への一過性曝露時の細胞形態を示す漫画は、(t0)および(t60)から(t180)までのセファレキシン洗浄後に添加する。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/60576fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
ODおよびCFU/mLの並行進化はストレス処置の効果を理解するのに役立つ最初の指標である。これらの2つのパラメータは、不安定な成長の間に厳密に相関しますが、多くの場合、結合されず、ストレスの下で独立して進化します。セファレキシンの存在下で増殖する細胞培養物は、ストレスのない培養物(図2A)と同様のOD600nmが増加し、薬物が細胞質量合成に影響を及ぼさなかったことを示す。しかしながら、細胞分裂の厳密な阻害によりセファレキシンが存在した場合、生存細胞の濃度は増加しなかった(図2B)。細胞は、セファレキシンを除去したときに再び分裂し始め、最終的にはストレスのない培養物と同等の濃度に達した(t180)。これらの結果は、細胞分裂の完全に可逆的な阻害を誘発するセファレキシンの静菌効果を反映している。異なる応力は、誘導される効果に応じて、ODおよびCFU/mL曲線の異なる結合を生じ得る(例えば、フィラメントまたは膨らみなどの細胞形態の改変、リジスの有無にかかわらず細胞死)。異なる応力誘発効果を示す結果の可能性のある結果の非網羅的なリストを図2Cに示します。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60576/60576fig2.jpg"> 図2:未治療およびセファレキシン処理細胞の細菌増殖モニタリングを集団レベルで示す。(A) 光学密度モニタリング(OD600nm/mL)。(B)未処理およびセファレキシン-60min処理培養中の生存細胞(CFU/mL)の濃度。誤差範囲は、実験三重の標準偏差を示します。(C) 可能な結果および関連する応力効果の概略図。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/60576fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
単一細胞解析は、母集団レベルで観測された応力応答を正確に解釈するために不可欠です。フローサイトメトリーは、数千個の細胞14、15の細胞サイズおよびDNA含有量の検査を可能にする(図3)。セファレキシンへの暴露は、細胞サイズおよびDNA含有量の並行増加を引き起こした(t60)。セファレキシンを除去すると、集団細胞サイズおよびDNA含有量は徐々に減少し、t180の非ストレス集団と同様になった。これらの結果は、セファレキシンがDNA複製を阻害せず、いくつかの染色体同等物を含む糸状細胞の形成を引き起こしたことを示している。これらのフィラメントは、薬物を洗い流したときの正常な細胞サイズとDNA含有量を有する細胞に分けられる。フローサイトメトリーの結果は、DNA合成を阻害するストレスに対して非常に異なり、1つの非複製染色体のみを含む糸状細胞の形成につながります。その場合、細胞サイズも同様に増加しますが、DNA含有量の増加と関連付けられません。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60576/60576fig3.jpg"> 図3:未治療およびセファレキシン-60min処理細胞の代表的なフローサイトメトリー分析(A) 細胞サイズ分布ヒストグラム (FSC-H)。(B)DNA含有量ヒストグラム(FL1-SYTO9)。n = 120,000 個のセルを分析した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/60576fig3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
スナップショット顕微鏡イメージングは、HU-mCherry局在化によって示されるDNAの細胞形態および細胞内組織を調べるために用いた(図4A)。セファレキシンは、正常な細胞幅と分裂性セプタを有さない長い細胞の形成を引き起こした。これらの滑らかなフィラメントには、ヌクレオイドと呼ばれる定期的に間隔を空けたDNA構造が含まれており、セファレキシンが染色体複製および分離に影響を及ぼさなかったことを確認した。定量画像解析では、フローサイトメトリーで以前に観察された細胞サイズとDNA含有量の増加が大きく確認された(図4B,C)。DNA損傷を誘発する応力の結果は大きく異なり、複製は継続するが分離が損なわれる糸状細胞の形成につながります。その場合、細胞サイズとDNA含有量も同様に増加しますが、細胞は単一の非構造化DNA塊を収容します。スナップショット画像はまた、他の種類の異常な細胞形状や、ミニ、アヌクリート、またはリザス細胞(ゴーストセル)の存在を明らかにすることができます。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60576/60576fig4.jpg"> 図4:未治療およびセファレキシン-60min処理細胞の顕微鏡スナップショット分析(A)位相コントラスト(グレー)およびHU-mCherryシグナル(赤色)を示す代表的な顕微鏡画像。(B) 細胞長分布ヒストグラム。スケール バー = 5 μm. (C) 細胞あたりの核核ロイド数のヒストグラム。サンプルごとに800~2,000個の細胞を分析した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/60576fig4large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
マイクロ流体装置16に関連するタイムラプス顕微鏡は、以前に観察された表現型を決定するのに役立ち、成長欠乏症の発症および因果関係に関するさらなる洞察を提供する。タイムラプス画像(図5Aおよびムービー1)は、細胞伸長(細胞質量合成)、および染色体複製および分離がセファレキシンへの曝露によって阻害されないことを確認した。また、セファレキシンを除去した際の回復過程を明らかにした。糸状細胞系統の分析は、薬物を洗い流した後に細胞分裂が〜20分再始動することを示した(図5B)。得られた分裂した細胞は、順番に分裂するので生存可能であり、最終的には正常なサイズおよびDNA含有量を示す33細胞の形成につながった。これにより、実験の180分間にわたる~31分の全生成時間の計算が可能となり、これはCFU/mL測定値(〜33分)からストレスのない集団に対して計算された生成時間に類似した。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60576/60576fig5.jpg"> 図5:セファレキシン-60min処理細胞の顕微鏡検査タイムラプス分析(A)位相コントラスト(グレー)およびHU-mCherryシグナル(赤色)を示す代表的な顕微鏡画像。監視された糸状細胞は白い輪郭で示され、異なる色でセルを分割する。スケールバー =5μm. (B)パネル(A)およびムービー1に対応する糸状細胞系統の概略表現。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/60576fig5large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/60576/60576vid1.jpg"> 動画1:セファレキシンで処理した大腸菌HU-mCherryのマイクロ流体映画。セファレキシンを60分後に注射し、続いて3時間の新鮮なRDM培地の注射を黄色で示した時間(10分ごとに1フレーム)。スケールバー = 5 μm この<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/Movie1.mp4" target="_blank">ビデオを表示するには、ここをクリックしてください(右クリックしてダウンロードしてください)。</a>

