Name: マウスの寄生虫毒性を評価するリーシュマニアアマゾネンシスによるVivo感染 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: 学ぶマウスにおけるLeishmania amazonensisを用いた皮膚リーシュマニア症のin vivo感染法。宿主の炎症反応と寄生虫増殖を同時に評価し、病原性と治療戦略の理解を深める実験手法です。

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サンパウロ大学生物医学研究所動物センターのニールセン・サライヴァ・カマラ教授の皆様の支援、ガラス組織グラインダーの提供に対するシルビア・レニ・ウリアナ教授に感謝申し上げます。この研究はサンパウロ研究財団(FAPESP - MFLSの助成金2017/23933-3)によって支援されました。

すべての実験手順は、サンパウロ大学生物科学研究所の動物ケアと使用委員会によって承認され(CEUA 342/2019)、サンパウロ州の実験動物のケアと使用に関する勧告と方針に従って実施されました(Lei Estadual 11.977、 de 25/08/2005)とブラジル政府(レイ連邦11.794、de 08/10/2008)。セクション1-5に記載されているすべてのステップは、層流キャビネット内で無菌的に行われるべきである。リーシュマニアの生きた寄生虫を取り扱う際には、個人用保護具を利用する必要があります。
1. In Vitro Differentiation of L. amazonensis Promastigotes into Axenic Amastigotes15,20,35,36,37,38
注: L. アマゾネンシス(MHOM/BR/1973/M2269) (La) 寄生虫は、このアッセイで使用されました.研究目的に応じて、感染性寄生虫形態は、先に述べたように、密度勾配を用いてメタサイクリック形態の精製によって、または以下のプロトコルに従って、プロマチゴテスをアキセンチックなアマスティゴテに分化することによって得ることができる。
<ol><li>ラ・プロマスチゴは、プロマスティゴテ(プロ培地)用培地10mL(pH=7.0)を含む25cm2細胞培養フラスコで増殖する。</li>
	<li>25°Cで3日間インキュベートする。 注:寄生虫39、40、41、42、43、44の病原性および異常変化の損失を避けるために、10倍未満のvitroで通過したプロマスティゴテ培養物を使用してください。</li>
	<li>ピペット5mLの対数成長相の前駆植物培養を新しい25cm2フラスコに入れた。</li>
	<li>アキセンチックなアマスティゴテス(アマ培地)用の培地5mL(pH=5.2)を加える。</li>
	<li>34°Cで3~4日間インキュベートします。</li>
	<li>1:3の割合でアマ培地で希釈して新しい25cm2フラスコに分けます。</li>
	<li>34°Cで3~5日間インキュベートします。 注:それは成熟の終わりを表すとして、最大5日間、アキセンチックなアマスティゴテをインキュベート37.</li>
</ol>2. C57BL/6 L.アマゾネンシスによるフットパッド感染
注:サンパウロ大学生物医学研究所動物センターで、雌のC57BL/6マウス(生後6~8週)を入手し、維持した。動物は食べ物と水アドリビタムを受け取りました。
<ol><li>PBSで希釈した寄生虫懸濁液のアリコートをノイバウアーチャンバー(すなわち、ヘモサイトメーター)に移すことによって、アキセキニック系アマスティゴテの培養を数える。アマスティゴテスの形態を表す非フラグラ状寄生虫を数える。 注:または、トリパンブルー(1:1)は、実行可能なアマスティゴテ(すなわち、トリパンブルーで染色されていないもの)の数をカウントするために使用することができます。</li>
	<li>望ましい接種量および意図した接種数に応じてPBS中のアキセキセン系アマスチゴテスを希釈する(PBSの50μLで1 x106アキセン系アマスティゴトが推奨される)。</li>
	<li>調製した寄生虫懸濁液で27G針で結核注射器をロードします。</li>
	<li>ジョンズ・ホプキンス大学アニマルケアと使用委員会45が推奨する3-5%イソファフルランを使用してC57BL/6マウスを麻酔する。つま先のピンチに対するマウスの反応をテストして、麻酔の深さを評価します。</li>
	<li>左後足パッドの下足板組織に均質化された寄生虫懸濁液(1 x106アキセンチックなアマスティゴテまたは所望の接種量)の50μLを接種し、予め装填されたツベルクリンシリンジ(ステップ2.3)を用いた。</li>
</ol>3. マウスフットパッドの病変開発
<ol><li>キャリパーを使用して左(感染)および右(非感染)フットパッドの厚さを測定することによって、週に1回の病変の進行を測定します。</li>
	<li>病変の進行を評価するために、左と右の後ろ足パッドの厚さの差を毎週計算します。</li>