このプロトコルは、単一細胞および細胞集団レベルでのストレス条件下での細菌増殖の時間分解された記述を可能にする。

Analysis of the bacterial ability to grow and survive under stress conditions is essential for a wide range of microbiology studies. It is relevant to ...

この方法の全体的な目的は、単一細胞と集団レベルの両方で、細菌細胞に対するストレス処理の効果を分析することです。細胞の生存率、形態、DNA含有量など、細菌増殖のいくつかの側面に対するストレスの影響に関するグローバルなビジョンを提供します。また、人口の回復を特徴付けることもできます。この方法は、新しい抗菌分子の活性をスクリーニングし、細菌の生存率と成長への影響を理解するために製薬業界で使用することができます。ストレス誘発治療は、用量や時間依存性などの非効率性を有する。このプロトコルを開始する前に、最適な用量と治療期間を決定するために予備試験を実行する必要があるかもしれません.この方法の視覚的なデモンストレーションでは、重要な各ステップの重要な詳細と、それらを適切に実行する方法を描きます。まず、大腸菌MG1655 HU-PAmCherryの単一コロニーでMOPS EZリッチデファディアルミディアムの5ミリリットルを接種し、一晩で毎分140回転で揺れで摂氏37度で成長します。翌朝、サンプル100マイクロリットルを抽出し、900マイクロリットルの培地で希釈し、600ナノメートルで光学密度を測定します。次いで、0.01のOD600ナノメートルに新鮮な培地を含む試験管で培養を希釈する。光学密度が0.2に達するまで140 RPMで振盪して37°Cで接種試験管をインキュベートし、豊富な媒体で完全指数相に対応します。次いで、タイムラプス顕微鏡イメージング用の培養サンプルをアリコートし、希釈およびめっきアッセイ、フローサイトメトリー解析、および顕微鏡観察スナップショットイメージングを行う。試験管内の残りの4.4ミリリットルの細胞培養を特定のストレス処理にさらします。例えば、セファレキシンの4.4マイクロリットルは1ミリリットル当たり5マイクログラムで、140RPMで振ると摂氏37度でインキュベートする。新鮮な培地で培養サンプル200マイクロリットルの10倍の連続希釈物(マイナス7分の1まで)を調製します。非常に穏やかな渦または管を反転させることによって、各希釈間の混合。選択されていないLBアガロースプレート上の適切な希釈液のプレート100マイクロリットルを、摂氏37度で一晩インキュベートする。翌日、コロニー数を数えて、各培養サンプル中の生存細胞の濃度を決定する。未処理および処理された細胞培養のための時間の関数として、ミリリットル当たりのCFUをプロットします。分光光度計で培養液のOD600を測定します。培養サンプルを新鮮な培地を摂氏4度で希釈し、OD600の0.06で、マイクロリットル当たり約15,000細胞に相当するサンプルを得る。DNA染色の場合は、希釈した細菌サンプルを1~1の体積配給でDNA蛍光色素1ミリリットル溶液あたり10マイクログラム混合し、暗闇の中で15分間インキュベートします。サンプルを注入する前に、非常に穏やかな渦または管を反転させることによってサンプルを混ぜます。1分間に約120,000細胞の流量で、フローサイトメーターにサンプルを渡します。適切な設定で、前方散乱光や横散乱光、DNA蛍光色素/蛍光シグナルを取得します。前方散乱細胞密度ヒストグラムをプロットして細胞サイズの分布を表し、DNA蛍光色素/蛍光シグナル細胞密度ヒストグラムをプロットして、細胞集団中のDNA含有量を表します。まず、温度を安定させるために37°Cで熱式顕微鏡室を予熱します。原稿に記載されているようにアガロースに取り付けられたスライドを準備します。顕微鏡のステージにスライドを置き、mCherryの場合は560ナノメートルで顔コントラストの目的と光源励起を有する透過光を使用して画像取得を行います。画像解析中に細胞を自動検出するために、分離されたセルを含む視野を選択します。セルの母集団を確実に統計的に分析できるように、少なくとも 300 個のセルが画像化されていることを確認してください。まず、マイクロ流体プレートから保存液を取り出し、マイクロ流体ソフトウェアユーザーガイドに記載されているように、37°Cに予熱された新鮮な媒体に交換します。