	<li>X軸上のY軸と感染時間に計算された差をプロットし、統計的有意性を計算します。 注:動物のケアと使用委員会の勧告に従って、皮膚潰瘍は二次感染につながる可能性があるため、感染病変が潰瘍になる前に動物を犠牲にする必要があります。補助図1に示すように、このプロトコルで使用される寄生虫用量(106アキセンチック・アマスティゴテ)および宿主株(C57BL/6)で潰瘍化の徴候が示されるまでに約10週間かかる。マウスは、潰瘍の徴候が観察される前に病変抽出のために屠殺されるべきである。</li>
</ol>4. マウスフットパッド病変抽出と寄生虫制限希釈
<ol><li>すべての井戸に180 μLのプロミディアムを加えて、制限希釈アッセイ46、47用の96ウェルプレート(平底)を準備します。 注:四重アッセイ(すなわち、動物1 = レーンA-D;動物2 = レーンE-H)を表す、各動物に対して4つのプレートレーン(プレートの半分)を使用します。</li>
	<li>病変あたりガラス組織グラインダーチューブに1mLのプロミディアムを加え、チューブの重量を量る。 注:チューブは無菌状態に保たれる必要がありますので、薄層流キャビネットの外側で重量を量る場合は、滅菌蓋を使用し、閉じた蓋でチューブを計量してください。</li>
	<li>動物のケアと使用委員会の勧告に従って、CO2室で動物を犠牲にします。70%エタノールを噴霧して動物を消毒する。</li>
	<li>感染したフットパッドを抽出し、消毒のためにフットパッドに70%のエタノールをスプレーするために、それかかとで動物の足を切除します。70%エタノールに浸し続けることで、はさみや鉗子の滅菌を確保します。</li>
	<li>感染したフットパッドを無菌のペトリ皿に入れ、無菌鉗子とメスを使ってすべての軟部組織を採取します。骨を捨てる。 注:偏った組織回復を避けるために、解剖ステップの均一性が推奨されます。</li>
	<li>収集した組織をプロ培地でガラス組織グラインダーチューブに移し、その後、チューブを再度計量して病変重量を決定する。 注:小さな体積が取り除かれ、組織重量が過小評価されるため、鉗子とメスを直接媒体に入れないようにしてください。病変の重量は、プロ培地のみを含むチューブの重量から、収集された組織を有するプロ培地を含むチューブの重量を差し引くことによって計算される。</li>
	<li>完全な組織破壊のために粉砕機を使用して組織10xを均質化する。</li>
	<li>混合物を10分間沈降させ、上清の20μLを集めます。</li>
	<li>ステップ4.1で調製した96ウェルプレートの1番目のレーンの1番目の列に上清の20μLをロードする。次の 3 つのレーンについて、動物ごとに 4 つ四つんたつものを持つ場合は、この手順を繰り返します (動物 1 の場合は、各ウェルに 20 μL を追加し、ラベル A1、B1、C1、および D1 を表します)。</li>
	<li>マルチチャンネルピペットを使用して、1番目の列10xの各ウェルを均質化します。次いで、希釈したサンプルを1番目のカラムから2番目のカラムに20μL転写する。 注: 各ウェルを 10 倍ずつ列ごとに均質化することが重要です。</li>
	<li>最後の列(12番目)まで残りのすべてのカラムに対してステップ4.10を繰り返し、希釈されたサンプルの最後の20 μLを廃棄します。 注: クロスコンタミネーションを避けるために、各希釈後にチップを変更します。</li>
	<li>フィルムでプレートを密封し、湿気の多いチャンバーで7日間25°Cでインキュベートします。</li>
</ol>5. 病変寄生虫負荷測定
<ol><li>反転顕微鏡を使用して7日間のインキュベーション後にプレートを分析し、各レーンの最後の寄生虫含有ウェルを決定します。 注:また、媒質の色変化や濁度の視覚的分析によって、寄生虫、または細胞密度の成長の指標を有することも可能である。</li>
	<li>病変重量当たりの希釈係数を割ることにより、各レーンの寄生虫組織負荷を計算する。 注: 特定のレーンでは、1 ~ 5 桁目にのみ寄生虫が存在する場合 (つまり、ウェル A1-A5 は寄生虫の成長に対してプラス)、列 5 には 1 つの寄生虫のみが含まれ、列 4 には 10 個の寄生虫が含まれ、その後は 10 の倍数になります。列1には10個の4個の寄生虫が含まれ、これは最初の20 μLの上清(ステップ4.7の非希釈サンプル)の寄生虫の数を表す。この20μLを180μLのプロ培地で希釈したため、初期管には5 x 105寄生虫((1 x 104)/(0.02mL)=5 x 105寄生虫/1mLが含まれていました。そして、その病変における寄生虫負荷は、寄生虫の初期濃度を病変重量で割ることによって算出することができる:(5 x105)/病変重量(ステップ4.6参照)。</li>
	<li>ログ Y スケールを持つ各動物の四重化結果の平均をプロットします。</li>
</ol>6. 統計分析
<ol><li>反復として実験群ごとに少なくとも5匹の動物を用いて平均±標準偏差としてデータを表す。</li>
	<li>p値 < 0.05 を有意と見なして、対になっていない両側検定を使用して統計分析を実行します。</li>
</ol>

著者らは、彼らが競合する財政的利益を持っていないと宣言します。

このプロトコルで説明されているin vivo感染アッセイは、全身的なシナリオにおける宿主寄生虫相互作用を考慮して、すべての研究者が生体内での皮状リーシュマニア症を評価することを可能にする。これらのアッセイは、多くのグループ22、24、27、29、31、32、34、49で使用されており、ここではいくつかのグループが持つかもしれないインフラストラクチャの制限を考慮しながら、この方法を標準化するためのステップバイステップのプロトコルをまとめました。このプロトコルはまた、生体内バイオイメージング50、51、...

リーシュマニア症は、発展途上国で重要な課題を表す世界的に流行している寄生虫感染症であり、世界保健機関1、2によって最も重要な放置熱帯病の一つとして認識されています。リーシュマニア症は、皮、粘膜、および/または内臓症状によって特徴付けられる。通常、L. アマゾネンシスによって引き起こされます, L. メキシカーナ, L. ブラジル人, L. ガイアナシス, L. メジャー, L. 熱帯と L. aethiopica3.この疾患の形態は、保護細胞性免疫応答の誘導によるヒトにおける自己治癒性が高い。しかし、細胞性免疫応答が失敗する可能性があり、病気は広がった皮状リーシュマニア症4、5に進行する可能性がある。リーシュマニア種とホスト遺伝的背景の間の多様性に利用可能なワクチンはありません6,7.現在入手可能な薬物のほとんどが高価で有毒であり、および/または長期治療8、9を必要とすることができるので、治療の選択肢も制限されている。その上、利用可能な治療10、11に対する薬剤耐性の報告があった。
リーシュマニア症の原因物質は原虫寄生虫リーシュマニアである。寄生虫は、そのライフサイクルに2つの異なる形態を提示する:プロマスティゴテ、サンドフライに見られる旗揚げ形態;そして、アマスティゴテは、哺乳動物宿主マクロファージ12、13の寄生性空胞に見られる細胞内形態である。脊椎動物宿主のマクロファージの防御機構にもかかわらず、アマスティゴテスの侵略、生存、複製する能力は、多くの研究の対象となる14、15、16、17。その結果、いくつかの研究グループが、特定の環境要因の影響を評価するためにインビトロマクロファージ感染アッセイを記述し、寄生虫および宿主遺伝子が寄生虫感染性に及ぼす影響を評価している。このアッセイは、高スループット形式に研究を適応させる能力、結果を得るための比較的短い期間、および犠牲にした実験動物の数を減少させる18のようないくつかの利点を提示する。しかし、インビトロアッセイの所見は、インビボ研究14、19、20、21を常に複製するとは限らない。インビボアッセイは、宿主寄生虫相互作用の全身的な生理学的概要を提供し、インビトロアッセイでは完全に模倣することができない。例えば、免疫学的研究は、回収されたフットパッド組織切片から、あるいは回収された免疫細胞22の分析のために球輝リンパ節からも免疫組織化学的アッセイを通して行うことができる。
動物は、多くの場合、疾患23の基礎的な生理学的メカニズムをよりよく理解するために、生物学的および生物医学的研究におけるヒト疾患のモデルとして使用される。リーシュマニア症の場合、接種の経路、部位、または用量が疾患の結果24、25、26、27に影響を与える。さらに、ヒトおよびマウスにおける感染に対する感受性および耐性は、宿主および寄生虫4の遺伝的背景によって高度に調節される4、5、22、28、29、30、31である。BALB/cマウスは、L.アマゾニスの皮感染に対して非常に感受性であり、寄生虫がリンパ節、脾臓、および肝臓32に広がることを伴う急速な疾患進行を示す。病気が皮の転移に進行する可能性があるため、感染は致命的になる可能性があります。対照的に、C57BL/6マウスは、L.アマゾネンシス感染アッセイ33において持続的な寄生虫負荷を有する慢性病変をしばしば発症する。それにより、この特定のマウス種に対するL.アマゾネンシス感染は、ヒトにおける慢性形態の皮状リーシュマニア症を研究する優れたモデルと考えられているが、それはBALB/cマウス感染モデル5、34よりも疾患進行を模倣するからである。
したがって、マウスインビボ感染は、ヒト疾患に適用可能なリーシュマニア病原性生理学的研究に有用な方法であり、宿主と寄生虫の相互作用の全身的な見解を可能にすることを提案する。確立されたアッセイ22を再検討し、我々はここに、亜感染性アマスタチゴテへの寄生虫分化、マウスフットパッドの細部発微、病変の発達、および寄生虫負荷測定を含むL.アマゾネンシスを有するC57BL/6マウスのインビボ感染のコンパイルされたステップバイステッププロトコルを提示する。このプロトコルは、他のマウス株および皮状リーシュマニアーゼを引き起こすリーシュマニア種に適応させることができる。結論として、ここで提示された方法は、新しい抗リーシュマニア薬物標的およびワクチンを同定する上で重要であり、また、リーシュマニア感染に対する宿主の免疫および代謝応答の生理学的研究において重要である。