マイクロ流体プレートをマニホールドシステムに取り付けます。マイクロ流体ソフトウェアで、シールボタンをクリックして、プレートをマニホールドシステムにシールします。その後、プライミングボタンをクリックします。マイクロ流体プレートをマニホールドシステムと共に顕微鏡ステージに配置し、マイクロ流体室の拡張を避けるために摂氏37度で2時間予熱します。「シールオフ」ボタンをクリックして、マイクロ流体システムのマイクロ流体プレートをシールします。ウェル8から培地を150マイクロリットルの培養サンプルに交換し、ストレス誘発試薬の有無にかかわらず、ウェル1から5までの培地を所望の培地に交換します。マイクロ流体プレートを密封し、顕微鏡ステージに置きます。マイクロ流体ソフトウェアで、セルのロード手順を実行します。透過光で顕微鏡の下を見て、細胞の負荷が十分であることを確認してください。透過光モードに注意深く焦点を当て、単離された細菌を示し、過密ではないいくつかの視野を選択し、100平方マイクロリットルあたり約10〜20細胞。マイクロ流体ソフトウェアでは、[カスタムシーケンスを実行]ボタンをクリックし、2つのPSIで10分間にストレス誘発媒体の注入をプログラムし、続いてストレス治療の必要期間に1つのPSIで注入します。10分ごとに1フレームのタイムラプスモードで顕微鏡イメージングを行い、必要に応じて透過光の位相コントラストとmCherry信号用の560ナノメートル励起光源を使用します。顕微鏡画像取得とマイクロ流体注入プロトコルを同時に開始します。フィジーのソフトウェアとMicrobeJプラグインを開きます。スナップショット解析では、1つの顕微鏡スライドに対応するすべての画像をMicrobeJのローディングバーにドロップして画像を連結し、取得した画像スタックファイルを保存します。タイムラプスデータの場合は、画像スタックをMicrobeJのローディングバーにドロップするだけです。位相コントラスト画像のセグメンテーションに基づいて細胞の輪郭の自動検出を実行し、染色されたDNA蛍光シグナルのセグメンテーションに基づいて核oidの検出を実行します。細胞検出の精度を視覚的に確認し、必要に応じてMicrobeJ編集ツールを使用して補正を行います。取得した結果ファイルを保存します。[ResultJ] アイコンをクリックして解析を完了し、[ResultJ] ウィンドウを表示します。出力グラフの種類はさまざまです。細胞の形状または長さの正規化されたヒストグラムをプロットし、セルあたりの有核数を示します。この研究では、細胞分裂を特異的に阻害する抗生物質であるセファキシンへの一過性暴露時の大腸菌K-12細胞の挙動を分析した。セファキシンの存在下で増殖する細胞培養物は、無ストレス培養物と同様のOD600増加を示した。セファレクシンが存在すると生存細胞の濃度は増加しなかった。細胞はセファレックスを除去すると再び分裂を開始し、最終的には2時間後に無ストレス培養物と同等の濃度に達した。異なる応力は、誘導された効果に応じて、1ミリリットル曲線当たりのODおよびCFUの異なる結合解除をもたらした。セファレクシンへの暴露は、細胞サイズおよびDNA含有量の並行増加を引き起こした。セファレクシンを除去すると、集団細胞サイズとDNA含有量は徐々に減少し、2時間後にストレスを受けていない集団と類似した状態になった。セファレクシンは、正常な細胞幅を有する長い細胞の形成を引き起こし、その後、分裂セプタはなかった。定量的画像解析により、細胞サイズおよびDNA含有量の増加が確認された。タイムラプス画像は、細胞伸長および染色体複製および分離がセファレシンへの暴露によって阻害されないことを確認する。フィラメント細胞系統の分析は、薬物を洗い流した後、細胞分裂が約20分後に再開したことを示した。ストレス治療を誘発する前に、細菌集団が完全な指数関数的成長を遂げていることを確認することが重要です。これらのアプローチに使用されるストレス誘発治療は、遺伝子毒性化合物のような実験的な有害である可能性があります。だから慎重に化合物を扱い、手袋、マスク、ゴーグル、ラボコートを着用してください。

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Research

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