<table><tbody><tr><td>96ウェルプレート</td><td>Greiner bio-ne</td><td>655180</td><td>希釈アッセイを制限するための平底プレート</td></tr><tr><td>アデニン</td><td>Sigma</td><td>A8626</td><td>M199細胞培養培地に添加したサプリメント</td></tr><tr>キャ<td>リパー</td><td>ミツトヨ</td><td>700-118-20</td> フットパッド細胞培養フラスコ<td>の厚さを測定するためのキャリパー</td></tr><tr><td></td><td>コーニング</td><td>353014</td><td>リーシュマニア寄生虫の遠心分離機を培養するための25cm2容量の細胞培養フラスコ</td></tr><tr><td></td><td>エッペンドルフ</td><td>5804R</td><td>密度に基づいてサンプルを分離するために使用される装置</td></tr><tr><td>CO2インキュベーター34 &deg;C</td><td>Thermo Scientific</td><td>3110</td><td>アマスチゴテス分化</td></tr><tr><td>エタノール</td>用インキュベーター <td>メルク</td><td>K50237083820</td><td>一般品用消毒剤</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Gibco</td><td>12657-029</td><td>M199細胞培養培地にサプリメントを追加</td></tr><tr><td>ガラス組織グラインダーチューブ</td><td>トーマスサイエンティフィック</td><td>3431 E04</td><td>感染したフットパッド組織</td></tr><tr><td>を採取して破壊するチューブグルコース</td><td>Synth</td><td>G1008.01.AH</td><td>サプリメントを M199 細胞培養培地に追加</td></tr><tr><td>GraphPad プリズム ソフトウェア</td><td>GraphPad</td><td></td><td>データをプロットし、統計的有意性を計算するために使用されるソフトウェア</td></tr><tr><td>ヘミン</td><td>Sigma</td><td>H-2250</td><td>サプリメントを M199 細胞培養培地に追加</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Promega</td><td>H5303</td><td>サプリメントを M199 細胞培養培</td></tr>地<tr><td>インキュベーターに追加 25&deg;C</td><td>Fanem</td><td>347CD</td><td>前胸茎培養用インキュベーター</td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>TMS</td><td>前胸動物および母乳牛培養物の視覚的分析に使用される機器</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td></td><td></td><td>マウス用吸入麻酔薬(3-5%)</td></tr><tr><td>層流キャビネット</td><td>Veco</td><td>VLFS-09</td><td>無菌作業領域に使用されるバイオセーフティキャビネット</td></tr><tr><td>M199細胞培地</td><td>Gibco</td><td>31100-035</td><td>リーシュマニア培養用細胞培養培地</td></tr><tr><td>微量遠心チューブ</td><td>Axygen</td><td>MCT150C</td><td>サンプルの収集、処理、保存に使用するマイクロチューブ</td></tr><tr><td>マルチチャンネルピペット</td><td>Labsystems</td><td>F61978</td><td>希釈アッセイを制限するために使用するマルチチャンネルピペット</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck</td><td>6329</td><td>M199細胞培養培地</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>シグマ</td><td>S8045</td>に追加された<td>サプリメント M199細胞培養培地に追加されたサプリメント</td></tr><tr><td>ノイバウアーチャンバーHBG</td><td></td><td>2266</td><td>寄生虫懸濁液をカウントする血球計算盤</td></tr><tr>光学<td>顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>E200</td><td>寄生虫パラフィルムをカウントするために使用される光学機器</td></tr><tr><td></td><td>Bemis</td><td>349</td><td>シールする柔軟で耐性のあるプラスチックプレート</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>ギブコ</td><td>15140122</td><td>M199細胞培養培地にサプリメントを追加</td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>フットパッド組織を解剖するための無菌皿</td></tr><tr><td>ピペットマンキット</td><td>ギルソン</td><td>F167360</td><td>ピペッター(P2、P20、P200、P1000)が4個入ったマイクロピペットキット</td></tr> <tr>は<td>かり</td><td>キミス</td><td>BG2000</td><td>回収したフットパッドの計量に使用した機器病変用</td></tr><tr><td>メス</td><td>Solidor</td><td>10237580026</td><td>フットパッド組織を切断して採取するためのメス</td></tr><tr><td>血清学的ピペット 10mL</td><td>ネスト</td><td>327001</td><td>ミリリットル容量の転送に使用される滅菌ピペット</td></tr><tr><td>チップ</td><td>Axygen</td><td></td><td>マイクロリットル容量の転送に使用されるピペットチップ</td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>生存可能な寄生虫をカウントするために使用される染料</td></tr><tr><td>トリプチカーゼペプトン</td><td>メルク</td><td></td><td>サプリメントは、M199細胞培養培地</td></tr><tr><td>ツベルクリンシリン</td>ジ<td>BD</td><td>に追加</td>されました BD 305945 <td>寄生虫懸濁液を接種するための27G針付きシリンジ</td></tr></tbody></table>

マウスの寄生虫毒性を評価するリーシュマニアアマゾネンシスによるvivo感染

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

リーシュマニア属は、リーシュマニアーゼを引き起こす原虫の寄生虫であり、皮疹から内臓病変まで幅広い臨床症状を示す疾患である。現在、世界中で1,200万人がリーシュマニアに感染していると推定されており、10億人以上が感染の危険にさらされています。リーシュマニアアマゾネンシスは中南米で流行しており、通常は動物モデルで直接視覚化できる病気の皮形成につながる。したがって、L.アマゾネンシス株は、インビトロでも容易に栽培されるため、皮状リーシュマニア症研究に適したモデルです。C57BL/6マウスは、ヒトで観察されるL.アマゾネンシス主導の疾患進行を模倣し、皮状リーシュマニア症のモデルに最適なマウス株の1つと考えられている。脊椎動物宿では、これらの寄生虫は、これらの細胞の防御機構にもかかわらずマクロファージに生息する。いくつかの研究は、異なる条件下で寄生虫の感染性を評価するために、インビトロマクロファージ感染アッセイを使用しています。しかし、インビトロアプローチは、生物の応答を無視する単離された細胞系に限定される。ここでは、宿主寄生虫相互作用の全身生理学的概要を提供するインビボマウス感染法をまとめます。L.アマゾネンシスを有するC57BL/6マウスのインビボ感染に関する詳細なプロトコルは、感染性アマスティゴテ、マウスフットパッドの皮状接種、病変発生、および寄生虫負荷測定への寄生虫分化を含む。この確立された方法は、皮状リーシュマニア症に対する宿主免疫および代謝反応の生理学的研究のための最も適切な方法として提案する。

リーシュマニア原虫寄生虫は、無脊椎動物および脊椎動物の宿主におけるライフサイクルの間に2つの発達形態に存在する:プロマチゴテ、雌のサンドフライの内腔に見られる増殖形態;そして、哺乳動物宿主細胞の寄生性空胞に見られる増殖性形態を有する。プロマスチゴは幅約1.5μm、長さ20μmの細長い体を有し、典型的には前肢から出てくるフラグエルムを有する。アマスティゴは、長さが2~6μm、幅が1.5~3μmの範囲の丸みまたは欠型体を有し、見かけにくいフラグラム12、13(図1A)を有する。血液中に無脊椎動物の宿主、家族サイコジダエの血液型昆虫は、リーシュマニアのアマスティゴテスに感染したマクロファージを獲得する。これらの細胞がサンドフライ消化管に到達すると、アマスティゴテが放出され、プロサイクリックプロマスチゴテに分化されます(<strong ...

ここでは、レーシュマニア・アマゾネンシスを用いたマウスの皮状感染を評価するためのコンパイル済みプロトコルを提示する。これは、寄生虫の病原性を研究するための信頼性の高い方法であり、感染に対する脊椎動物宿主応答の全身的な見解を可能にする。

マウスの寄生虫毒性を評価するリーシュマニアアマゾネンシスによるVivo感染

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to ...

このプロトコルは、皮状感染症に脊椎動物宿主の全身的な見解を提供するので、リーシュマニア病原性を研究するのに適している。このプロトコルを採用する主な利点は、研究者が同時に宿主の炎症反応と寄生虫複製を評価することができるということです。この方法は、毒性に関連するいくつかの標的および治療を特徴付けるために使用することができ、それは皮リーシュマニア症の制御に新しい洞察をもたらす可能性がある。また、他のマウス株や皮リーシュマニア症を引き起こすリーシュマニア種にも適用できます。このアッセイには、マウスの作業に慣れ、感染性物質への偶発的な暴露を避けるために板下注射を行った経験がある訓練を受けた人員を必要とするなど、いくつかの重要なステップがあります。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の技術者であるリカルド・ザンピエリ博士です。25センチメートル平方細胞培養フラスコでL.アマゾネンシスのプロマスティゴトを成長させることから始め、10ミリリットルのプロミディアムを含み、摂氏25度で3日間栽培します。インキュベーション後、ピペット5ミリリットルの対数成長相プロマスティゴテ培養を新しいフラスコに培養する。フラスコにアマ培地を5ミリリットル加え、3~4日間摂氏34度でインキュベートします。新しいフラスコに新鮮なアマ培地で1〜3の比率で希釈することによって培養を分割します。その後、さらに3〜5日間インキュベートします。PBSで希釈したアキセン酸アマスチゴス懸濁液のアリコートをノイバウアーチャンバーに移し、非フラグを立て寄生虫を数える。次いで、所望の接種量および意図される接種数に応じてPBS中の懸濁液を希釈する。準備された寄生虫の懸濁液と27ゲージ針で結核注射器をロードします。マウスがつま先ピンチで完全に麻酔され、サスペンションの50マイクロリットルを左後ろ足パッドの板前組織に接種することを確認します。週に1回の病変の進行を記録し、キャリパーを用いて感染したフットパッドと非感染フットパッドの厚さを測定し、2つのフットパッド間の厚さの差を計算して病変進行を評価する。1回の病変にガラス組織グラインダーチューブにプロミドを1ミリリットル加え、チューブの重量を量る。感染したフットパッドを抽出するために、フットパッドに70%エタノールをスプレーし、そのかかとで動物の足を切除します。はさみと鉗子を70%エタノールに浸して、殺菌することを確認して下さいます。無菌ペトリ皿にフットパッドを置き、鉗子とメスでそれを解剖します。すべての軟部組織を収集し、骨を捨てます。採取した組織をガラス組織グラインダーチューブに移し、チューブを再び秤量して病変重量を決定します。完全な組織破壊のためにグラインダーで組織を10回均質化し、混合物を解決させます。上清の20マイクロリットルを収集し、原稿の指示に従って調製

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

ライブホストのトランスジェニックリーシュマニア原虫のin vivoイメージング

の皮内注射による皮膚リーシュマニア症の実験的ハムスターモデルの最適化...

ハムスターの背部皮膚における皮膚リーシュマニア症：Antileishmanial薬剤のスクリーニングのための有用なモデル

このビデオでは、マクロファージをメタサイクリックプロマスタチゴートで処理し、その結果、細胞内アマスタステートを形成することで、リーシュマニアの病原性を調査しています。リーシュマニアの病原性の確認は、核酸蛍光色素染色によって達成されます。この知見は、リーシュマニア症の新たな治療法の開発に貢献することができます。...

培養マクロファージにおけるリーシュマニア病原性の評価

このビデオは、骨髄由来マクロファージ(BMM)の寄生虫の細胞内増殖を定量化するアッセイを示しています。マクロファージ細胞は、リーシュマニアの運動性侵襲期と非運動性の浸潤期にそれぞれ感染し、メタサイクリック前胸茎と無形成性に浸潤します。寄生虫はマクロファージに侵入し、寄生虫の液胞に内在化され、内部で増殖します。細胞内寄生虫の増殖は、マクロファージと寄生虫核を蛍光染色した上で顕微鏡を用いて定量化されます。...

マクロファージにおける寄生虫の細胞内増殖を定量化するためのIn vitroアッセイ

この記事では、画像取得と分析のための特定の方法論と組み合わせて、生体内顕微鏡イメージングを使用して、マウスの肝臓血管系の個々の血管内の血流速度の動的測定と定量化の詳細な方法について報告します。...

以下の肝臓の生体顕微鏡イメージング<em&gt;リーシュマニア</em&gt;感染症：肝血行動態の評価

すべての病原性リーシュ マニア原虫種に存在し、脊椎動物のホストのマクロファージ内で複製。ここでは、リーシュ マニア、続いて細胞増殖動態の正確な定量培養マウス骨髄由来マクロファージに感染するプロトコルを提案する.このメソッドは、リーシュ マニアの病原性と宿主-病原体相互作用に影響を与える個々...

細胞内マクロファージの内部成長の定量化は高速とリーシュ マニア原虫の病原性を評価するための信頼性の高い方法です。

ここでは、腹腔内(IP)または歯肉内(IG)を介して L.infantum-Lucに感染したゴールデンハムスターの縦断的評価を、生物発光イメージングとPCRによって紹介します。ハムスターは、感染の1日後(1 dpi)、感染の1週間後(8 dpi)、および感染の3週間後(22 dpi)に評価され、50dpi...

インビボ ルシフェラーゼを発現するAxenic Amastigotesの歯肉接種による Leishmania乳児感染ハムスターのイメージング

Strongyloides ratti は、実験用マウスに一過性感染症を引き起こす寄生性線虫であり、組織移動および腸の生活段階を示します。ここでは、ラットの寄生虫サイクルの維持とマウスの実験的感染のためのプロトコルを紹介します。これには、頭部、肺、腸での寄生虫の定量化が含まれます。...

寄生性線虫Strongyloides rattiによるマウスの実験的感染

現在の診断抗菌薬感受性試験では、栄養豊富な、好気的条件下での分離株のプランクトンの成長に依存しています。ここでは、嚢胞性線維症の肺のより代表的な好気性および微好気性条件の両方の下で緑膿菌バイオフィルムの抗菌薬感受性を検討する別の人工痰媒体を採用しています。...

に対する抗生物質の有効性をテストするための人工痰培地の使用<em&gt;緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）</em&gt;肺嚢胞性線維症へのより適切な条件で

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細胞内の抗リーシュマニアに対するスクリーニングのための寄生虫のRescue and形質転換試験<em&gt;ドノバンリーシュマニア</emTHP1ヒト急性単球性白血病細胞株における&gt;無鞭毛

学ぶマウスにおけるLeishmania amazonensisを用いた皮膚リーシュマニア症のin vivo感染法。宿主の炎症反応と寄生虫増殖を同時に評価し、病原性と治療戦略の理解を深める実験手法です。

マウスの寄生虫毒性を評価するリーシュマニアアマゾネンシスによるVivo感染

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